中國人肥胖基因的克隆、序列分析及在大腸桿菌中的表達資料來源：中華內分泌代謝雜志1998年第4期第14卷臨床研究作者：周煒繆為民周丙榮王立明陳志輝焦炳華單位：200433第二軍醫大學微生物學教研室；復旦大學遺傳學研究所遺傳工程國家重點實驗室中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達肥胖基因概述及發現肥胖基因(Obesegene)是近幾年克隆的一個新基因,該基因產物———瘦蛋白

(leptin)，是由脂肪組織產生并分泌167個氨基酸組成的多肽,分泌蛋白分子量約16kb,是反映體內脂肪組成及體內脂肪含量和調節體重的重要信號因子1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理調節。1950年發現了第一個隱性基因突變，命名為肥胖基因(Obesegene），它是一個單基因突變，導致重度肥胖和2型糖尿病，但其研究一直進展甚微。動物試驗表明將肥胖鼠和正常鼠血液循環相連，肥胖鼠體重有所下降，提示正常鼠體內有一種因子可控制過度肥胖，而肥胖鼠則因基因突變而使該因子表達減少或作用喪失。經過8年努力，Friedman實驗組運用定位克隆(Positionalcloning)技術，分離得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列，為揭開肥胖癥之迷及肥胖癥的診治奠定了基礎。瘦素作用于下丘腦，控制代謝、能耗和生殖系統，調節體內脂肪含量。實驗表明，重組的瘦素具有使肥胖小鼠代謝和體重正常化，恢復肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而無明顯的副作用〔4，5〕。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達脂肪組織：取自男性中國人胃切除手術病人的正常大網膜，液氮凍存備用新鮮脂肪組織立即置于液氮凍存。取1克凍存的大網膜脂肪組織，剪成數小塊，在總量為10ml的Trizol液中高速勻漿1分鐘。將組織勻漿液吸入50ml離心管，于室溫下靜置5分鐘，加入2ml氯仿，劇烈振搖混勻后，室溫靜置3分鐘，然后11000g4℃離心15分鐘，將上層無色水相吸入一新管，加入5ml異丙醇，室溫孵育10分鐘，然后11000g4℃離心10分鐘，75%乙醇洗滌RNA沉淀，7500g4℃離心5分鐘，稍干燥后用400μl無RNase的雙蒸水溶解。（冷凍-離心-保存）RNA抽提中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達反轉錄PCR（PCR擴增）根據已報道的序列設計引物，即將編碼成熟肽的第二個密碼子CCC轉變為大腸桿菌常見密碼子CCG:

P1：5’-AACGAATTCATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCAA-3’P2：5’-TTTGGATCCTCAGCACCCAGGGCTGCGGTC-3’以提取的RNA與P2引物70℃共同孵育5分鐘后置冰浴。第一鏈cDNA合成反應體系為200uAMV反轉錄酶，5μl5×緩沖液，1μlRNasin，2μgRNA，四種dNTP(各250μmol/L)。100pmol/LP2引物，總體積25μl,37℃，1小時。取5μlcDNA產物進行PCR擴增，反應體系為5uTaq酶，5μl10×緩沖液，四種dNTP(各250μmol/L)，P1和P2引物各100pmol/L，總體積50μl,94℃5分鐘后行PCR擴增，循環條件為94℃變性30秒，60℃復性30秒，72℃延伸1分鐘，35循環后72℃延伸10分鐘，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達肥胖基因的分子克隆及DNA順序分析

將肥胖基因的RT-PCR產物電泳純化后行EcoRI和BamHI雙酶切，與同樣經EcoRI和BamHI雙酶切的pUC19質粒載體連接。連接產物轉化大腸桿菌TG1感受態細胞，LB培養基培養過夜。以IPTG/X-Gal體系篩選白色菌落，堿法快速抽提質粒，酶切后電泳鑒定重組質粒。用ABI377熒光自動測序儀進行DNA順序分析。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達肥胖基因的分子克隆及DNA順序分析用測序載體pUC19順利地對肥胖基因PCR產物進行了克隆。通過ABI377熒光自動化測序，證明其序列與報道的白種人完全一致。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達肥胖基因的原核表達

