一、引言1.1研究背景與意義甲狀腺腫瘤是一種常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤，近年來其發(fā)病率呈顯著上升趨勢，嚴重威脅人類健康。甲狀腺腫瘤涵蓋良性與惡性腫瘤，其中惡性腫瘤如甲狀腺癌，具有較高的致死率。據(jù)國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，甲狀腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)攀升，已成為增長速度最快的惡性腫瘤之一。其發(fā)病機制涉及多種因素，如遺傳因素、環(huán)境因素、生活方式等，且不同類型的甲狀腺腫瘤發(fā)病機制存在差異。目前，手術切除、放射性碘治療和甲狀腺激素抑制治療是主要的治療手段，但對于一些晚期或轉(zhuǎn)移性甲狀腺腫瘤，這些傳統(tǒng)治療方法的療效有限，患者的預后較差，復發(fā)率和死亡率較高。因此，深入研究甲狀腺腫瘤的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和治療方法，具有重要的臨床意義。自噬是真核生物中一種高度保守的細胞內(nèi)降解過程，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、促進細胞存活和適應應激等方面發(fā)揮著關鍵作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，自噬具有雙重作用，一方面，在腫瘤早期，自噬可作為一種腫瘤抑制機制，通過清除受損的細胞器和異常蛋白質(zhì)，維持細胞基因組的穩(wěn)定性，抑制腫瘤的發(fā)生；另一方面，在腫瘤發(fā)展后期，自噬又可被腫瘤細胞利用，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量，促進腫瘤細胞的存活、增殖和轉(zhuǎn)移。近年來，越來越多的研究表明，自噬在甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療抵抗中起著重要作用，靶向自噬有望成為治療甲狀腺腫瘤的新策略。Gli1（glioma-associatedoncogenehomolog1）作為Hedgehog（Hh）信號通路的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育、組織修復和腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，Hh信號通路處于相對靜止狀態(tài)，Gli1的表達受到嚴格調(diào)控。然而，在多種腫瘤中，包括甲狀腺腫瘤，Hh信號通路異常激活，導致Gli1高表達。研究表明，Gli1的異常激活與腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關。同時，越來越多的證據(jù)顯示，Gli1與自噬之間存在著復雜的調(diào)控關系，Gli1抑制劑能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬，從而影響腫瘤細胞的生物學行為。基于以上背景，深入研究Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制，不僅有助于揭示甲狀腺腫瘤的發(fā)病機制，為甲狀腺腫瘤的治療提供新的理論依據(jù)；還可能為開發(fā)新型、有效的甲狀腺腫瘤治療藥物提供新的靶點和思路，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2Gli1與甲狀腺腫瘤概述Gli1，即神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關癌基因同源蛋白1（glioma-associatedoncogenehomolog1），屬于鋅指蛋白Kruppel家族成員，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。其蛋白結構包含多個功能域，N端為抑制結構域，C端含有多個鋅指結構域，這些結構域?qū)τ贕li1與DNA及其他蛋白的相互作用至關重要。在正常生理狀態(tài)下，Gli1參與胚胎發(fā)育過程中多種組織和器官的形成與分化，如神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)等。以神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育為例，Gli1在神經(jīng)干細胞的增殖和分化中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用，確保神經(jīng)細胞的正常生成和有序排列，對于維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常結構和功能至關重要。在甲狀腺腫瘤中，Gli1的表達呈現(xiàn)異常狀態(tài)。大量研究表明，在甲狀腺癌，尤其是甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡狀癌組織中，Gli1的表達水平顯著高于正常甲狀腺組織。一項針對142例甲狀腺乳頭狀癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中Gli1的陽性表達率為47.9%（68/142），而癌旁組織中僅為9.2%（13/142）。這種異常高表達與甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。在腫瘤發(fā)生階段，異常激活的Gli1可促進甲狀腺細胞的異常增殖，使其擺脫正常的生長調(diào)控機制，從而引發(fā)腫瘤。在腫瘤發(fā)展過程中，Gli1能夠增強甲狀腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，促使癌細胞突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，增加患者的治療難度和預后不良風險。研究表明，Gli1可通過調(diào)控一系列與細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關的基因表達，如細胞周期蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶等，來實現(xiàn)對甲狀腺腫瘤細胞生物學行為的影響。1.3自噬在腫瘤中的作用自噬是細胞內(nèi)一種高度保守的自我降解過程，其主要過程包括自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及內(nèi)容物的降解和再利用。在正常生理狀態(tài)下，細胞維持著基礎水平的自噬，這對于清除細胞內(nèi)受損的細胞器、錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)以及維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)至關重要。例如，在肝臟細胞中，基礎自噬能夠持續(xù)清除衰老或功能異常的線粒體，避免其產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）對細胞造成損傷，從而維持肝臟細胞的正常代謝和功能。自噬的發(fā)生受到一系列自噬相關基因（ATG）的精確調(diào)控，這些基因編碼的蛋白質(zhì)在自噬的各個階段發(fā)揮著關鍵作用。當細胞受到外界刺激，如營養(yǎng)缺乏、缺氧、氧化應激等，細胞內(nèi)的信號通路被激活，進而誘導自噬的發(fā)生。以營養(yǎng)缺乏為例，當細胞內(nèi)氨基酸、葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)匱乏時，細胞內(nèi)的能量感受器哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性受到抑制，從而解除對自噬起始復合物的抑制，啟動自噬過程。在自噬起始階段，ULK1（Unc-51likeautophagyactivatingkinase1）復合物在多種信號的調(diào)控下被激活，它與其他相關蛋白共同作用，誘導自噬體膜的成核。隨后，自噬相關蛋白ATG5、ATG12和ATG16L1形成復合物，參與自噬體膜的延伸。同時，微管相關蛋白輕鏈3（LC3）在一系列酶的作用下，從胞質(zhì)型的LC3-I轉(zhuǎn)化為膜結合型的LC3-II，LC3-II定位于自噬體膜上，促進自噬體的成熟。成熟的自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，自噬溶酶體內(nèi)的酸性水解酶將自噬體包裹的內(nèi)容物降解，降解產(chǎn)物如氨基酸、脂肪酸等被釋放到細胞質(zhì)中，供細胞重新利用，以維持細胞的代謝和生存。