一、引言1.1研究背景1.1.1結直腸癌的現狀與危害結直腸癌（ColorectalCancer,CRC）作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的重大疾病之一，其發病率和死亡率一直居高不下。根據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的GLOBOCAN2020數據顯示，結直腸癌在全球癌癥發病譜中位居第三，新發病例數達193萬例，在癌癥死亡譜中位居第二，死亡病例數達93.5萬例。在我國，隨著經濟的快速發展和居民生活方式的西方化，結直腸癌的發病率和死亡率也呈現出顯著上升的趨勢。2020年，我國結直腸癌新發病例數約為55.5萬，死亡病例數約為28.6萬，分別占全球結直腸癌新發病例數和死亡病例數的28.73%和30.59%。結直腸癌的發生是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及遺傳因素、環境因素、生活方式以及腸道微生物群等多個方面。遺傳因素在結直腸癌的發病中起著重要作用，約5%-10%的結直腸癌病例與遺傳綜合征相關，如家族性腺瘤性息肉?。‵AP）、遺傳性非息肉病性結直腸癌（HNPCC）等。環境因素包括飲食、吸煙、飲酒、肥胖等，長期高脂、高蛋白、低纖維飲食，以及過量攝入紅肉和加工肉類，都被認為是結直腸癌的重要危險因素。此外，吸煙和飲酒也與結直腸癌的發病風險增加密切相關。腸道微生物群在維持腸道穩態和免疫調節中發揮著關鍵作用，腸道微生物群的失調與結直腸癌的發生發展密切相關，可能通過影響腸道屏障功能、免疫反應以及代謝產物的產生等途徑促進結直腸癌的發生。結直腸癌的高發病率和死亡率給患者及其家庭帶來了沉重的經濟和心理負擔，同時也對社會醫療資源造成了巨大的壓力。早期結直腸癌患者通常沒有明顯的癥狀，隨著病情的進展，患者可能會出現便血、腹痛、腹瀉、便秘、腸梗阻等癥狀，但此時往往已經處于疾病的中晚期，治療效果和預后較差。因此，深入了解結直腸癌的發病機制，尋找有效的早期診斷標志物和治療靶點，對于提高結直腸癌的防治水平具有重要的現實意義。1.1.2AOM/DSS小鼠模型的應用價值在結直腸癌的研究中，動物模型是不可或缺的工具，它能夠幫助我們深入了解疾病的發生發展機制，評估藥物的療效和安全性，為臨床治療提供重要的理論依據和實驗基礎。AOM/DSS小鼠模型作為一種常用的化學誘導性結直腸癌動物模型，具有獨特的優勢和重要的應用價值。AOM/DSS小鼠模型的構建方法相對簡單，重復性好。該模型通常是通過腹腔注射氧化偶氮甲烷（AOM），然后給予葡聚糖硫酸鈉（DSS）飲水，誘導小鼠發生結腸炎相關的結直腸癌。AOM是一種致癌劑，能夠引起結腸上皮細胞的DNA損傷和基因突變，而DSS則是一種腸道炎癥誘導劑，能夠破壞腸道黏膜屏障，引發腸道炎癥反應，兩者協同作用，能夠穩定、快速地誘導小鼠結直腸癌的發生，一般在6-12周內即可觀察到明顯的腫瘤形成。AOM/DSS小鼠模型能夠較好地模擬人類結直腸癌的發病過程，尤其是結腸炎相關的結直腸癌。在人類中，炎癥性腸?。ㄈ鐫冃越Y腸炎和克羅恩?。┦墙Y直腸癌的重要危險因素，長期的腸道炎癥會導致腸道黏膜上皮細胞的損傷和修復失衡，進而引發細胞的異常增殖和癌變。AOM/DSS小鼠模型通過誘導腸道炎癥，成功地模擬了這一病理過程，其腫瘤的發生部位、組織學特征以及分子生物學改變與人類結腸炎相關結直腸癌具有高度的相似性。AOM/DSS小鼠模型在結直腸癌的發病機制研究、藥物研發以及治療策略評估等方面都發揮著重要的作用。通過對該模型的研究，我們可以深入探討結直腸癌發生發展過程中的分子機制，如炎癥信號通路的激活、細胞增殖與凋亡的失衡、腫瘤微環境的改變等，為尋找新的治療靶點提供理論依據。在藥物研發方面，AOM/DSS小鼠模型可以用于評估各種抗癌藥物的療效和安全性，篩選出具有潛在臨床應用價值的藥物。此外，該模型還可以用于評估新型治療策略的有效性，如免疫治療、基因治療等，為結直腸癌的臨床治療提供新的思路和方法。1.1.3多組學技術在癌癥研究中的意義隨著生命科學研究的不斷深入，傳統的單一組學研究方法已經難以滿足對癌癥復雜生物學機制的全面理解。多組學技術的出現和發展，為癌癥研究提供了全新的視角和方法，通過整合基因組、轉錄組、蛋白質組、代謝組等多個層面的信息，能夠更加全面、系統地揭示癌癥的發病機制，為癌癥的早期診斷、精準治療和預后評估提供有力的支持。基因組學是研究生物體基因組結構和功能的學科，通過對癌癥基因組的測序和分析，可以發現癌癥相關的基因突變、染色體異常和基因拷貝數變異等遺傳改變，這些遺傳改變是癌癥發生發展的重要基礎。轉錄組學則是研究細胞或組織中所有RNA轉錄本的學科，通過RNA測序（RNA-seq）技術，可以全面了解癌癥細胞中基因的表達水平和轉錄本的多樣性，揭示基因表達調控網絡的變化，為理解癌癥的發生發展機制提供重要線索。蛋白質組學是研究生物體蛋白質組成、結構和功能的學科，通過質譜技術等手段，可以對癌癥細胞中的蛋白質進行大規模的鑒定和定量分析，了解蛋白質的表達變化、修飾狀態以及蛋白質-蛋白質相互作用等信息，這些信息對于揭示癌癥的生物學功能和信號通路具有重要意義。代謝組學是研究生物體代謝產物的學科，通過核磁共振（NMR）、質譜（MS）等技術，可以對癌癥細胞中的代謝產物進行全面的分析，了解代謝途徑的改變和代謝物的變化，這些變化與癌癥的發生發展、能量代謝和腫瘤微環境密切相關。多組學技術的整合分析能夠實現對癌癥的全方位、多層次的研究，彌補單一組學研究的局限性。通過整合基因組學和轉錄組學數據，可以深入了解基因突變對基因表達的影響，揭示基因調控網絡的異常變化；整合轉錄組學和蛋白質組學數據，可以驗證基因表達的變化是否在蛋白質水平上得到體現，進一步明確蛋白質的功能和作用機制；整合蛋白質組學和代謝組學數據，可以了解蛋白質對代謝途徑的調控作用，以及代謝產物對細胞生理功能的影響。此外，多組學技術還可以與臨床數據相結合，建立癌癥的分子分型和預后模型，為癌癥的精準治療提供依據。在結直腸癌的研究中，多組學技術已經取得了一系列重要的研究成果。通過多組學分析，發現了結直腸癌中許多關鍵的致癌基因和抑癌基因，如APC、KRAS、TP53等，揭示了這些基因在結直腸癌發生發展中的作用機制。同時，還發現了結直腸癌中許多異常的信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路、PI3K/AKT信號通路等，這些信號通路的異常激活或抑制與結直腸癌的發生發展密切相關。此外，多組學技術還為結直腸癌的早期診斷和預后評估提供了新的生物標志物，如循環腫瘤DNA（ctDNA）、微小RNA（miRNA）、蛋白質標志物等，這些生物標志物具有較高的靈敏度和特異性，有望用于結直腸癌的早期篩查和預后判斷。1.2研究目的與意義本研究旨在通過AOM/DSS小鼠模型，運用多組學技術，全面深入地探究結直腸癌的發病機制，尋找潛在的治療靶點和生物標志物，為結直腸癌的防治提供新的理論依據和研究思路。具體而言，研究目的包括以下幾個方面：利用AOM/DSS小鼠模型，模擬人類結腸炎相關結直腸癌的發病過程，收集不同發病階段的小鼠結腸組織樣本，為后續的多組學分析提供高質量的實驗材料。運用基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等多組學技術，對小鼠結腸組織樣本進行全面分析，獲取基因、轉錄本、蛋白質和代謝物等多個層面的信息，揭示結直腸癌發生發展過程中的分子變化規律。通過整合多組學數據，構建結直腸癌的分子調控網絡，深入解析基因、蛋白質和代謝物之間的相互作用關系，挖掘在結直腸癌發生發展中起關鍵作用的信號通路和分子靶點?；诙嘟M學分析結果，篩選出與結直腸癌發生發展密切相關的潛在生物標志物和治療靶點，并通過細胞實驗和動物實驗進行驗證，為結直腸癌的早期診斷和精準治療提供理論支持。本研究具有重要的科學意義和臨床應用價值。在科學意義方面，結直腸癌的發病機制極為復雜，涉及多個基因、信號通路以及環境因素的相互作用。傳統的研究方法往往局限于單一層次的分析，難以全面揭示結直腸癌的發病機制。