用EcoRI和SalI將肥胖基因從pUC19載體上切下，克隆入六聚組氨酸融合表達載體pPROEXHTa

質粒(圖1)。pPROEXHTa重組質粒轉化大腸桿菌（E.coli）DH5α菌株并經酶切電泳鑒定。接種重組質粒的單菌落于3mlLB中，37℃振搖培養過夜，按1%比例轉接至30mlLB中，37℃振搖培養3小時，使OD600約等于0.3～0.4，加入IPTG至終濃度為0.4mol/L，繼續培養3小時，離心收集菌體，進行SDS電泳。示意圖中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達將肥胖基因克隆入pPROEXHTa六聚組氨酸融合表達載體，獲得表達的蛋白分子量為17.5Kd，表達量高達20%左右。用所得的瘦蛋白可以進一步研究瘦素作用機制及治療肥胖癥和糖尿病。最后結果中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達特別說明在有些研究肥胖基因在大腸桿菌表達中，肥胖基因可在不同大腸桿菌、不同oD600值、不同時間誘導等條件下表達，從而可以研究外源基因在大腸桿菌中的表達量的效率。中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達實驗中我們曾分別用隨機引物和P2引物來進行RNA反轉錄，結果后者的PCR得率要高得多。測序結果表明運用RT-PCR方法從中國人脂肪組織獲得的肥胖基因序列與Friedman實驗組報道的白種人完全一致，可見該基因在人種間可能沒有差異，屬于高度保守序列，在功能上有極其重要的作用。對肥胖基因的原核表達，起初我們將肥胖基因克隆入pBL220原核表達載體，但未獲得表達。后將其克隆入pPROEXHTa六聚組氨酸融合表達載體，結果獲得了高效表達。運用該融合表達載體并可給產物純化工作帶來便利，只須用相應的親和層析系統即可達到高質量的純化。我們成功完成了中國人肥胖基因的克隆，并通過核苷酸順序分析證明中國人肥胖基因和已報道的白種人DNA順序完全一致。我們得到的基因可用作探針，用于研究肥胖基因在肥胖癥和糖尿病等病人中的表達情況。通過將肥胖基因克隆入原核表達載體，在大腸桿菌中表達，所得的重組瘦素可用于肥胖癥和糖尿病的治療研究，也可進一步探討肥胖基因的作用機制。結果討論中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達謝謝欣賞！導演：黃富新主演：中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達肥胖基因表達載體構建示意圖

中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達1

PCR分子量標準PCRmolecularweightmarker2

RT-PCR擴增產物RT-PCRproduct箭頭所指為肥胖基因條帶Arrowindicatestheobesegeneband運用Trizol試劑得到了非常滿意的總RNA，電泳條帶顯示18s和28srRNA分別在1.7kb和4.5kb位置，比例約為1:2，可見總RNA完整性和片段大小均很好。根據已知序列設計引物，以中國人脂肪組織RNA為模板，結果非常特異地擴增出約500bp片段的肥胖基因條帶(下圖)。

中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達肥胖基因的分子克隆及酶切鑒定

1

DNA分子量標準DNAmolecularweightmarker2重組的pUC19質粒RecombinantpUC19plasmid3重組的pUC19質粒經EcoRI和BamHI酶切RecombinantpUC19plasmiddigestedbyEcoRIandBamHI

箭頭所指為肥胖基因條帶Arrowindicatestheobesegeneband中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達ATGGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGA中國人肥胖基因序列

中國人肥胖基因大腸桿菌中的表達肥胖基因的原核表達

1低分子量蛋白質標準Lowmolecular

protein

marker

2大腸桿菌DH5α

E.coliDH5α

3載體pPROEXHta轉化的DH5