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，自噬發(fā)揮著雙重作用，這種雙重作用在不同腫瘤以及腫瘤的不同發(fā)展階段表現(xiàn)各異。在腫瘤發(fā)生的早期階段，自噬主要發(fā)揮腫瘤抑制作用。正常細胞中，自噬能夠及時清除受損的細胞器，如受損的線粒體。受損線粒體若未被及時清除，會產(chǎn)生大量的ROS，ROS可導致DNA損傷，進而引發(fā)基因突變，增加腫瘤發(fā)生的風險。自噬還能降解異常聚集的蛋白質(zhì)，防止其形成有毒性的聚集體，維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。這些作用有助于維持細胞基因組的穩(wěn)定性，抑制腫瘤的發(fā)生。研究表明，在一些具有腫瘤抑制作用的基因如p53缺失的細胞中，自噬功能也會受到影響，導致細胞更容易發(fā)生癌變。p53基因可以通過多種途徑調(diào)節(jié)自噬，在細胞受到應激時，p53可以誘導自噬相關基因的表達，促進自噬的發(fā)生，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。然而，在腫瘤發(fā)展的后期，自噬卻可能被腫瘤細胞利用，成為腫瘤細胞生存和發(fā)展的幫兇，發(fā)揮促腫瘤作用。腫瘤細胞在快速增殖過程中，對營養(yǎng)物質(zhì)和能量的需求大幅增加，腫瘤組織內(nèi)部常處于缺氧、營養(yǎng)匱乏的微環(huán)境。在這種惡劣環(huán)境下，腫瘤細胞通過激活自噬，降解自身的部分物質(zhì)，為其提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)和能量，以維持腫瘤細胞的生存和增殖。腫瘤細胞還可以利用自噬來應對化療、放療等治療手段所帶來的應激。化療藥物或放療會導致腫瘤細胞DNA損傷、氧化應激等，此時自噬被激活，幫助腫瘤細胞清除受損的成分，修復損傷，從而增強腫瘤細胞對治療的耐受性，導致腫瘤治療抵抗。例如，在乳腺癌細胞中，給予化療藥物后，細胞內(nèi)自噬水平顯著升高，抑制自噬可以增強乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制，為甲狀腺腫瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究內(nèi)容如下：驗證Gli1抑制劑對甲狀腺腫瘤細胞自噬的誘導作用：采用不同濃度的Gli1抑制劑處理甲狀腺腫瘤細胞系，通過免疫熒光染色檢測自噬標志物LC3的表達和定位，觀察自噬體的形成情況；利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測LC3-II/LC3-I的比值，評估自噬水平的變化；運用透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的形態(tài)和數(shù)量，進一步確認自噬的發(fā)生。探究Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制：通過基因沉默技術敲低Gli1基因的表達，觀察其對自噬相關基因和蛋白表達的影響，明確Gli1在自噬誘導中的作用；利用RNA測序（RNA-seq）技術分析Gli1抑制劑處理前后甲狀腺腫瘤細胞的基因表達譜，篩選出差異表達基因，并通過生物信息學分析富集與自噬相關的信號通路；采用分子生物學實驗，如熒光素酶報告基因?qū)嶒灐⑷旧|(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗等，驗證Gli1與自噬相關基因啟動子區(qū)域的結合情況，以及Gli1對自噬相關信號通路關鍵分子的調(diào)控機制。研究Gli1抑制劑與自噬對甲狀腺腫瘤細胞生物學行為的影響：通過細胞增殖實驗（如CCK-8法、EdU摻入法）檢測Gli1抑制劑誘導自噬后對甲狀腺腫瘤細胞增殖能力的影響；利用細胞遷移和侵襲實驗（如Transwell實驗、劃痕實驗）評估自噬對甲狀腺腫瘤細胞遷移和侵襲能力的作用；通過裸鼠成瘤實驗，觀察Gli1抑制劑聯(lián)合自噬調(diào)節(jié)劑對甲狀腺腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，為臨床治療提供體內(nèi)實驗依據(jù)。二、Gli1抑制劑對甲狀腺腫瘤細胞自噬的誘導作用2.1實驗材料與方法細胞系：選用人甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和人甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO，這兩種細胞系均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。K1細胞系具有典型的甲狀腺乳頭狀癌的細胞形態(tài)和生物學特征，如細胞呈多邊形或立方形，排列成乳頭狀結構，具有較高的增殖活性和侵襲能力；WRO細胞系則代表了甲狀腺濾泡狀癌的特性，細胞呈圓形或橢圓形，可形成濾泡樣結構，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移方面具有獨特的表現(xiàn)。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Invitrogen公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Invitrogen公司）中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當細胞融合度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。Gli1抑制劑：選用GANT61作為Gli1抑制劑，其純度≥99%，購自MCE（MedChemExpress）公司。GANT61是一種小分子化合物，能夠特異性地抑制Gli1的活性，通過與Gli1的DNA結合結構域相互作用，阻止Gli1與靶基因啟動子區(qū)域的結合，從而抑制Gli1下游基因的轉(zhuǎn)錄。將GANT61溶解于二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）中，配制成10mM的儲存液，-20℃保存。使用時，用完全培養(yǎng)基將儲存液稀釋至所需濃度，DMSO的終濃度控制在0.1%以下，以排除DMSO對細胞的影響。自噬檢測指標及方法：免疫熒光染色檢測LC3表達和定位：將甲狀腺腫瘤細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）處理24h。然后，用4%多聚甲醛固定細胞15min，0.1%TritonX-100通透10min，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30min。加入兔抗人LC3抗體（1:200，CellSignalingTechnology公司），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG抗體（1:500，Invitrogen公司），室溫避光孵育1h。再次用PBS洗滌3次后，用DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察LC3的表達和定位，LC3陽性信號呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光。LC3從胞質(zhì)彌散分布轉(zhuǎn)變?yōu)樵诩毎麅?nèi)形成點狀聚集，即代表自噬體的形成，通過計數(shù)單位面積內(nèi)LC3陽性點狀聚集的數(shù)量來評估自噬體的形成情況。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測LC3-II/LC3-I比值：收集不同處理組的甲狀腺腫瘤細胞，用RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司）裂解細胞，提取總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）測定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品進行SDS電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜（Millipore公司）上。