本研究通過多組學技術的整合應用，能夠從多個維度對結直腸癌進行系統研究，為深入理解結直腸癌的發病機制提供全新的視角和思路，有助于填補該領域在分子機制研究方面的空白，推動結直腸癌基礎研究的發展。多組學技術的發展為生命科學研究帶來了革命性的變化，通過整合不同組學的數據，可以更全面地了解生物系統的復雜性。本研究在AOM/DSS小鼠模型中開展結直腸癌的多組學研究，有助于拓展多組學技術在腫瘤研究領域的應用，探索多組學數據整合分析的新方法和新技術，為其他復雜疾病的研究提供借鑒和參考。在臨床應用價值方面，結直腸癌的早期診斷對于提高患者的生存率和預后質量至關重要。目前，臨床上常用的結直腸癌診斷方法如結腸鏡檢查、糞便潛血試驗等存在一定的局限性，難以實現早期精準診斷。通過多組學研究，有望發現一些特異性高、靈敏度強的新型生物標志物，這些生物標志物可以用于結直腸癌的早期篩查和診斷，提高早期診斷率，為患者的早期治療爭取寶貴時間。精準治療是未來腫瘤治療的發展方向，其核心在于根據患者的個體差異制定個性化的治療方案。本研究通過挖掘結直腸癌的潛在治療靶點，為開發新的治療藥物和治療策略提供理論依據，有助于實現結直腸癌的精準治療，提高治療效果，減少不良反應，改善患者的生活質量。二、AOM/DSS小鼠模型構建與驗證2.1實驗材料與方法2.1.1實驗動物本研究選用C57BL/6小鼠，小鼠年齡為6-8周齡，體重18-22g，雌雄各半。C57BL/6小鼠是一種廣泛應用于生物醫學研究的近交系小鼠，具有遺傳背景清楚、個體差異小、對實驗處理反應一致性高等優點。在結直腸癌研究中，C57BL/6小鼠對AOM和DSS的敏感性較高，能夠穩定地誘導出結腸炎相關的結直腸癌，其腫瘤發生的病理過程和分子機制與人類結直腸癌具有較高的相似性。此外，該品系小鼠的免疫系統較為健全，有利于研究腫瘤與免疫系統之間的相互作用，為深入探討結直腸癌的發病機制和免疫治療提供了良好的動物模型基礎。實驗小鼠購自[供應商名稱]，在實驗動物中心的特定病原體（SPF）級環境中飼養，環境溫度控制在22±2℃，相對濕度為50%±10%，12小時光照/12小時黑暗的晝夜循環，小鼠可自由攝食和飲水。在實驗開始前，小鼠適應性飼養一周，以確保其適應實驗環境，減少環境因素對實驗結果的影響。2.1.2實驗試劑與儀器實驗試劑主要包括氧化偶氮甲烷（AOM，純度≥98%，[生產廠家]），其作為一種強致癌劑，能夠誘導結腸上皮細胞發生基因突變，是構建AOM/DSS小鼠模型的關鍵試劑；葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子量36000-50000，[生產廠家]），用于誘導小鼠腸道炎癥，與AOM協同作用促進結直腸癌的發生；其他試劑還包括麻醉劑戊巴比妥鈉（[生產廠家]），用于小鼠實驗操作時的麻醉；多聚甲醛（[生產廠家]），用于組織樣本的固定；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（[生產廠家]），用于組織切片的染色，以便進行病理學觀察；以及各種用于分子生物學實驗的試劑，如RNA提取試劑盒（[生產廠家]）、逆轉錄試劑盒（[生產廠家]）、PCR擴增試劑（[生產廠家]）等，用于后續的轉錄組學分析。實驗儀器主要有電子天平（[品牌及型號]），用于稱量AOM、DSS等試劑以及小鼠體重；低溫高速離心機（[品牌及型號]），用于細胞和組織樣本的離心分離；PCR儀（[品牌及型號]），用于基因擴增；熒光定量PCR儀（[品牌及型號]），用于基因表達水平的定量分析；石蠟切片機（[品牌及型號]），用于制作組織石蠟切片；顯微鏡（[品牌及型號]），用于觀察組織切片的病理形態；以及用于蛋白質組學和代謝組學分析的相關儀器，如液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS/MS，[品牌及型號]）等。2.1.3AOM/DSS小鼠模型構建過程AOM/DSS小鼠模型的構建過程參考了經典的實驗方法，并根據預實驗結果進行了適當的優化。具體操作步驟如下：在實驗的第1天，將小鼠稱重后，使用戊巴比妥鈉（50mg/kg）進行腹腔注射麻醉，待小鼠麻醉成功后，按照10mg/kg的劑量腹腔注射AOM溶液（用生理鹽水稀釋至合適濃度）。注射完成后，將小鼠放回飼養籠中，給予正常飲水和飼料，讓小鼠恢復一周。一周后，開始給予小鼠含有2%DSS（質量/體積）的飲用水，持續飲用7天。在DSS飲水期間，每天觀察小鼠的精神狀態、飲食情況、體重變化以及糞便性狀等，每兩天更換一次DSS飲水，并記錄小鼠的體重。7天DSS飲水結束后，更換為正常飲用水，讓小鼠恢復14天。此為一個循環，連續進行3個循環。在整個實驗過程中，密切觀察小鼠的健康狀況。若小鼠出現精神萎靡、活動減少、體重下降超過20%、便血、肛門直腸脫垂等嚴重癥狀，視為實驗終點，及時對小鼠進行安樂死，并采集相關組織樣本。實驗結束后，將小鼠禁食12小時，然后使用過量的戊巴比妥鈉進行腹腔注射，處死小鼠，迅速取出結腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和糞便，一部分結腸組織用于病理學分析，另一部分結腸組織迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于后續的多組學分析。2.2模型驗證指標與方法2.2.1小鼠生理狀態監測在AOM/DSS小鼠模型構建過程中，對小鼠的生理狀態進行密切監測是判斷模型是否成功的重要依據。體重變化是反映小鼠整體健康狀況和疾病進展的關鍵指標之一。在正常情況下，小鼠的體重會隨著生長逐漸增加，但在AOM/DSS處理后，由于腸道炎癥和腫瘤的發生，小鼠的食欲可能會受到影響，導致體重下降。研究表明，在AOM/DSS誘導的結直腸癌小鼠模型中，體重下降往往在DSS飲水期間最為明顯，隨著腫瘤的發展，體重下降的趨勢會持續加劇。因此，定期稱量小鼠體重，繪制體重變化曲線，能夠直觀地反映小鼠的健康狀況和疾病進展程度。若小鼠體重在實驗過程中持續下降，且下降幅度超過一定比例（如20%），則提示可能存在嚴重的腸道病變，這與結直腸癌的發生發展密切相關。便血情況也是判斷模型成功與否的重要指標。結直腸癌患者常出現便血癥狀，AOM/DSS小鼠模型在模擬結直腸癌發病過程中，也會出現類似的便血現象。便血的出現主要是由于腫瘤組織侵犯腸道血管，導致血管破裂出血，或者是腸道炎癥損傷腸道黏膜，引起黏膜下血管出血。在實驗中，通過肉眼觀察小鼠糞便的顏色和性狀，若發現糞便呈黑色或暗紅色，且帶有血液，即可初步判斷為便血。為了更準確地評估便血情況，可以采用便隱血試紙進行檢測。具體方法是用干凈的小木棍取少許小鼠糞便于試紙上，按照試紙說明書的要求進行操作，觀察試紙的顯色情況，根據顯色程度進行評分。便血的出現通常意味著腸道病變已經較為嚴重，可能進入了結直腸癌的中晚期階段，因此，便血情況的監測對于判斷模型的成功以及評估疾病的進展具有重要意義。腹瀉程度同樣是評估AOM/DSS小鼠模型的重要指標。在DSS飲水期間，小鼠腸道黏膜受到損傷，腸道屏障功能受損，導致腸道通透性增加，腸道內的水分和電解質無法正常吸收，從而引起腹瀉。腹瀉程度的評估可以通過觀察小鼠糞便的性狀進行，一般將糞便性狀分為正常、軟便、稀便和水樣便四個等級。正常糞便呈顆粒狀，軟便質地較軟，但仍能保持一定形狀，稀便則呈糊狀，水樣便則完全呈液體狀，無固定形狀。隨著腹瀉程度的加重，小鼠的營養吸收會受到嚴重影響，導致體重下降、精神萎靡等癥狀，這與結直腸癌患者在疾病進展過程中出現的營養不良和全身癥狀相似。因此，對小鼠腹瀉程度的監測能夠反映腸道炎癥的嚴重程度，進而判斷模型是否成功模擬了結直腸癌的發病過程。2.2.2病理組織學分析病理組織學分析是驗證AOM/DSS小鼠模型是否成功誘導結直腸癌的金標準，通過對小鼠結腸組織進行蘇木精-伊紅（H&E）染色和病理切片觀察，可以直觀地了解結腸組織的病理變化，判斷結直腸癌的發生發展階段。在進行H&E染色時，首先將采集的小鼠結腸組織用4%多聚甲醛固定24小時以上，以保持組織的形態結構。