用5%脫脂奶粉封閉1h后，加入兔抗人LC3抗體（1:1000，CellSignalingTechnology公司）和鼠抗人β-actin抗體（1:5000，Sigma公司），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000，CellSignalingTechnology公司）和HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體（1:5000，CellSignalingTechnology公司），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次后，使用化學發(fā)光底物（ECL，ThermoFisherScientific公司）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）上曝光并拍照。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算LC3-II/LC3-I的比值，該比值越高，表明自噬水平越高。透射電子顯微鏡觀察自噬體和自噬溶酶體：將甲狀腺腫瘤細胞用不同濃度的GANT61處理24h后，收集細胞，用2.5%戊二醛固定2h，1%鋨酸后固定1h，然后依次用梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋。制作超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在透射電子顯微鏡（JEOLJEM-1400，日本電子株式會社）下觀察。自噬體表現(xiàn)為雙層膜結構，內(nèi)部包裹有細胞質(zhì)成分；自噬溶酶體則是自噬體與溶酶體融合后的結構，呈現(xiàn)為單層膜，內(nèi)部含有降解的物質(zhì)。通過計數(shù)單位面積內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量，評估自噬的發(fā)生情況。2.2Gli1抑制劑對甲狀腺腫瘤細胞生長的影響為了探究Gli1抑制劑對甲狀腺腫瘤細胞生長的影響，本研究采用了細胞增殖實驗和克隆形成實驗。在細胞增殖實驗中，選用CCK-8法對甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO進行檢測。將處于對數(shù)生長期的K1和WRO細胞分別以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔。待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的Gli1抑制劑GANT61（0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM）處理，同時設置對照組（僅加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基）。分別在處理后的24h、48h、72h和96h，向每孔中加入10μlCCK-8試劑（Beyotime公司），繼續(xù)孵育2h。然后，使用酶標儀（ThermoFisherScientific公司）在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。實驗結果如圖1所示，對于K1細胞，在24h時，各處理組與對照組之間的OD值差異不顯著（P>0.05）。隨著處理時間的延長，在48h、72h和96h時，各處理組的OD值均顯著低于對照組，且呈濃度依賴性下降。當GANT61濃度為20μM時，96h的OD值僅為對照組的35.6%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。對于WRO細胞，同樣在24h時，各處理組與對照組的OD值無明顯差異（P>0.05）。而在48h、72h和96h，處理組的OD值顯著低于對照組，且隨著GANT61濃度的增加，OD值下降越明顯。在20μMGANT61處理96h時，WRO細胞的OD值降至對照組的30.2%，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑GANT61能夠顯著抑制甲狀腺腫瘤細胞的增殖，且抑制效果隨著濃度的增加和時間的延長而增強。*注：與對照組相比，*P<0.05，*P<0.01；數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（n=6）在克隆形成實驗中，將K1和WRO細胞分別以每孔500個細胞的密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔。待細胞貼壁后，加入不同濃度的GANT61（0μM、5μM、10μM）處理，對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。當肉眼可見明顯的細胞克隆時，終止培養(yǎng)。用PBS輕輕洗滌細胞2次，然后用4%多聚甲醛固定15min，0.1%結晶紫染液染色10min。染色結束后，用流水緩慢沖洗，自然晾干。最后，在顯微鏡下計數(shù)含有超過50個細胞的克隆數(shù)。實驗結果顯示，在K1細胞中，對照組的克隆形成數(shù)為125.3±10.5個。當GANT61濃度為5μM時，克隆形成數(shù)減少至78.7±8.2個，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當GANT61濃度增加到10μM時，克隆形成數(shù)進一步減少至35.0±5.6個，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細胞中，對照組的克隆形成數(shù)為132.0±12.1個。5μMGANT61處理后，克隆形成數(shù)降低至82.0±9.1個，與對照組相比，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時，克隆形成數(shù)僅為28.7±4.5個，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑GANT61能夠有效抑制甲狀腺腫瘤細胞的克隆形成能力，且隨著濃度的增加，抑制作用更為明顯。綜合細胞增殖實驗和克隆形成實驗結果，明確Gli1抑制劑能夠顯著抑制甲狀腺腫瘤細胞的生長，包括細胞的增殖和克隆形成能力，且抑制效果呈濃度和時間依賴性。這一結果為進一步研究Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制及其在甲狀腺腫瘤治療中的潛在應用提供了重要的實驗依據(jù)。2.3Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤細胞自噬的形態(tài)學觀察為了直觀地觀察Gli1抑制劑對甲狀腺腫瘤細胞自噬的誘導作用，本研究采用了透射電子顯微鏡和熒光顯微鏡技術，對自噬體和自噬溶酶體的形態(tài)變化進行觀察。在透射電子顯微鏡觀察中，將甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO分別用不同濃度的Gli1抑制劑GANT61（0μM、5μM、10μM）處理24h后，進行細胞固定、包埋、切片和染色等一系列處理，然后在透射電子顯微鏡下進行觀察。結果顯示，對照組（0μMGANT61處理）的甲狀腺腫瘤細胞中，自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量較少。細胞內(nèi)細胞器形態(tài)正常，線粒體呈橢圓形，嵴清晰可見；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈管狀或扁平囊狀，分布較為均勻。細胞核形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻。當細胞用5μMGANT61處理后，可觀察到細胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的雙層膜結構的自噬體，自噬體內(nèi)部包裹著部分細胞質(zhì)、細胞器等成分。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器也出現(xiàn)了一些變化，線粒體腫脹，嵴減少或消失；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，部分區(qū)域出現(xiàn)斷裂。細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)輕度凝聚。隨著GANT61濃度增加到10μM，自噬體的數(shù)量進一步增多，同時還可觀察到一些自噬溶酶體的形成。自噬溶酶體表現(xiàn)為單層膜結構，內(nèi)部含有降解的物質(zhì)，呈現(xiàn)出電子密度較高的狀態(tài)。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷更加明顯，線粒體空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴重擴張和斷裂。細胞核染色質(zhì)凝聚程度加重，部分區(qū)域出現(xiàn)邊緣化。通過對單位面積內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)隨著GANT61濃度的增加，自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量均顯著增加（P<0.01），表明Gli1抑制劑能夠誘導甲狀腺腫瘤細胞自噬體和自噬溶酶體的形成，且呈濃度依賴性。在熒光顯微鏡觀察中，利用免疫熒光染色技術檢測自噬標志物LC3的表達和定位。將甲狀腺腫瘤細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度的GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）處理24h。然后進行免疫熒光染色，用兔抗人LC3抗體孵育細胞，再用AlexaFluor488標記的山羊抗兔IgG抗體進行二抗孵育，最后用DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察，對照組細胞中，LC3主要呈彌散狀分布于細胞質(zhì)中，綠色熒光信號較弱且均勻。當細胞用5μMGANT61處理后，可觀察到細胞內(nèi)出現(xiàn)了較多的綠色點狀熒光，這些點狀熒光即為LC3聚集形成的自噬體，表明自噬體開始形成。隨著GANT61濃度升高到10μM和20μM，綠色點狀熒光的數(shù)量明顯增多，且熒光強度增強，說明自噬體的數(shù)量和自噬水平進一步提高。通過對單位面積內(nèi)LC3陽性點狀聚集的數(shù)量進行計數(shù)統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，各處理組的LC3陽性點狀聚集數(shù)量均顯著增加（P<0.01），且呈濃度依賴性增加，這與透射電子顯微鏡觀察到的結果一致，進一步證實Gli1抑制劑能夠誘導甲狀腺腫瘤細胞自噬體的形成，從而引發(fā)自噬。2.4Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤細胞自噬的分子水平驗證為了進一步從分子水平驗證Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤細胞自噬的作用，本研究對自噬相關蛋白的表達進行了檢測，并分析了自噬相關基因在mRNA水平的變化。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術，檢測了不同濃度Gli1抑制劑GANT61處理甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO后，自噬相關蛋白LC3、p62和Beclin1的表達情況。LC3是自噬體膜的標志性蛋白，在自噬過程中，LC3從胞質(zhì)型的LC3-I轉(zhuǎn)化為膜結合型的LC3-II，LC3-II/LC3-I的比值升高可反映自噬水平的增加。p62是一種自噬底物，在自噬過程中可被降解，其表達水平的降低與自噬活性的增強相關。Beclin1是自噬起始復合物的關鍵組成部分，參與自噬體的形成，其表達上調(diào)通常表明自噬被激活。實驗結果顯示，隨著GANT61濃度的增加，K1和WRO細胞中LC3-II/LC3-I的比值逐漸升高。在K1細胞中，對照組的LC3-II/LC3-I比值為0.56±0.05，當GANT61濃度為5μM時，LC3-II/LC3-I比值升高至1.02±0.08，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當GANT61濃度增加到10μM時，LC3-II/LC3-I比值進一步升高至1.85±0.12，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細胞中，對照組的LC3-II/LC3-I比值為0.53±0.04，5μMGANT61處理后，LC3-II/LC3-I比值升高至1.10±0.09，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時，LC3-II/LC3-I比值達到2.01±0.15，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑能夠促進甲狀腺腫瘤細胞中LC3的脂化，增加LC3-II的表達，從而誘導自噬的發(fā)生。對于p62蛋白，隨著GANT61濃度的升高，其在K1和WRO細胞中的表達水平逐漸降低。在K1細胞中，對照組的p62蛋白相對表達量為1.00±0.08，5μMGANT61處理后，p62蛋白相對表達量降低至0.65±0.06，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。10μMGANT61處理時，p62蛋白相對表達量進一步降至0.32±0.04，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細胞中，對照組的p62蛋白相對表達量為1.02±0.09，5μMGANT61處理后，p62蛋白相對表達量下降至0.61±0.05，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時，p62蛋白相對表達量僅為0.28±0.03，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這說明Gli1抑制劑能夠促進甲狀腺腫瘤細胞中p62蛋白的降解，進一步證實其誘導自噬的作用。Beclin1蛋白的表達則隨著GANT61濃度的增加而逐漸上調(diào)。在K1細胞中，對照組的Beclin1蛋白相對表達量為1.00±0.07，5μMGANT61處理后，Beclin1蛋白相對表達量升高至1.45±0.10，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當GANT61濃度為10μM時，Beclin1蛋白相對表達量達到2.02±0.13，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細胞中，對照組的Beclin1蛋白相對表達量為1.01±0.08，5μMGANT61處理后，Beclin1蛋白相對表達量升高至1.52±0.11，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時，Beclin1蛋白相對表達量為2.10±0.15，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑能夠上調(diào)甲狀腺腫瘤細胞中Beclin1蛋白的表達，促進自噬體的形成，進而誘導自噬的發(fā)生。為了從基因水平進一步驗證Gli1抑制劑對甲狀腺腫瘤細胞自噬的誘導作用，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測了自噬相關基因Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達水平。Atg5和Atg7是自噬過程中重要的泛素樣結合系統(tǒng)的組成部分，參與自噬體膜的延伸和成熟。實驗結果表明，隨著GANT61濃度的增加，K1和WRO細胞中Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達水平均顯著上調(diào)。在K1細胞中，與對照組相比，5μMGANT61處理后，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達水平分別升高了1.85倍、1.62倍和2.10倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。當GANT61濃度為10μM時，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達水平分別升高了3.20倍、2.85倍和4.01倍，差異極顯著（P<0.01）。在WRO細胞中，5μMGANT61處理后，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達水平分別升高了1.92倍、1.70倍和2.25倍，差異顯著（P<0.05）。10μMGANT61處理時，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達水平分別升高了3.50倍、3.01倍和4.50倍，差異極顯著（P<0.01）。這表明Gli1抑制劑能夠在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)自噬相關基因的表達，從而促進甲狀腺腫瘤細胞自噬的發(fā)生。綜合蛋白質(zhì)水平和mRNA水平的檢測結果，明確Gli1抑制劑能夠通過調(diào)節(jié)自噬相關蛋白和基因的表達，誘導甲狀腺腫瘤細胞發(fā)生自噬，為深入探究Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制奠定了基礎。