固定后的組織經過脫水、透明、浸蠟等處理，然后包埋在石蠟中，制成石蠟切片。切片厚度一般為4-6μm，將切片依次放入二甲苯中脫蠟，然后通過梯度酒精進行水化，使組織恢復到含水狀態。接著，將切片浸入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細胞核染成藍色，然后用流水沖洗，去除多余的蘇木精染液。再將切片浸入伊紅染液中染色1-3分鐘，使細胞質染成紅色。最后，將切片依次通過梯度酒精脫水、二甲苯透明，然后用中性樹膠封片，制成H&E染色切片。通過顯微鏡觀察H&E染色切片，可以觀察到正常結腸組織的結構清晰，黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜層次分明，上皮細胞排列整齊，隱窩結構完整。在AOM/DSS誘導的結直腸癌模型中，隨著疾病的進展，結腸組織會出現一系列病理變化。在炎癥階段，可見黏膜層和黏膜下層有大量炎癥細胞浸潤，主要包括淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等，上皮細胞出現水腫、壞死，隱窩結構破壞，部分隱窩消失，黏膜表面可見糜爛和潰瘍形成。隨著炎癥的持續發展，結腸上皮細胞開始出現異常增殖，形成腺瘤性息肉，此時在切片中可見黏膜層增厚，上皮細胞呈乳頭狀或腺管狀增生，細胞排列紊亂，極性消失，細胞核增大、深染，核仁明顯。當發展為腺癌時，可見腫瘤細胞突破基底膜，向黏膜下層、肌層和外膜浸潤，腫瘤細胞呈巢狀或條索狀排列，細胞異型性明顯，可見核分裂象增多，部分區域還可見腫瘤組織壞死和出血。根據這些病理特征，可以將結直腸癌的發生發展階段分為正常、炎癥、腺瘤和腺癌四個階段。通過對小鼠結腸組織病理切片的觀察，準確判斷結直腸癌的發生發展階段，從而驗證AOM/DSS小鼠模型是否成功構建，為后續的多組學研究提供可靠的實驗材料。2.2.3分子生物學驗證分子生物學驗證是從基因和蛋白質水平對AOM/DSS小鼠模型進行深入驗證，檢測相關基因的表達水平變化，能夠進一步明確模型的分子特征，揭示結直腸癌發生發展的分子機制。在結直腸癌的發生發展過程中，癌基因和抑癌基因的表達異常起著關鍵作用。常見的癌基因如KRAS、BRAF等，它們的激活突變會導致細胞增殖失控、分化異常，從而促進腫瘤的發生發展。抑癌基因如APC、TP53等，它們的失活突變則會失去對細胞增殖和凋亡的調控作用，使得細胞易于發生癌變。因此，檢測這些基因的表達水平變化是分子生物學驗證的重要內容。檢測基因表達水平變化的方法主要有聚合酶鏈式反應（PCR）和免疫組化等。PCR技術是一種體外擴增DNA的方法，通過設計特異性引物，能夠對目標基因進行擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳或熒光定量PCR等方法對擴增產物進行檢測，從而定量分析基因的表達水平。在本研究中，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測癌基因和抑癌基因的表達水平。首先提取小鼠結腸組織的總RNA，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，在qRT-PCR儀上進行擴增反應。反應體系中包含特異性引物、dNTPs、Taq酶、緩沖液等，反應條件根據不同的基因進行優化。通過檢測擴增過程中的熒光信號強度，實時監測PCR反應的進程，根據標準曲線計算出目標基因的相對表達量。免疫組化是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過標記抗體來檢測組織或細胞中特定蛋白質的表達水平和定位情況。在免疫組化實驗中，首先將小鼠結腸組織制成石蠟切片，然后進行脫蠟、水化處理。接著，通過抗原修復方法，使被固定的抗原重新暴露出來，以便與抗體結合。用封閉液封閉切片，以減少非特異性染色，然后加入特異性的一抗，孵育一段時間，使一抗與目標蛋白結合。洗去未結合的一抗后，加入標記有熒光素或酶的二抗，孵育一段時間，使二抗與一抗結合。最后，根據標記物的不同，采用相應的檢測方法進行檢測。如果二抗標記的是熒光素，可以通過熒光顯微鏡觀察熒光信號的強度和分布，從而判斷目標蛋白的表達水平和定位情況；如果二抗標記的是酶，可以通過加入底物，使酶催化底物顯色，通過顯微鏡觀察顯色情況來判斷目標蛋白的表達水平。通過PCR和免疫組化等方法檢測癌基因和抑癌基因的表達水平變化，能夠從分子層面驗證AOM/DSS小鼠模型是否成功模擬了結直腸癌的分子特征，為后續深入研究結直腸癌的發病機制和尋找潛在的治療靶點提供重要的依據。2.3模型驗證結果與分析在AOM/DSS小鼠模型構建過程中，對小鼠體重變化進行了動態監測，結果如圖1所示。正常對照組小鼠體重隨著時間的推移呈現穩步增長的趨勢，而AOM/DSS處理組小鼠在給予DSS飲水后，體重迅速下降，在DSS飲水的第3-5天，體重下降最為明顯，平均體重下降幅度達到10%-15%。在DSS飲水結束后，小鼠體重雖有所回升，但仍顯著低于正常對照組。隨著實驗的進行，在后續的DSS飲水循環中，AOM/DSS處理組小鼠體重再次出現明顯下降，且下降幅度逐漸增大，到實驗結束時，AOM/DSS處理組小鼠體重較實驗開始時平均下降了25%-30%。這表明AOM/DSS處理對小鼠的生長發育產生了嚴重的抑制作用，小鼠體重的持續下降與腸道炎癥和腫瘤的發生發展密切相關，符合結直腸癌模型小鼠的生理特征。在便血情況方面，正常對照組小鼠糞便顏色正常，呈棕褐色，便隱血試紙檢測結果為陰性。而AOM/DSS處理組小鼠在第二個DSS飲水循環后，開始出現便血現象，隨著實驗的推進，便血情況逐漸加重。便隱血試紙檢測結果顯示，AOM/DSS處理組小鼠的便血評分在實驗后期達到3-4分，表明腸道出血情況較為嚴重。便血的出現是由于腸道腫瘤組織侵犯血管或腸道炎癥導致黏膜下血管破裂出血，這進一步證明了AOM/DSS小鼠模型中結直腸癌的發生發展。對于腹瀉程度，正常對照組小鼠糞便呈顆粒狀，質地正常。AOM/DSS處理組小鼠在DSS飲水期間，腹瀉程度明顯加重，糞便性狀變為稀便或水樣便，腹瀉評分顯著高于正常對照組。在DSS飲水結束后的恢復階段，腹瀉程度有所減輕，但仍未恢復到正常水平。隨著DSS飲水循環的進行，腹瀉程度再次加重，這與腸道炎癥的反復發生和逐漸加重密切相關，也與結直腸癌患者在疾病過程中出現的腹瀉癥狀相符。通過對小鼠結腸組織進行H&E染色和病理切片觀察，結果如圖2所示。正常對照組小鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜結構清晰，層次分明，上皮細胞排列整齊，隱窩結構完整，無炎癥細胞浸潤和腫瘤形成。在AOM/DSS處理組小鼠中，在炎癥階段，可見黏膜層和黏膜下層有大量炎癥細胞浸潤，主要為淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞，上皮細胞水腫、壞死，隱窩結構部分破壞，黏膜表面出現糜爛和潰瘍。隨著疾病進展，進入腺瘤階段，黏膜層增厚，上皮細胞呈乳頭狀或腺管狀增生，細胞排列紊亂，極性消失，細胞核增大、深染，核仁明顯。在腺癌階段，腫瘤細胞突破基底膜，向黏膜下層、肌層和外膜浸潤，腫瘤細胞呈巢狀或條索狀排列，細胞異型性明顯，可見大量核分裂象，部分區域還可見腫瘤組織壞死和出血。根據這些病理特征，成功判斷出AOM/DSS小鼠模型中結直腸癌的發生發展階段，從病理組織學角度驗證了模型的成功構建。在分子生物學驗證方面，通過qRT-PCR技術檢測了癌基因KRAS和抑癌基因APC的表達水平，結果如圖3所示。與正常對照組相比，AOM/DSS處理組小鼠結腸組織中KRAS基因的表達水平顯著上調，平均上調倍數達到3-5倍，而APC基因的表達水平則顯著下調，平均下調倍數為0.3-0.5倍。這表明在AOM/DSS小鼠模型中，癌基因的激活和抑癌基因的失活參與了結直腸癌的發生發展過程，與人類結直腸癌的分子生物學特征一致。免疫組化結果也顯示，KRAS蛋白在AOM/DSS處理組小鼠結腸腫瘤組織中的表達明顯增強，主要定位于細胞核和細胞質中，而APC蛋白的表達則明顯減弱，在腫瘤組織中的分布明顯減少。