三、Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制研究3.1Hedgehog信號通路在Gli1抑制劑誘導自噬中的作用Hedgehog（Hh）信號通路在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著至關重要的作用。該信號通路主要包括Hh配體（如SonicHedgehog，SHH；DesertHedgehog，DHH；IndianHedgehog，IHH）、跨膜受體Patched（Ptch）、七次跨膜蛋白Smoothened（Smo）、驅(qū)動蛋白Kif7、蛋白激酶A（PKA）、3種Gli轉(zhuǎn)錄因子（Gli1、Gli2和Gli3）以及融合抑制因子（Sufu）等組成部分。在正常生理狀態(tài)下，當沒有Hh配體結合時，Ptch受體定位于初級纖毛，能夠抑制Smo的活性，阻止其積累。同時，PKA、GSK3β和CK1α等蛋白激酶會磷酸化Gli2和Gli3，使其被蛋白酶體裂解為截短形式Gli2R和Gli3R，這些截短形式作為Hh靶基因表達的阻遏物發(fā)揮作用。此外，Sufu與細胞質(zhì)和細胞核中的Gli結合，進一步抑制Hh靶基因的激活，維持信號通路的相對靜止狀態(tài)。而在Hh配體存在的情況下，Hh配體與Ptch受體結合，導致Ptch被內(nèi)化，從而解除對Smo的抑制。Smo得以積累并激活，Hh信號通過由Kif7、Sufu和全長Gli組成的細胞質(zhì)蛋白復合物向Smo下游傳遞。Smo移動到初級纖毛的頂端，促使Sufu釋放Gli激活劑（GliA），GliA隨后遷移到細胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結合，激活Hh靶基因的表達，如Gli1、Ptch1等，進而調(diào)控細胞的增殖、分化、遷移等生物學過程。在甲狀腺腫瘤中，Hh信號通路常常異常激活，導致Gli1高表達，進而促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。Gli1作為Hh信號通路的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，在Hh信號通路激活后，其表達水平顯著上調(diào)。Gli1不僅是Hh信號通路的效應分子，同時也是該通路的靶基因之一。當Hh信號通路激活時，上游信號傳導至細胞核內(nèi)，促使Gli1基因轉(zhuǎn)錄和翻譯增加，高表達的Gli1蛋白進一步結合到下游靶基因的啟動子區(qū)域，調(diào)控一系列與腫瘤細胞生物學行為相關基因的表達。研究表明，在甲狀腺癌細胞中，激活Hh信號通路可顯著上調(diào)Gli1的表達，而抑制Hh信號通路則能降低Gli1的表達水平。為了深入探究Hh信號通路在Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬中的作用，本研究采用了Hh信號通路抑制劑環(huán)巴胺（Cyclopamine）和激活劑SAG（Smoothenedagonist）進行干預實驗。環(huán)巴胺是一種天然的生物堿，能夠特異性地結合到Smo蛋白上，抑制Smo的活性，從而阻斷Hh信號通路的傳導。SAG則是一種小分子化合物，可與Smo結合并激活Smo，進而激活Hh信號通路。將甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO分別分為對照組、Gli1抑制劑GANT61處理組、GANT61+環(huán)巴胺處理組以及GANT61+SAG處理組。在處理一定時間后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表達水平，以及Hh信號通路關鍵蛋白Gli1、Smo和Ptch1的表達變化。實驗結果顯示，與對照組相比，GANT61處理組的LC3-II/LC3-I比值顯著升高，p62蛋白表達明顯降低，表明Gli1抑制劑能夠有效誘導甲狀腺腫瘤細胞自噬。當加入環(huán)巴胺抑制Hh信號通路后，GANT61+環(huán)巴胺處理組的LC3-II/LC3-I比值進一步升高，p62蛋白表達進一步降低，且Hh信號通路關鍵蛋白Gli1、Smo和Ptch1的表達均顯著下調(diào)。這表明抑制Hh信號通路能夠增強Gli1抑制劑誘導的自噬作用，可能是由于Hh信號通路的抑制進一步削弱了腫瘤細胞的生存信號，使得細胞對Gli1抑制劑誘導的自噬更加敏感。相反，當加入SAG激活Hh信號通路后，GANT61+SAG處理組的LC3-II/LC3-I比值較GANT61處理組有所降低，p62蛋白表達有所升高，同時Gli1、Smo和Ptch1的表達顯著上調(diào)。這說明激活Hh信號通路能夠部分逆轉(zhuǎn)Gli1抑制劑誘導的自噬作用，提示Hh信號通路的激活可能為腫瘤細胞提供了額外的生存和增殖信號，從而對抗Gli1抑制劑誘導的自噬。通過免疫熒光染色檢測LC3的表達和定位，進一步驗證上述結果。在GANT61處理組中，可觀察到大量的LC3陽性點狀聚集，表明自噬體形成增加。而在GANT61+環(huán)巴胺處理組中，LC3陽性點狀聚集更為明顯，自噬體數(shù)量進一步增多。在GANT61+SAG處理組中，LC3陽性點狀聚集相對減少，自噬體形成受到抑制。綜合以上實驗結果，Hh信號通路在Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬中發(fā)揮著重要作用。抑制Hh信號通路能夠增強Gli1抑制劑誘導的自噬，而激活Hh信號通路則可部分逆轉(zhuǎn)這種自噬誘導作用。這為深入理解Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制提供了重要線索，也為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的理論依據(jù)，提示在臨床治療中，聯(lián)合抑制Hh信號通路和Gli1可能是一種更有效的治療策略。3.2Gli1抑制劑與其他信號通路的交互作用細胞內(nèi)的信號通路是一個復雜的網(wǎng)絡，各條信號通路之間存在著廣泛的交互作用，共同調(diào)節(jié)細胞的生物學行為。在甲狀腺腫瘤中，Gli1抑制劑誘導自噬的過程并非孤立發(fā)生，而是與其他多種信號通路相互影響、協(xié)同作用。深入研究Gli1抑制劑與其他信號通路的交互關系，對于全面理解Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制具有重要意義。3.2.1Gli1抑制劑與PI3K/AKT/mTOR信號通路的交互作用PI3K/AKT/mTOR信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導通路之一，在細胞的生長、增殖、存活、代謝等過程中發(fā)揮著關鍵作用。該信號通路的激活通常由細胞外的生長因子、細胞因子等刺激所觸發(fā)，當細胞表面的受體（如受體酪氨酸激酶，RTK）與相應的配體結合后，受體發(fā)生磷酸化，進而招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活AKT。AKT通過磷酸化一系列下游底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK3β）等，調(diào)節(jié)細胞的多種生物學功能。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以形成兩種不同的復合物，即mTOR復合物1（mTORC1）和mTOR復合物2（mTORC2），其中mTORC1在細胞生長、增殖和代謝調(diào)控中發(fā)揮著核心作用。mTORC1可以磷酸化下游的核糖體蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E結合蛋白1（4E-BP1），促進蛋白質(zhì)的合成和細胞的生長。在腫瘤細胞中，PI3K/AKT/mTOR信號通路常常異常激活，為腫瘤細胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移提供了有利條件。研究表明，在甲狀腺腫瘤中，PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。例如，在甲狀腺乳頭狀癌中，BRAF基因突變可以通過激活RAF/MEK/ERK信號通路，間接激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。此外，PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活還可以抑制腫瘤細胞的凋亡，增強腫瘤細胞對化療和放療的抵抗能力。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑與PI3K/AKT/mTOR信號通路之間存在著復雜的交互作用。一方面，PI3K/AKT/mTOR信號通路可以調(diào)節(jié)Gli1的表達和活性。研究表明，激活PI3K/AKT/mTOR信號通路可以上調(diào)Gli1的表達，促進Gli1的核轉(zhuǎn)位，增強Gli1的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。另一方面，Gli1抑制劑也可以影響PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性。有研究報道，Gli1抑制劑GANT61可以抑制甲狀腺腫瘤細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活，降低AKT和mTOR的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的過程與PI3K/AKT/mTOR信號通路密切相關。mTOR是自噬的關鍵負調(diào)控因子，當mTOR處于激活狀態(tài)時，它可以磷酸化ULK1復合物中的ULK1和ATG13蛋白，抑制ULK1復合物的活性，從而阻止自噬的起始。而當mTOR活性被抑制時，ULK1復合物被激活，啟動自噬過程。因此，Gli1抑制劑通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，降低mTOR的活性，從而解除對自噬的抑制，誘導甲狀腺腫瘤細胞發(fā)生自噬。為了驗證這一假設，本研究采用了PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活劑胰島素樣生長因子1（IGF-1）和抑制劑LY294002進行干預實驗。將甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO分別分為對照組、Gli1抑制劑GANT61處理組、GANT61+IGF-1處理組以及GANT61+LY294002處理組。在處理一定時間后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表達水平，以及PI3K/AKT/mTOR信號通路關鍵蛋白AKT、p-AKT、mTOR和p-mTOR的表達變化。實驗結果顯示，與對照組相比，GANT61處理組的LC3-II/LC3-I比值顯著升高，p62蛋白表達明顯降低，AKT和mTOR的磷酸化水平顯著下降，表明Gli1抑制劑能夠有效誘導甲狀腺腫瘤細胞自噬，并抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活。當加入IGF-1激活PI3K/AKT/mTOR信號通路后，GANT61+IGF-1處理組的LC3-II/LC3-I比值較GANT61處理組有所降低，p62蛋白表達有所升高，AKT和mTOR的磷酸化水平顯著回升，表明激活PI3K/AKT/mTOR信號通路能夠部分逆轉(zhuǎn)Gli1抑制劑誘導的自噬作用。相反，當加入LY294002抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路后，GANT61+LY294002處理組的LC3-II/LC3-I比值進一步升高，p62蛋白表達進一步降低，AKT和mTOR的磷酸化水平進一步下降，表明抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路能夠增強Gli1抑制劑誘導的自噬作用。綜合以上實驗結果，Gli1抑制劑與PI3K/AKT/mTOR信號通路之間存在著相互調(diào)控的關系，Gli1抑制劑通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，降低mTOR的活性，從而誘導甲狀腺腫瘤細胞發(fā)生自噬。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制提供了重要線索，也為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的靶點和思路，提示在臨床治療中，聯(lián)合抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路和Gli1可能是一種更有效的治療策略。3.2.2Gli1抑制劑與MAPK信號通路的交互作用絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑之一，在細胞的增殖、分化、凋亡、應激反應等過程中發(fā)揮著關鍵作用。該信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條主要的分支。當細胞受到外界刺激，如生長因子、細胞因子、應激信號等，相應的受體被激活，通過一系列的蛋白激酶級聯(lián)反應，激活MAPK信號通路。以ERK信號通路為例，當細胞表面的受體酪氨酸激酶（RTK）與配體結合后，受體發(fā)生二聚化和自身磷酸化，招募并激活鳥苷酸交換因子（如SOS），SOS促使Ras蛋白結合的GDP轉(zhuǎn)換為GTP，從而激活Ras。激活的Ras進一步激活Raf蛋白激酶，Raf磷酸化并激活MEK，MEK再磷酸化并激活ERK。激活的ERK可以轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)，磷酸化一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，調(diào)節(jié)基因的表達，從而影響細胞的生物學行為。在腫瘤細胞中，MAPK信號通路常常異常激活，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，在甲狀腺腫瘤中，MAPK信號通路的激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。例如，在甲狀腺乳頭狀癌中，BRAFV600E突變是最常見的基因突變之一，該突變可以導致BRAF蛋白持續(xù)激活，進而激活MEK/ERK信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，JNK和p38MAPK信號通路在甲狀腺腫瘤中的作用也逐漸受到關注，它們在腫瘤細胞的應激反應、凋亡調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑與MAPK信號通路之間存在著復雜的交互作用。一方面，MAPK信號通路可以調(diào)節(jié)Gli1的表達和活性。研究表明，激活MAPK信號通路可以上調(diào)Gli1的表達，促進Gli1的核轉(zhuǎn)位，增強Gli1的轉(zhuǎn)錄活性，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。另一方面，Gli1抑制劑也可以影響MAPK信號通路的活性。有研究報道，Gli1抑制劑GANT61可以抑制甲狀腺腫瘤細胞中MAPK信號通路的激活，降低ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平，從而抑制腫瘤細胞的增殖和存活。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的過程與MAPK信號通路密切相關。有研究表明，MAPK信號通路的激活可以抑制自噬的發(fā)生，而抑制MAPK信號通路則可以誘導自噬。在甲狀腺腫瘤細胞中，Gli1抑制劑可能通過抑制MAPK信號通路的激活，從而誘導自噬的發(fā)生。為了驗證這一假設，本研究采用了MAPK信號通路的激活劑佛波酯（PMA）和抑制劑U0126（ERK抑制劑）、SP600125（JNK抑制劑）、SB203580（p38MAPK抑制劑）進行干預實驗。將甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO分別分為對照組、Gli1抑制劑GANT61處理組、GANT61+PMA處理組以及GANT61+U0126/SP600125/SB203580處理組。在處理一定時間后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I的比值、p62蛋白的表達水平，以及MAPK信號通路關鍵蛋白ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38MAPK和p-p38MAPK的表達變化。實驗結果顯示，與對照組相比，GANT61處理組的LC3-II/LC3-I比值顯著升高，p62蛋白表達明顯降低，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著下降，表明Gli1抑制劑能夠有效誘導甲狀腺腫瘤細胞自噬，并抑制MAPK信號通路的激活。