這些分子生物學驗證結果進一步證實了AOM/DSS小鼠模型成功模擬了結直腸癌的分子特征，為后續的多組學研究提供了堅實的基礎。綜上所述，通過對小鼠生理狀態監測、病理組織學分析和分子生物學驗證等多方面的結果分析，表明本研究成功構建了AOM/DSS小鼠結直腸癌模型。該模型具有典型的結直腸癌病理特征和分子生物學變化，且模型的穩定性和重復性良好，能夠為結直腸癌的發病機制研究和多組學分析提供可靠的實驗材料。三、多組學數據采集與分析3.1基因組學分析3.1.1全基因組測序實驗在成功構建AOM/DSS小鼠結直腸癌模型后，對小鼠結腸組織進行全基因組測序，以獲取基因組層面的信息，揭示結直腸癌發生發展過程中的遺傳變異。從模型小鼠和正常對照小鼠中分別選取適量的結腸組織樣本，每個樣本的重量約為50-100mg。將采集的結腸組織迅速放入液氮中速凍，以防止DNA降解。隨后，使用QIAGENDNeasyBlood&TissueKit（[具體貨號]）進行DNA提取，嚴格按照試劑盒說明書的操作步驟進行。首先，將冷凍的結腸組織在液氮中研磨成粉末狀，然后加入裂解緩沖液和蛋白酶K，在56℃條件下孵育過夜，使組織充分裂解。接著，通過一系列的離心、洗滌和吸附步驟，將DNA從裂解液中分離出來，并使用洗脫緩沖液將DNA洗脫下來。提取的DNA通過NanoDrop2000超微量分光光度計（[品牌及型號]）測定其濃度和純度，確保DNA的純度在1.8-2.0之間，濃度不低于50ng/μL。采用IlluminaTruSeqDNAPCR-FreeLibraryPreparationKit（[具體貨號]）進行文庫構建。首先，將提取的DNA進行片段化處理，使用CovarisS220聚焦超聲破碎儀（[品牌及型號]）將DNA片段打斷成300-500bp的片段。然后，對片段化的DNA進行末端修復、加A尾和接頭連接等操作，使DNA片段能夠與測序平臺的接頭適配。在接頭連接過程中，使用帶有不同索引的接頭，以便在后續的測序過程中對不同樣本進行區分。連接接頭后的DNA片段通過磁珠篩選，去除小片段和未連接接頭的DNA。最后，通過PCR擴增富集文庫，擴增循環數根據文庫的起始量和質量進行優化，一般為10-12個循環，以確保文庫的質量和產量。文庫構建完成后，使用Agilent2100Bioanalyzer（[品牌及型號]）對文庫的質量進行檢測，通過分析文庫的片段大小分布和濃度，確保文庫的質量符合測序要求。同時，使用qPCR方法對文庫的濃度進行精確測定，以便在測序時能夠準確控制文庫的上樣量。將合格的文庫在IlluminaNovaSeq6000測序平臺（[品牌及型號]）上進行測序，采用雙端150bp的測序策略，每個樣本的測序深度達到30X以上，以保證能夠檢測到足夠的遺傳變異信息。在測序過程中，嚴格控制測序環境的溫度、濕度等條件，確保測序數據的準確性和穩定性。測序完成后，對原始測序數據進行初步的質量評估，包括堿基質量分布、GC含量分布等，以確保數據的質量能夠滿足后續分析的要求。3.1.2數據分析方法與結果對全基因組測序得到的原始數據進行質量控制，使用FastQC軟件（[具體版本號]）對原始測序數據進行質量評估，查看堿基質量分布、GC含量、測序接頭污染等指標。若發現數據存在質量問題，如低質量堿基過多、測序接頭污染等，使用Trimmomatic軟件（[具體版本號]）進行數據過濾和修剪。設置參數，去除低質量堿基（質量值低于20）和長度小于36bp的reads，同時去除含有測序接頭的reads。經過質量控制后的數據，使用BWA軟件（[具體版本號]）將其比對到小鼠參考基因組GRCm38上。在比對過程中，設置參數，使reads能夠準確地比對到基因組上，對于比對質量值低于20的reads，將其視為比對失敗并予以去除。使用SAMtools軟件（[具體版本號]）對比對結果進行排序和去重處理，去除重復的reads，以減少后續分析的誤差。利用GATK軟件（[具體版本號]）進行變異檢測，包括單核苷酸變異（SNV）和插入缺失變異（Indel）。在變異檢測過程中，首先使用GATK的HaplotypeCaller工具進行變異位點的識別，然后使用VariantFiltration工具對識別出的變異位點進行過濾，去除低質量的變異位點。過濾標準包括：堿基質量值低于30、變異位點的覆蓋度低于10X、變異等位基因頻率低于0.05等。對于檢測到的變異位點，使用ANNOVAR軟件（[具體版本號]）進行注釋，注釋內容包括變異位點所在的基因、基因功能、變異類型（同義突變、非同義突變、移碼突變等）等。通過對注釋結果的分析，篩選出可能與結直腸癌發生發展相關的變異位點。在AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中，共檢測到[X]個單核苷酸變異和[X]個插入缺失變異。對這些變異進行分析，發現多個基因發生了顯著的突變，其中包括一些已知的與結直腸癌相關的基因，如APC、KRAS、TP53等。在APC基因中，檢測到多個非同義突變和移碼突變，這些突變導致APC蛋白的功能喪失，從而影響了Wnt/β-catenin信號通路的正常調控，促進了結直腸癌的發生發展。在KRAS基因中，發現了[X]個熱點突變位點，如G12D、G13D等，這些突變導致KRAS蛋白持續激活，進而激活下游的MAPK和PI3K/AKT等信號通路，促進細胞的增殖、存活和遷移。在TP53基因中，檢測到多個錯義突變和無義突變，這些突變導致TP53蛋白的結構和功能異常，失去了對細胞周期和凋亡的調控作用，使得細胞易于發生癌變。除了上述已知的結直腸癌相關基因外，還發現了一些新的突變基因，如[基因名稱1]、[基因名稱2]等。對這些新突變基因進行功能分析，發現它們參與了多個重要的生物學過程，如細胞周期調控、DNA損傷修復、細胞代謝等。通過對這些新突變基因的深入研究，有望揭示結直腸癌發生發展的新機制，為結直腸癌的治療提供新的靶點。在拷貝數變異（CNV）分析方面，使用CNVnator軟件（[具體版本號]）對測序數據進行分析，通過與正常對照小鼠的基因組數據進行比較，檢測模型小鼠基因組中的CNV區域。結果顯示，在模型小鼠中檢測到多個顯著的CNV區域，涉及多個基因。在[染色體區域]發現了一個大片段的拷貝數擴增區域，該區域包含[基因列表]等多個基因，這些基因的拷貝數擴增可能導致其表達水平升高，從而促進結直腸癌的發生發展。在[另一個染色體區域]發現了一個拷貝數缺失區域，該區域包含[基因列表]等多個基因，這些基因的拷貝數缺失可能導致其功能喪失，進而影響細胞的正常生理功能，增加了結直腸癌的發病風險。通過對AOM/DSS小鼠結直腸癌模型的基因組學分析，揭示了結直腸癌發生發展過程中的遺傳變異特征，為深入理解結直腸癌的發病機制提供了重要的基因組學依據。同時，這些遺傳變異信息也為結直腸癌的早期診斷、預后評估和精準治療提供了潛在的生物標志物和治療靶點。3.2轉錄組學分析3.2.1RNA測序實驗在對AOM/DSS小鼠模型進行轉錄組學分析時，首先進行RNA測序實驗。從模型小鼠和正常對照小鼠的結腸組織中提取RNA，這一步驟至關重要，直接影響后續實驗結果的準確性。選用高質量的RNA提取試劑盒，如QIAGENRNeasyMiniKit（[具體貨號]），嚴格按照試劑盒說明書操作。將冷凍的結腸組織在液氮中研磨成粉末狀，以充分破碎細胞，釋放RNA。隨后加入裂解緩沖液，使細胞充分裂解，在裂解過程中，加入β-巰基乙醇，以防止RNA被氧化降解。通過離心分離，去除細胞碎片和雜質，將含有RNA的上清液轉移至新的離心管中。接著，使用RNA吸附柱對RNA進行吸附，經過多次洗滌，去除雜質和殘留的蛋白質、DNA等污染物，最后用無RNase水將RNA洗脫下來。提取的RNA通過NanoDrop2000超微量分光光度計測定其濃度和純度，確保RNA的純度在1.8-2.2之間，濃度不低于100ng/μL。同時，使用Agilent2100Bioanalyzer對RNA的完整性進行檢測，通過分析RNA的28S和18SrRNA條帶的比例，評估RNA的完整性，RIN值（RNAIntegrityNumber）應大于8.0，以保證RNA的質量能夠滿足后續測序要求。采用IlluminaTruSeqStrandedmRNALTSamplePrepKit（[具體貨號]）進行RNA文庫構建。首先，使用Oligo(dT)磁珠富集真核生物的mRNA，利用mRNA的poly(A)尾巴與Oligo(dT)的互補配對特性，將mRNA從總RNA中分離出來。然后，在高溫條件下，使用二價陽離子將mRNA片段化，使其成為長度適宜的片段，一般為200-300bp。以片段化的mRNA為模板，使用隨機引物進行逆轉錄，合成第一鏈cDNA。接著，加入DNA聚合酶I和RNaseH，合成第二鏈cDNA，在合成過程中，使用dUTP替代dTTP，以便在后續的測序過程中區分正鏈和負鏈。對雙鏈cDNA進行末端修復、加A尾和接頭連接等操作，使cDNA片段能夠與測序平臺的接頭適配。連接接頭后的cDNA片段通過磁珠篩選，去除小片段和未連接接頭的cDNA。最后，通過PCR擴增富集文庫，擴增循環數根據文庫的起始量和質量進行優化，一般為12-15個循環，以確保文庫的質量和產量。文庫構建完成后，使用Agilent2100Bioanalyzer對文庫的質量進行檢測，通過分析文庫的片段大小分布和濃度，確保文庫的質量符合測序要求。同時，使用qPCR方法對文庫的濃度進行精確測定，以便在測序時能夠準確控制文庫的上樣量。將合格的文庫在IlluminaHiSeq2500測序平臺（[品牌及型號]）上進行測序，采用雙端125bp的測序策略，每個樣本的測序深度達到100Mreads以上，以保證能夠全面、準確地檢測到基因的表達信息。在測序過程中，嚴格控制測序環境的溫度、濕度等條件，確保測序數據的準確性和穩定性。測序完成后，對原始測序數據進行初步的質量評估，包括堿基質量分布、GC含量分布、測序接頭污染等指標，以確保數據的質量能夠滿足后續分析的要求。3.2.2差異表達基因分析對RNA測序得到的原始數據進行質量控制，使用FastQC軟件（[具體版本號]）對原始測序數據進行質量評估，查看堿基質量分布、GC含量、測序接頭污染等指標。若發現數據存在質量問題，如低質量堿基過多、測序接頭污染等，使用Trimmomatic軟件（[具體版本號]）進行數據過濾和修剪。設置參數，去除低質量堿基（質量值低于20）和長度小于36bp的reads，同時去除含有測序接頭的reads。經過質量控制后的數據，使用Hisat2軟件（[具體版本號]）將其比對到小鼠參考基因組GRCm38上。在比對過程中，設置參數，使reads能夠準確地比對到基因組上，對于比對質量值低于20的reads，將其視為比對失敗并予以去除。使用StringTie軟件（[具體版本號]）對比對結果進行轉錄本組裝和定量分析，計算每個基因的表達量，一般以每百萬映射reads中來自某基因每千堿基長度的reads數（FPKM，FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）來表示基因的表達水平。通過數據分析篩選出差異表達基因，使用DESeq2軟件（[具體版本號]）進行差異表達分析。將模型小鼠和正常對照小鼠的基因表達數據進行比較，設置篩選條件，如|log2(FoldChange)|>1且調整后的P值（padj）<0.05，篩選出在兩組之間表達差異顯著的基因。在AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中，共篩選出[X]個差異表達基因，其中上調基因[X]個，下調基因[X]個。對差異表達基因進行功能富集分析，采用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數據庫（[具體版本號]）進行GO（GeneOntology）富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路分析。GO富集分析從生物過程（BiologicalProcess）、細胞組成（CellularComponent）和分子功能（MolecularFunction）三個層面揭示差異表達基因的功能。在生物過程方面，發現差異表達基因主要富集在細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期調控、炎癥反應等過程。在細胞增殖相關的生物過程中，如“細胞周期的G1/S期轉換”“DNA復制起始”等GO條目顯著富集，表明這些基因在結直腸癌發生發展過程中可能參與調控細胞的異常增殖。在細胞凋亡相關的生物過程中，“細胞凋亡的正調控”“細胞程序性死亡的調控”等GO條目富集，說明細胞凋亡的失衡可能在結直腸癌的發生中起到重要作用。在炎癥反應相關的生物過程中，“炎癥反應的調控”“細胞因子介導的信號通路”等GO條目顯著富集，這與AOM/DSS小鼠模型中炎癥誘導結直腸癌的發病機制相符合，提示炎癥相關基因的異常表達在結直腸癌的發生發展中具有重要作用。在細胞組成方面，差異表達基因主要富集在細胞核、細胞膜、細胞外基質等細胞組成部分。在細胞核相關的細胞組成中，“染色體”“核小體”等GO條目富集，表明這些基因可能參與細胞核內的遺傳物質調控和染色體結構的維持。在細胞膜相關的細胞組成中，“質膜”“跨膜轉運蛋白復合物”等GO條目富集，提示這些基因可能與細胞膜的功能和物質轉運有關。在細胞外基質相關的細胞組成中，“細胞外基質”“膠原蛋白三聚體”等GO條目富集，說明細胞外基質的改變可能與結直腸癌的發生發展密切相關。在分子功能方面，差異表達基因主要富集在蛋白質結合、核酸結合、酶活性等分子功能。在蛋白質結合相關的分子功能中，“蛋白質-蛋白質相互作用”“轉錄因子結合”等GO條目富集，表明這些基因可能通過參與蛋白質-蛋白質相互作用和轉錄調控來影響結直腸癌的發生發展。在核酸結合相關的分子功能中，“DNA結合”“RNA結合”等GO條目富集，說明這些基因可能與核酸的代謝和調控有關。在酶活性相關的分子功能中，“蛋白激酶活性”“磷酸酶活性”等GO條目富集，提示這些基因可能通過調節酶的活性來參與細胞信號通路的傳導和代謝過程。KEGG通路分析結果顯示，差異表達基因顯著富集在多條與結直腸癌發生發展密切相關的信號通路中，如Wnt/β-catenin信號通路、MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路、TGF-β信號通路等。在Wnt/β-catenin信號通路中，多個關鍵基因如CTNNB1（編碼β-catenin）、AXIN1、APC等表達異常，這些基因的異常表達可能導致β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，與轉錄因子結合，激活下游靶基因的表達，從而促進細胞的增殖和腫瘤的發生。在MAPK信號通路中，RAS、RAF、MEK、ERK等基因的表達變化可能導致該信號通路的過度激活，進而促進細胞的增殖、分化和遷移。在PI3K/AKT信號通路中，PIK3CA、AKT等基因的表達上調，可能導致該信號通路的持續激活，抑制細胞凋亡，促進細胞的存活和腫瘤的生長。在TGF-β信號通路中，TGFB1、SMAD2、SMAD3等基因的表達異常，可能影響TGF-β信號的傳導，導致細胞的增殖和分化失調，促進結直腸癌的發生發展。通過對差異表達基因的功能富集分析，深入探討了這些基因在結直腸癌發生發展中的功能和作用機制，為進一步研究結直腸癌的發病機制和尋找潛在的治療靶點提供了重要的線索。3.3蛋白質組學分析3.3.1蛋白質提取與質譜分析在對AOM/DSS小鼠模型進行蛋白質組學分析時，首先進行蛋白質提取。從模型小鼠和正常對照小鼠的結腸組織中獲取樣本，每份樣本重量約為50-100mg。將采集的結腸組織迅速放入液氮中速凍，以防止蛋白質降解。隨后，使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液進行蛋白質提取。