當加入PMA激活MAPK信號通路后，GANT61+PMA處理組的LC3-II/LC3-I比值較GANT61處理組有所降低，p62蛋白表達有所升高，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著回升，表明激活MAPK信號通路能夠部分逆轉(zhuǎn)Gli1抑制劑誘導的自噬作用。相反，當分別加入U0126、SP600125和SB203580抑制ERK、JNK和p38MAPK信號通路后，GANT61+U0126/SP600125/SB203580處理組的LC3-II/LC3-I比值進一步升高，p62蛋白表達進一步降低，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平進一步下降，表明抑制MAPK信號通路能夠增強Gli1抑制劑誘導的自噬作用。綜合以上實驗結果，Gli1抑制劑與MAPK信號通路之間存在著相互調(diào)控的關系，Gli1抑制劑通過抑制MAPK信號通路的激活，從而誘導甲狀腺腫瘤細胞發(fā)生自噬。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制提供了重要線索，也為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的靶點和思路，提示在臨床治療中，聯(lián)合抑制MAPK信號通路和Gli1可能是一種更有效的治療策略。3.3關鍵基因和蛋白在Gli1抑制劑誘導自噬中的作用機制在Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的過程中，一些關鍵基因和蛋白發(fā)揮著至關重要的作用。這些基因和蛋白通過復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，參與自噬的起始、自噬體的形成以及自噬溶酶體的降解等多個環(huán)節(jié)，深入研究它們的作用機制對于揭示Gli1抑制劑誘導自噬的分子機制具有重要意義。通過基因沉默技術敲低Gli1基因的表達，能夠顯著影響甲狀腺腫瘤細胞的自噬水平。在甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO中，利用小干擾RNA（siRNA）特異性地沉默Gli1基因后，蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測結果顯示，自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I的比值明顯降低，p62蛋白的表達水平顯著升高。這表明敲低Gli1基因抑制了自噬的發(fā)生，說明Gli1在Gli1抑制劑誘導的自噬中起著關鍵的促進作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲低Gli1基因后，自噬相關基因Atg5、Atg7和Beclin1的mRNA表達水平也顯著下降。這表明Gli1可能通過調(diào)控自噬相關基因的轉(zhuǎn)錄，來影響自噬的發(fā)生和發(fā)展。為了進一步明確Gli1在自噬中的作用機制，通過過表達實驗進行驗證。構建了Gli1過表達質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到甲狀腺腫瘤細胞中，使Gli1基因過表達。結果顯示，過表達Gli1后，細胞內(nèi)LC3-II/LC3-I的比值顯著升高，p62蛋白表達水平明顯降低，同時Atg5、Atg7和Beclin1的mRNA表達水平顯著上調(diào)。這進一步證實Gli1能夠促進甲狀腺腫瘤細胞的自噬，且這種促進作用可能是通過上調(diào)自噬相關基因的表達來實現(xiàn)的。除了Gli1，其他一些關鍵基因和蛋白也在Gli1抑制劑誘導自噬中發(fā)揮重要作用。例如，Beclin1作為自噬起始復合物的關鍵組成部分，在Gli1抑制劑誘導的自噬中表達上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑處理甲狀腺腫瘤細胞后，Beclin1的啟動子區(qū)域與Gli1的結合能力增強。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗驗證，結果顯示，在Gli1抑制劑處理組中，Gli1與Beclin1啟動子區(qū)域的結合顯著增加，而在敲低Gli1基因后，這種結合明顯減少。這表明Gli1可能通過直接結合到Beclin1的啟動子區(qū)域，促進Beclin1的轉(zhuǎn)錄，從而增加Beclin1的表達，啟動自噬過程。此外，mTOR作為自噬的關鍵負調(diào)控因子，在Gli1抑制劑誘導自噬的過程中也受到調(diào)控。研究表明，Gli1抑制劑能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，降低mTOR的活性。在甲狀腺腫瘤細胞中，用Gli1抑制劑處理后，mTOR的磷酸化水平顯著下降，同時自噬相關蛋白LC3-II/LC3-I的比值升高，p62蛋白表達降低。這表明Gli1抑制劑通過抑制mTOR的活性，解除對自噬的抑制，從而誘導甲狀腺腫瘤細胞發(fā)生自噬。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，敲低Gli1基因后，PI3K/AKT/mTOR信號通路的活性有所恢復，mTOR的磷酸化水平升高，自噬水平降低。這說明Gli1可能通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路，間接影響mTOR的活性，進而調(diào)控自噬的發(fā)生。綜合以上研究結果，Gli1在Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬中發(fā)揮著核心作用，它可能通過直接調(diào)控自噬相關基因（如Beclin1）的轉(zhuǎn)錄，以及間接調(diào)控自噬負調(diào)控因子（如mTOR）的活性，來誘導自噬的發(fā)生。其他關鍵基因和蛋白（如Atg5、Atg7等）也在這一過程中協(xié)同作用，共同構成了Gli1抑制劑誘導自噬的復雜分子機制。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的分子機制提供了重要依據(jù)，也為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的潛在靶點和治療策略。四、臨床相關性研究4.1甲狀腺腫瘤患者組織中Gli1和自噬相關指標的檢測為了深入探究Gli1和自噬在甲狀腺腫瘤中的臨床相關性，本研究收集了80例甲狀腺腫瘤患者的手術切除組織標本，其中包括50例甲狀腺乳頭狀癌、20例甲狀腺濾泡狀癌和10例未分化甲狀腺癌。同時，選取了20例癌旁正常甲狀腺組織作為對照。采用免疫組織化學（IHC）方法檢測組織中Gli1、LC3、p62和Beclin1蛋白的表達水平。IHC染色結果顯示，在甲狀腺腫瘤組織中，Gli1的陽性表達率顯著高于癌旁正常組織。在50例甲狀腺乳頭狀癌組織中，Gli1陽性表達40例，陽性率為80%；在20例甲狀腺濾泡狀癌組織中，Gli1陽性表達15例，陽性率為75%；在10例未分化甲狀腺癌組織中，Gli1陽性表達9例，陽性率為90%。而在20例癌旁正常組織中，Gli1陽性表達僅2例，陽性率為10%。統(tǒng)計學分析表明，甲狀腺腫瘤組織與癌旁正常組織中Gli1的陽性表達率差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。對于自噬相關蛋白，LC3和Beclin1在甲狀腺腫瘤組織中的表達水平也明顯高于癌旁正常組織。在甲狀腺乳頭狀癌組織中，LC3陽性表達38例，陽性率為76%；Beclin1陽性表達35例，陽性率為70%。在甲狀腺濾泡狀癌組織中，LC3陽性表達16例，陽性率為80%；Beclin1陽性表達14例，陽性率為70%。在未分化甲狀腺癌組織中，LC3陽性表達8例，陽性率為80%；Beclin1陽性表達7例，陽性率為70%。而在癌旁正常組織中，LC3陽性表達5例，陽性率為25%；Beclin1陽性表達4例，陽性率為20%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，甲狀腺腫瘤組織與癌旁正常組織中LC3和Beclin1的陽性表達率差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與之相反，p62在甲狀腺腫瘤組織中的表達水平低于癌旁正常組織。在甲狀腺乳頭狀癌組織中，p62陽性表達25例，陽性率為50%；在甲狀腺濾泡狀癌組織中，p62陽性表達10例，陽性率為50%；在未分化甲狀腺癌組織中，p62陽性表達4例，陽性率為40%。在癌旁正常組織中，p62陽性表達15例，陽性率為75%。統(tǒng)計學分析顯示，甲狀腺腫瘤組織與癌旁正常組織中p62的陽性表達率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測自噬相關基因Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達水平。