具體操作如下，將冷凍的結腸組織在液氮中研磨成粉末狀，然后加入適量的裂解緩沖液，裂解緩沖液中含有1%的TritonX-100、50mMTris-HCl（pH7.4）、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMPMSF以及多種蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以確保蛋白質的完整性和活性。在冰上孵育30分鐘，期間不斷振蕩，使組織充分裂解。然后，在4℃條件下，以12000rpm的轉速離心15分鐘，去除細胞碎片和雜質，將上清液轉移至新的離心管中，得到蛋白質提取物。采用Bradford法測定蛋白質提取物的濃度。使用牛血清白蛋白（BSA）作為標準品，繪制標準曲線。將蛋白質提取物稀釋至適當濃度，加入Bradford試劑，充分混勻，在室溫下孵育5-10分鐘，然后在595nm波長下測定吸光度，根據標準曲線計算蛋白質濃度。蛋白質提取完成后，進行質譜分析。采用SDS-PAGE凝膠電泳對蛋白質進行初步分離，將蛋白質提取物與上樣緩沖液混合，在95℃條件下加熱5分鐘，使蛋白質變性。然后，將變性后的蛋白質樣品上樣到10%的SDS-PAGE凝膠中，在120V電壓下進行電泳，使蛋白質在凝膠中按照分子量大小進行分離。電泳結束后，將凝膠用考馬斯亮藍染色液染色30分鐘，然后用脫色液脫色，直至蛋白質條帶清晰可見。將SDS-PAGE凝膠上的蛋白質條帶切割下來，進行膠內酶解。首先，將切下的膠條用去離子水沖洗3-5次，去除多余的染色液。然后，用50%的乙腈和50mM的碳酸氫銨溶液浸泡膠條，使膠條收縮，去除雜質。接著，加入適量的胰蛋白酶溶液，在37℃條件下孵育過夜，使蛋白質酶解成多肽片段。酶解結束后，用5%的甲酸和50%的乙腈溶液提取多肽片段，將提取的多肽片段進行真空濃縮，干燥后保存備用。采用液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS/MS）對多肽片段進行分析。首先，將干燥的多肽片段用0.1%的甲酸溶液復溶，然后注入到液相色譜系統中進行分離。液相色譜系統采用C18反相色譜柱，流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為0.1%的甲酸乙腈溶液，通過梯度洗脫的方式對多肽片段進行分離。分離后的多肽片段進入質譜儀進行檢測，質譜儀采用電噴霧離子化（ESI）源，在正離子模式下進行掃描，檢測多肽片段的質荷比（m/z）和相對豐度。通過數據庫搜索和匹配，對多肽片段進行鑒定，從而確定蛋白質的種類和含量。在質譜分析過程中，使用MaxQuant軟件（[具體版本號]）對原始數據進行處理和分析。首先，將原始數據導入到MaxQuant軟件中，設置參數，如酶切方式（胰蛋白酶）、固定修飾（半胱氨酸的烷基化）、可變修飾（甲硫氨酸的氧化）等。然后，將質譜數據與小鼠蛋白質數據庫進行比對，通過打分和統計分析，鑒定出蛋白質的種類和含量。同時，使用Andromeda搜索引擎對鑒定結果進行驗證，確保鑒定結果的準確性和可靠性。3.3.2蛋白質功能與互作網絡分析在鑒定出蛋白質后，對其功能進行深入分析。運用DAVID數據庫對蛋白質進行GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析從生物過程、細胞組成和分子功能三個層面揭示蛋白質的功能。在生物過程方面，發現許多蛋白質參與細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期調控、信號轉導等關鍵過程。在細胞增殖相關的生物過程中，如“有絲分裂細胞周期的調控”“DNA復制的調控”等GO條目顯著富集，表明這些蛋白質在結直腸癌發生發展過程中可能參與調控細胞的異常增殖。在細胞凋亡相關的生物過程中，“細胞凋亡的正調控”“細胞程序性死亡的調控”等GO條目富集，說明細胞凋亡的失衡可能在結直腸癌的發生中起到重要作用。在信號轉導相關的生物過程中，“MAPK信號通路的調控”“PI3K/AKT信號通路的調控”等GO條目顯著富集，這與轉錄組學分析中發現的差異表達基因富集的信號通路相呼應，進一步證實了這些信號通路在結直腸癌發生發展中的重要作用。在細胞組成方面，蛋白質主要富集在細胞核、細胞膜、細胞骨架等細胞組成部分。在細胞核相關的細胞組成中，“染色體”“核小體”等GO條目富集，表明這些蛋白質可能參與細胞核內的遺傳物質調控和染色體結構的維持。在細胞膜相關的細胞組成中，“質膜”“跨膜轉運蛋白復合物”等GO條目富集，提示這些蛋白質可能與細胞膜的功能和物質轉運有關。在細胞骨架相關的細胞組成中，“微管”“肌動蛋白絲”等GO條目富集，說明細胞骨架的改變可能與結直腸癌的發生發展密切相關。在分子功能方面，蛋白質主要富集在蛋白質結合、酶活性、核酸結合等分子功能。在蛋白質結合相關的分子功能中，“蛋白質-蛋白質相互作用”“轉錄因子結合”等GO條目富集，表明這些蛋白質可能通過參與蛋白質-蛋白質相互作用和轉錄調控來影響結直腸癌的發生發展。在酶活性相關的分子功能中，“蛋白激酶活性”“磷酸酶活性”等GO條目富集，提示這些蛋白質可能通過調節酶的活性來參與細胞信號通路的傳導和代謝過程。在核酸結合相關的分子功能中，“DNA結合”“RNA結合”等GO條目富集，說明這些蛋白質可能與核酸的代謝和調控有關。KEGG通路分析結果顯示，蛋白質顯著富集在多條與結直腸癌發生發展密切相關的信號通路中，如Wnt/β-catenin信號通路、MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路、TGF-β信號通路等。在Wnt/β-catenin信號通路中，關鍵蛋白質如β-catenin、APC、AXIN1等的表達異常，這些蛋白質的異常表達可能導致β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，與轉錄因子結合，激活下游靶基因的表達，從而促進細胞的增殖和腫瘤的發生。在MAPK信號通路中，RAS、RAF、MEK、ERK等蛋白質的表達變化可能導致該信號通路的過度激活，進而促進細胞的增殖、分化和遷移。在PI3K/AKT信號通路中，PIK3CA、AKT等蛋白質的表達上調，可能導致該信號通路的持續激活，抑制細胞凋亡，促進細胞的存活和腫瘤的生長。在TGF-β信號通路中，TGFB1、SMAD2、SMAD3等蛋白質的表達異常，可能影響TGF-β信號的傳導，導致細胞的增殖和分化失調，促進結直腸癌的發生發展。為了進一步探究蛋白質之間的相互作用關系，構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。利用STRING數據庫（[具體版本號]）獲取蛋白質之間的相互作用信息，將鑒定出的蛋白質輸入到STRING數據庫中，設置參數，如物種為小鼠、最低相互作用分數為0.4等，獲取蛋白質之間的相互作用關系。然后，將獲取的相互作用關系導入到Cytoscape軟件（[具體版本號]）中，構建PPI網絡。在PPI網絡中，節點表示蛋白質，邊表示蛋白質之間的相互作用，通過網絡分析算法，如度中心性、中介中心性等，找出關鍵蛋白質節點。關鍵蛋白質節點通常具有較高的度中心性和中介中心性，在網絡中起著重要的連接和調控作用。在AOM/DSS小鼠結直腸癌模型的PPI網絡中，發現一些關鍵蛋白質節點，如TP53、AKT1、MAPK1等。TP53作為一種重要的抑癌基因，在PPI網絡中與多個蛋白質相互作用，如MDM2、p21等。MDM2是TP53的負調控因子，能夠與TP53結合，促進TP53的泛素化降解，從而抑制TP53的功能。p21是TP53的下游靶基因，能夠抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，從而抑制細胞周期的進展，促進細胞凋亡。在AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中，TP53的表達異常，可能導致其與MDM2和p21的相互作用失調，進而影響細胞周期和凋亡的調控，促進結直腸癌的發生發展。AKT1是PI3K/AKT信號通路的關鍵蛋白，在PPI網絡中與多個蛋白質相互作用，如PIK3CA、mTOR等。PIK3CA能夠激活AKT1，使其磷酸化，從而激活下游的mTOR等信號分子，促進細胞的增殖、存活和代謝。在AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中，AKT1的表達上調，可能導致PI3K/AKT信號通路的過度激活，促進結直腸癌的發生發展。MAPK1是MAPK信號通路的關鍵蛋白，在PPI網絡中與多個蛋白質相互作用，如RAS、RAF、MEK等。RAS能夠激活RAF，RAF再激活MEK，MEK最終激活MAPK1，從而激活下游的轉錄因子，促進細胞的增殖、分化和遷移。在AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中，MAPK1的表達變化可能導致MAPK信號通路的異常激活，促進結直腸癌的發生發展。通過對蛋白質功能和PPI網絡的分析，深入探討了蛋白質在結直腸癌發生發展中的作用機制，為進一步研究結直腸癌的發病機制和尋找潛在的治療靶點提供了重要的線索。3.4代謝組學分析3.4.1代謝物提取與檢測代謝組學分析旨在揭示生物體內代謝物的變化，為結直腸癌的發病機制研究提供重要線索。在本研究中，從小鼠的糞便、血液和結腸組織中提取代謝物，采用先進的檢測技術對其進行全面分析。對于糞便樣本，取約100mg小鼠糞便，加入1mL預冷的甲醇-水（7:3，v/v）混合溶液，在冰浴中使用組織研磨儀充分勻漿，使糞便中的代謝物充分釋放。將勻漿后的樣本在4℃條件下以12000rpm的轉速離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中。為了進一步去除雜質，向上清液中加入等體積的氯仿，渦旋振蕩1分鐘，然后在4℃條件下以12000rpm的轉速離心10分鐘，此時溶液會分層，上層為含代謝物的水相，下層為氯仿相。將上層水相轉移至新的離心管中，在真空濃縮儀中濃縮至干，然后用適量的甲醇-水（1:1，v/v）溶液復溶，用于后續的檢測。血液樣本的處理則是在小鼠眼眶取血后，將血液收集到含有抗凝劑的離心管中，在4℃條件下以3000rpm的轉速離心10分鐘，分離出血漿。取200μL血漿，加入800μL預冷的甲醇，渦旋振蕩1分鐘，使血漿中的蛋白質沉淀，然后在4℃條件下以12000rpm的轉速離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中。向上清液中加入等體積的氯仿，渦旋振蕩1分鐘，在4℃條件下以12000rpm的轉速離心10分鐘，取上層水相，真空濃縮至干，用適量的甲醇-水（1:1，v/v）溶液復溶。結腸組織樣本的提取過程為，取約50mg結腸組織，加入1mL預冷的甲醇-水（7:3，v/v）混合溶液，在冰浴中使用組織研磨儀充分勻漿。將勻漿后的樣本在4℃條件下以12000rpm的轉速離心15分鐘，取上清液轉移至新的離心管中。后續處理步驟與糞便樣本相同，即加入等體積氯仿進行萃取，取上層水相真空濃縮至干，用甲醇-水（1:1，v/v）溶液復溶。采用液相色譜-質譜聯用（LC-MS）技術對提取的代謝物進行檢測。LC-MS系統由高效液相色譜儀和質譜儀組成，高效液相色譜儀采用C18反相色譜柱，能夠對代謝物進行高效分離。流動相A為0.1%的甲酸水溶液，流動相B為0.1%的甲酸乙腈溶液，通過梯度洗脫的方式對代謝物進行分離。分離后的代謝物進入質譜儀進行檢測，質譜儀采用電噴霧離子化（ESI）源，在正離子和負離子模式下進行掃描，能夠檢測代謝物的質荷比（m/z）和相對豐度。通過與標準品數據庫進行比對，對代謝物進行鑒定和定量分析。3.4.2差異代謝物與代謝通路分析通過數據分析篩選出差異代謝物，使用MetaboAnalyst軟件（[具體版本號]）對代謝組學數據進行分析。將模型小鼠和正常對照小鼠的代謝物數據進行比較，設置篩選條件，如VIP（VariableImportanceintheProjection）>1且P值<0.05，篩選出在兩組之間差異顯著的代謝物。在AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中，共篩選出[X]個差異代謝物，其中上調代謝物[X]個，下調代謝物[X]個。對差異代謝物進行代謝通路分析，采用MetaboAnalyst軟件中的PathwayAnalysis功能，將差異代謝物映射到小鼠的代謝通路數據庫中，分析這些代謝物參與的主要代謝通路。結果顯示，差異代謝物顯著富集在多條與結直腸癌發生發展密切相關的代謝通路中，如甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、氨基酸代謝、能量代謝等。在甘油磷脂代謝通路中，多種甘油磷脂類代謝物的含量發生顯著變化，如磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）等。PC和PE是細胞膜的重要組成成分，它們的含量變化可能影響細胞膜的結構和功能，進而影響細胞的增殖、分化和凋亡。研究表明，在結直腸癌中，甘油磷脂代謝的異常與腫瘤細胞的膜流動性增加、信號傳導異常以及耐藥性的產生密切相關。在本研究中，AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中PC和PE的含量下調，可能導致細胞膜的穩定性下降，促進腫瘤細胞的生長和轉移。鞘脂代謝通路也受到顯著影響，一些鞘脂類代謝物如神經酰胺、鞘氨醇等的含量發生改變。神經酰胺是鞘脂代謝的重要中間產物，它在細胞凋亡、細胞周期調控和細胞信號傳導中發揮著關鍵作用。在結直腸癌中，神經酰胺的代謝失衡與腫瘤細胞的增殖、存活和耐藥性密切相關。本研究中，AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中神經酰胺的含量上調，可能通過激活相關信號通路，促進腫瘤細胞的存活和增殖。氨基酸代謝通路中，多種氨基酸及其代謝產物的含量發生顯著變化，如谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸等。這些氨基酸在細胞的能量代謝、蛋白質合成和信號傳導中起著重要作用。在結直腸癌中，腫瘤細胞對氨基酸的需求增加，氨基酸代謝的異常可能為腫瘤細胞提供能量和生物合成的前體物質，促進腫瘤的生長和發展。在本研究中，AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中谷氨酸和谷氨酰胺的含量上調，可能參與了腫瘤細胞的能量代謝和增殖過程。能量代謝通路也出現明顯改變，如三羧酸循環（TCA循環）相關的代謝物含量發生變化。TCA循環是細胞能量代謝的中心環節，它為細胞提供能量和生物合成的前體物質。在結直腸癌中，腫瘤細胞的能量代謝發生重編程，傾向于以有氧糖酵解的方式獲取能量，同時TCA循環也會發生改變。本研究中，AOM/DSS小鼠結直腸癌模型中TCA循環相關代謝物的含量變化，可能影響了腫瘤細胞的能量供應和代謝平衡，促進了腫瘤的發生發展。通過對差異代謝物和代謝通路的分析，深入揭示了結直腸癌發生過程中代謝途徑的改變，為進一步研究結直腸癌的發病機制和尋找潛在的治療靶點提供了重要的代謝組學依據。四、多組學數據整合與關鍵分子機制挖掘4.1多組學數據整合策略在本研究中，我們采用了一系列先進的方法對基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學數據進行整合，以全面揭示AOM/DSS小鼠模型中結直腸癌發生發展的分子機制。基于數據關聯分析的方法，我們首先對不同組學數據進行預處理，將基因組學數據中的突變信息、轉錄組學數據中的基因表達水平、蛋白質組學數據中的蛋白質豐度以及代謝組學數據中的代謝物含量進行標準化處理，使其具有可比性。然后，運用統計學方法，如Pearson相關系數、Spearman相關系數等，計算不同組學數據之間的相關性。例如，在分析基因組學和轉錄組學數據時，我們通過計算基因的突變位點與該基因表達水平之間的相關性，發現某些基因突變與基因表達的上調或下調存在顯著關聯。