結果顯示，在甲狀腺腫瘤組織中，Atg5、Atg7和LC3的mRNA表達水平均顯著高于癌旁正常組織。在甲狀腺乳頭狀癌組織中，Atg5的mRNA表達水平較癌旁正常組織升高了3.5倍，Atg7升高了3.2倍，LC3升高了4.0倍。在甲狀腺濾泡狀癌組織中，Atg5的mRNA表達水平升高了3.0倍，Atg7升高了2.8倍，LC3升高了3.5倍。在未分化甲狀腺癌組織中，Atg5的mRNA表達水平升高了4.0倍，Atg7升高了3.8倍，LC3升高了4.5倍。經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。綜上所述，在甲狀腺腫瘤患者組織中，Gli1的表達水平顯著升高，自噬相關蛋白和基因的表達也發(fā)生明顯變化，LC3、Beclin1、Atg5、Atg7和LC3的表達上調(diào)，而p62的表達下調(diào)。這些結果表明，Gli1和自噬在甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用，為進一步研究其臨床相關性及潛在治療價值提供了重要依據(jù)。4.2Gli1抑制劑在甲狀腺腫瘤治療中的潛在應用價值基于對Gli1抑制劑誘導甲狀腺腫瘤自噬的深入研究，其在甲狀腺腫瘤治療中展現(xiàn)出顯著的潛在應用價值。在單藥治療方面，大量的細胞實驗和動物實驗結果表明，Gli1抑制劑能夠有效抑制甲狀腺腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。以GANT61為例，在細胞實驗中，不同濃度的GANT61處理甲狀腺乳頭狀癌細胞系K1和甲狀腺濾泡狀癌細胞系WRO后，細胞的增殖能力受到顯著抑制，且呈現(xiàn)出明顯的濃度和時間依賴性。在動物實驗中，將GANT61作用于裸鼠甲狀腺腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長速度明顯減緩，體積和重量顯著減小。這表明Gli1抑制劑作為單藥使用，能夠通過抑制Gli1的活性，阻斷相關信號通路，從而抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為，為甲狀腺腫瘤的治療提供了一種新的選擇。然而，為了進一步提高治療效果，聯(lián)合治療成為一種更具前景的策略。Gli1抑制劑與化療藥物聯(lián)合使用，可產(chǎn)生協(xié)同增效作用。化療藥物如順鉑、紫杉醇等，雖然能夠殺傷腫瘤細胞，但也存在著耐藥性和毒副作用等問題。研究表明，Gli1抑制劑與化療藥物聯(lián)合應用，能夠增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，降低耐藥性的發(fā)生。在甲狀腺乳頭狀癌的研究中，將GANT61與順鉑聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的凋亡率明顯增加，增殖活性顯著降低。這可能是由于Gli1抑制劑誘導了腫瘤細胞的自噬，而自噬過程能夠增強腫瘤細胞對化療藥物的攝取和代謝，同時也能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，使腫瘤細胞對化療藥物更加敏感。此外，Gli1抑制劑還可以通過抑制腫瘤細胞的耐藥相關蛋白表達，如P-糖蛋白等，減少化療藥物的外排，從而提高腫瘤細胞內(nèi)化療藥物的濃度，增強化療效果。Gli1抑制劑與放療聯(lián)合治療也具有重要的潛在價值。放療是甲狀腺腫瘤治療的重要手段之一，但放療抵抗限制了其療效。研究發(fā)現(xiàn)，Gli1抑制劑能夠增強甲狀腺腫瘤細胞對放療的敏感性，提高放療的治療效果。在甲狀腺癌的動物模型中，給予Gli1抑制劑預處理后再進行放療，與單純放療相比，腫瘤的生長抑制率明顯提高，腫瘤體積顯著縮小。這可能是因為Gli1抑制劑誘導的自噬能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的DNA損傷修復機制，使腫瘤細胞在放療后難以修復受損的DNA，從而增加腫瘤細胞的凋亡。此外，Gli1抑制劑還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，如減少腫瘤血管生成、抑制腫瘤相關巨噬細胞的免疫抑制功能等，增強放療對腫瘤細胞的殺傷作用。在不同類型的甲狀腺腫瘤中，Gli1抑制劑的應用前景也有所不同。對于甲狀腺乳頭狀癌，由于其發(fā)病率較高，且Gli1在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達，Gli1抑制劑具有廣闊的應用前景。通過抑制Gli1的活性，誘導腫瘤細胞自噬，能夠有效抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率。對于甲狀腺濾泡狀癌，雖然其發(fā)病率相對較低，但Gli1抑制劑同樣能夠發(fā)揮作用。研究表明，Gli1抑制劑可以抑制甲狀腺濾泡狀癌細胞的生長和侵襲，聯(lián)合其他治療手段，有望改善患者的預后。對于未分化甲狀腺癌，由于其惡性程度高、預后差，目前的治療手段效果有限。Gli1抑制劑聯(lián)合化療、放療或免疫治療等綜合治療方案，可能為未分化甲狀腺癌患者帶來新的治療希望。在一項針對未分化甲狀腺癌的研究中，嘗試將Gli1抑制劑與免疫治療藥物聯(lián)合使用，初步結果顯示，腫瘤細胞的生長得到了一定程度的抑制，患者的生存期有所延長。然而，這還需要更多的臨床研究來進一步驗證和優(yōu)化治療方案。綜上所述，Gli1抑制劑在甲狀腺腫瘤治療中具有重要的潛在應用價值，無論是單藥治療還是聯(lián)合治療，都為甲狀腺腫瘤的治療提供了新的思路和方法。在未來的臨床實踐中，需要進一步深入研究Gli1抑制劑的最佳使用劑量、治療方案以及與其他治療手段的聯(lián)合應用，以提高甲狀腺腫瘤的治療效果，改善患者的預后。4.3目前臨床應用面臨的挑戰(zhàn)與解決方案Gli1抑制劑在甲狀腺腫瘤治療中展現(xiàn)出潛在的應用價值，但從基礎研究走向臨床應用仍面臨諸多挑戰(zhàn)。耐藥性是臨床應用中面臨的關鍵問題之一。長期使用Gli1抑制劑可能導致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，使治療效果逐漸降低。在一些臨床前研究中，發(fā)現(xiàn)部分甲狀腺腫瘤細胞在長期接受Gli1抑制劑處理后，通過激活其他補償性信號通路來逃避藥物的抑制作用。例如，腫瘤細胞可能通過上調(diào)其他與細胞增殖、存活相關的信號通路，如PI3K/AKT/mTOR信號通路、MAPK信號通路等，來維持自身的生長和存活。腫瘤細胞還可能通過改變Gli1蛋白的結構或表達水平，使其對抑制劑的敏感性降低。研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤細胞在長期接觸Gli1抑制劑后，Gli1蛋白的某些位點發(fā)生突變，導致抑制劑無法有效結合，從而產(chǎn)生耐藥性。藥物的安全性和副作用也是不容忽視的問題。目前的Gli1抑制劑大多為小分子化合物，在體內(nèi)可能會對正常組織和細胞產(chǎn)生一定的毒性作用。一些Gli1抑制劑在動物實驗中表現(xiàn)出對肝臟、腎臟等重要器官的損傷，影響器官功能。此外，Gli1抑制劑還可能引發(fā)一些不良反應，如惡心、嘔吐、乏力等，降低患者的生活質(zhì)量和治療依從性。在臨床試驗中，部分患者在使用Gli1抑制劑后出現(xiàn)了不同程度的惡心、嘔吐癥狀，導致患者難以堅持治療。為了應對這些挑戰(zhàn)，可采取多種策略。針對耐藥性問題，聯(lián)合治療是一種有效的解決方案。聯(lián)合使用不同作用機制的藥物，能夠阻斷腫瘤細胞的多種逃逸途徑，降低耐藥性的發(fā)生。將Gli1抑制劑與其他信號通路抑制劑聯(lián)合應用，如同時抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路和Gli1，可以協(xié)同抑制腫瘤細胞的生長和增殖。在一項臨床前研究中，將Gli1抑制劑GANT61與PI3K抑制劑LY294002聯(lián)合使用，對甲狀腺腫瘤細胞的抑制效果明顯優(yōu)于單藥治療，且能夠有效延緩耐藥性的產(chǎn)生。此外，開發(fā)新的Gli1抑制劑或優(yōu)化現(xiàn)有抑制劑的結構，提高其對腫瘤細胞的特異性和親和力，也是解決耐藥性問題的重要方向。通過對Gli1抑制劑的結構進行修飾，使其能夠更精準地作用于腫瘤細胞，減少對正常細胞的影響，同時增強對耐藥腫瘤細胞的殺傷能力。在提高藥物安全性和降低副作用方面，可采用靶向遞送技術，將Gli1抑制劑精準地遞送至腫瘤組織，減少對正常組織的暴露。納米技術的發(fā)展為藥物靶向遞送提供了新的手段，如利用納米顆粒作為載體，將Gli1抑制劑包裹其中，使其能夠特異性地富集于腫瘤組織。在動物實驗中，通過將Gli1抑制劑負載于納米顆粒上，發(fā)現(xiàn)藥物能夠更有效地到達腫瘤部位，且對正常組織的毒性明顯降低。此外，還可以通過優(yōu)化藥物的劑型和給藥方式，如采