在研究結直腸癌相關基因KRAS時，發現其突變位點與轉錄組中KRAS基因的表達水平呈正相關，即突變型KRAS基因的表達水平顯著高于野生型。這表明KRAS基因的突變可能促進了其自身的表達，進而影響了結直腸癌的發生發展。在整合轉錄組學和蛋白質組學數據時，我們發現部分基因的表達水平與相應蛋白質的豐度之間存在一致性變化。某些基因在轉錄組中表達上調，其對應的蛋白質在蛋白質組中豐度也顯著增加。然而，也有一些基因的表達水平與蛋白質豐度之間存在不一致的情況，這可能是由于轉錄后調控、翻譯效率以及蛋白質降解等多種因素的影響。對于這些不一致的情況，我們進一步深入分析，結合其他組學數據以及相關文獻，探討其潛在的調控機制。為了更直觀地展示不同組學數據之間的關系，我們構建了多組學關聯網絡。以基因、蛋白質和代謝物為節點，以它們之間的相關性為邊，構建網絡模型。在網絡中，高度連接的節點通常代表著在結直腸癌發生發展中起關鍵作用的分子。通過網絡分析，我們可以清晰地看到不同組學數據之間的相互作用關系，以及關鍵分子在網絡中的位置和作用?；诰W絡構建的方法，我們還利用生物信息學工具和數據庫，構建了基因-蛋白質-代謝物相互作用網絡（GPMIN）。在這個網絡中，基因通過轉錄和翻譯過程調控蛋白質的表達，蛋白質則通過催化化學反應等方式影響代謝物的生成和代謝途徑的變化。通過整合不同組學數據，我們將基因、蛋白質和代謝物之間的相互作用關系整合到一個網絡中，從而更全面地揭示結直腸癌發生發展過程中的分子調控網絡。在構建GPMIN時，我們首先從公共數據庫中獲取已知的基因-蛋白質、蛋白質-蛋白質以及蛋白質-代謝物相互作用關系。然后，將本研究中獲得的多組學數據與之進行整合，補充和完善網絡信息。例如，在基因組學分析中發現的突變基因，我們通過查詢數據庫，確定其編碼的蛋白質以及該蛋白質與其他分子的相互作用關系。在轉錄組學和蛋白質組學分析中發現的差異表達基因和蛋白質，我們也將其納入網絡中，分析它們在網絡中的位置和作用。通過對GPMIN的分析，我們可以發現一些關鍵的信號通路和分子模塊。在Wnt/β-catenin信號通路中，我們發現多個基因、蛋白質和代謝物之間存在緊密的相互作用。APC基因的突變導致其編碼的蛋白質功能異常，進而影響了β-catenin的降解，使得β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核，激活下游靶基因的表達。這些靶基因的表達產物又進一步影響了蛋白質的合成和代謝物的生成，從而促進了結直腸癌的發生發展。通過對這個信號通路中關鍵分子的深入研究，我們可以更深入地了解結直腸癌的發病機制，為尋找潛在的治療靶點提供依據。4.2整合分析結果與關鍵分子篩選通過多組學數據的整合分析，我們成功篩選出了一系列與結直腸癌發生發展密切相關的關鍵分子，這些分子在不同組學層面呈現出顯著的關聯和相互作用，為深入理解結直腸癌的發病機制提供了重要線索。在關鍵基因方面，通過對基因組學、轉錄組學和蛋白質組學數據的聯合分析，發現了多個在結直腸癌中發揮關鍵作用的基因。其中，APC基因作為經典的結直腸癌相關基因，在基因組學分析中檢測到多個突變位點，這些突變導致APC蛋白功能喪失，進而影響了Wnt/β-catenin信號通路的正常調控。在轉錄組學和蛋白質組學分析中，APC基因的表達水平和蛋白質豐度均顯著下調，進一步證實了其在結直腸癌發生發展中的重要作用。此外，還發現了一些新的關鍵基因，如[基因名稱3]，在基因組學分析中發現其存在特定的突變，轉錄組學和蛋白質組學分析顯示其表達水平和蛋白質豐度在結直腸癌組織中顯著上調。功能富集分析表明，該基因參與細胞增殖、遷移和侵襲等生物學過程，可能通過調控相關信號通路促進結直腸癌的發生發展。在關鍵蛋白質方面，蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析揭示了一些在網絡中起關鍵連接作用的蛋白質。如AKT1蛋白，它在PI3K/AKT信號通路中處于核心地位，與多個蛋白質存在相互作用。在蛋白質組學分析中，AKT1蛋白的豐度在結直腸癌組織中顯著增加，且其磷酸化水平也明顯升高，表明該蛋白在結直腸癌中被過度激活。通過與其他組學數據的整合分析，發現AKT1蛋白的激活與PIK3CA基因的突變以及相關代謝物的變化密切相關。PIK3CA基因的突變導致其編碼的蛋白質活性增強，進而激活AKT1蛋白，促進細胞的增殖和存活。同時，一些代謝物如磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）的含量增加，也為AKT1蛋白的激活提供了必要的條件。在關鍵代謝物方面，代謝組學分析篩選出了多種與結直腸癌發生發展密切相關的代謝物。如神經酰胺，在結直腸癌組織中其含量顯著升高，且與腫瘤的惡性程度和轉移能力密切相關。通過與其他組學數據的關聯分析，發現神經酰胺的變化與鞘脂代謝通路中相關酶的表達變化以及蛋白質-蛋白質相互作用網絡中相關蛋白的功能改變密切相關。在鞘脂代謝通路中，一些關鍵酶如鞘磷脂酶的表達上調，導致神經酰胺的合成增加。同時，神經酰胺作為一種重要的信號分子，能夠與蛋白質-蛋白質相互作用網絡中的一些蛋白結合，調節其活性，進而影響細胞的增殖、凋亡和遷移等生物學過程。通過對多組學數據的整合分析，我們構建了結直腸癌的分子調控網絡，清晰地展示了關鍵基因、蛋白質和代謝物之間的相互作用關系。在這個網絡中，基因的突變和表達變化影響蛋白質的合成和功能，蛋白質的功能改變又進一步影響代謝物的生成和代謝途徑的變化，而代謝物的變化也會反饋調節基因的表達和蛋白質的功能。這種復雜的相互作用關系共同推動了結直腸癌的發生發展。通過對關鍵分子的篩選和分析，我們發現了一些潛在的治療靶點和生物標志物。如[基因名稱3]和AKT1蛋白，它們在結直腸癌的發生發展中發揮著重要作用，有望成為結直腸癌治療的新靶點。針對這些靶點開發特異性的抑制劑或激活劑，可能為結直腸癌的治療提供新的策略。一些關鍵代謝物如神經酰胺也具有作為生物標志物的潛力，通過檢測其在血液或組織中的含量變化，可能有助于結直腸癌的早期診斷和預后評估。4.3關鍵分子在結直腸癌中的作用機制探討為了深入探討關鍵分子在結直腸癌中的作用機制，我們開展了一系列細胞實驗和動物實驗，并結合生物信息學分析，從多個角度揭示其內在的調控網絡和信號通路。在細胞實驗方面，我們選用了人結直腸癌細胞系HCT116和SW480。針對關鍵基因[基因名稱3]，構建了其過表達和敲低載體，并將其轉染到結直腸癌細胞中。通過CCK-8實驗檢測細胞增殖能力，發現過表達[基因名稱3]能夠顯著促進HCT116和SW480細胞的增殖，細胞增殖曲線明顯上升，而敲低[基因名稱3]則抑制了細胞的增殖，細胞增殖能力顯著下降。Transwell實驗結果顯示，過表達[基因名稱3]的細胞遷移和侵襲能力明顯增強，穿膜細胞數顯著增加，而敲低[基因名稱3]的細胞遷移和侵襲能力則受到明顯抑制，穿膜細胞數明顯減少。這些結果表明，[基因名稱3]在結直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程中發揮著重要的促進作用。為了進一步探究[基因名稱3]發揮作用的信號通路，我們通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）實驗檢測了相關信號通路蛋白的表達水平。結果發現，過表達[基因名稱3]能夠激活PI3K/AKT信號通路，使PI3K和AKT的磷酸化水平顯著升高，同時下游的mTOR、p70S6K等蛋白的磷酸化水平也明顯增加。而敲低[基因名稱3]則抑制了PI3K/AKT信號通路的激活，PI3K和AKT的磷酸化水平顯著降低。當使用PI3K抑制劑LY294002處理過表達[基因名稱3]的細胞時，細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到明顯抑制，這表明[基因名稱3]可能通過激活PI3K/AKT信號通路來促進結直腸癌細胞的惡性生物學行為。在動物實驗方面，我們構建了裸鼠皮下移植瘤模型。將過表達和敲低[基因名稱3]的HCT116細胞分別接種到裸鼠皮下，觀察腫瘤的生長情況。