利用同源重組構建基因表達載體與融合基因、融合蛋白及蛋白質相互作用酵母雙雜交系統與免疫共沉淀突破1

利用同源重組構建基因表達載體(2023·江蘇卷，22)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有__________，擴增程序中最主要的不同是________。模板、引物退火溫度(2)有關基因序列如圖2。引物F2－F、F1－R應在下列選項中選用________。A.ATGGTG——CAACCAB.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAGD.CTGCAG——CTCGTCCD(3)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環化質粒，直接用于轉化細菌。這一過程與傳統重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有___________________________________。(4)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養基篩選，下列敘述錯誤的有________。A.稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養基溫度太高C.抗性平板上常常會出現大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化限制性內切核酸酶、DNA連接酶ABC(5)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板，用引物F1－F和F2－R進行了PCR擴增，質粒P1～P4的擴增產物電泳結果如圖3。根據圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有________。(6)對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是_________________________________________________________________________________________________。P3、P4電泳只能顯示擴增片段的大致長度，不能顯示精準的DNA堿基數量。也不能呈現DNA堿基序列角度1無縫克隆技術In－Fusion技術，即無縫克隆和組裝技術，是一種新型的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質粒的任何位點進行一個或多個目標DNA片段的插入。具體原理是：在載體末端和目的基因兩端應具有15～25個同源堿基，而目的基因兩端的同源序列往往是通過引物設計實現的，In－Fusion酶能夠識別具有相同末端序列的線性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA連接酶再將兩條DNA單鏈黏合起來。命題要點：(1)質粒構建過程：①采用酶切或者PCR擴增方法將載體線性化；②使用設計好的引物進行目的DNA片段的PCR擴增；③反應體系內形成重組質粒。(2)與傳統酶切、酶連相比的優勢：①位點選擇靈活，在載體任意位置進行基因克?。虎诳焖俸啽?；③克隆效率高，陽性克隆高達90%以上；④可同時克隆兩個或多個DNA片段。[例1]

(2024·廣東佛山調研)纖維素是自然界中分布最廣、含量最豐富的一種多糖，水解纖維素的酶系包括內切酶(EG)、外切酶(CBH)和B－葡萄糖苷酶(BGL)。已知釀酒酵母菌不能吸收纖維素，科研人員利用基因工程技術依次將EG基因、CBH基因和BGL基因分多步導入釀酒酵母菌，獲取可以直接利用纖維素發酵的釀酒酵母工程菌。(1)科研人員常用PCR技術獲取和擴增EG基因、CBH基因和BGL基因，該過程不需要添加解旋酶，但DNA也能解旋的原因是_____________________________。若PCR產物中出現了部分非目標序列，可能的原因有_________________________________________________________________________________(答出兩點即可)。高溫也可使氫鍵斷裂，雙鏈打開

引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性；復性溫度過低，DNA聚合酶的質量不好等(2)構建基因表達載體是基因工程的核心步驟，科研人員采用以下兩種方法構建含有EG基因的表達載體。①雙酶切法：如圖甲標注了載體、EG基因的限制酶切點、EG基因插入部位及兩端的部分序列，已知釀酒酵母菌不能合成尿嘧啶，圖中的標記基因為尿嘧啶合成基因。結合圖中信息分析，在擴增EG基因時應在引物的________(填“5′”或“3′”)端添加__________________限制酶的識別序列，設計的引物序列為_________________________________________。(從5′端書寫，寫出前12個堿基序列即可)5′BamHⅠ、SacⅠGGATCCGAATCG、GAGCTCAGCCTA②同源重組法：該操作可通過PCR技術在任一位點實現質粒的線性化，只要將目的基因兩端帶有與線性化質粒兩端同源的DNA序列，在相關酶的作用下即可實現質粒上的同源重組(如圖乙所示)。與雙酶切法相比，同源重組法構建基因表達載體的突出優點是___________________________________________________________。在相關酶的作用下可以實現載體上任一點與目的基因的重組(3)導入上述重組質粒的釀酒酵母菌應在___________的培養基上篩選培養。將篩選得到的菌株接種到液體培養基中培養一段時間，通過檢測__________，以確定其發酵效果。不含尿嘧啶酒精的含量角度2

Cre/LoxP重組酶系統Cre/LoxP重組酶系統的核心元件：(1)Cre重組酶：由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，具有限制酶特性，能夠特異性識別LoxP位點。能介導兩個LoxP位點之間的特異性重組，使LoxP位點間的基因序列被刪除或重組。(2)LoxP序列：來源于P1噬菌體，包括兩個13bp的反向重復序列和一個8bp的間隔區域，反向重復序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區域決定了LoxP位點的方向，LoxP有不同“亞型”，可以嵌套使用。命題要點：(1)同向LoxP：如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列，僅保留一個LoxP。(2)反向LoxP：如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列倒位。(3)依賴于Cre基因的表達：在目的基因上游，放置一個帶有LoxP位點的終止密碼子，可以防止Cre基因缺失時的表達。在Cre基因存在的情況下，終止密碼子被切除，基因表達繼續進行。[例2]Cre/LoxP重組酶系統是對轉基因受體細胞DNA上的特定序列進行定點切割和重新連接，從而在基因或染色體水平上對生物基因進行遺傳改造的一種技術。請回答下列問題：(1)LoxP具有方向性，結構如圖一所示，其中決定方向的序列是________(填序號)。Cre酶能隨機識別DNA分子上的兩個相同的LoxP序列，并在其中的特定位點切斷DNA雙鏈，重新連接切口后，連接時形成的化學鍵是____________，兩個同向LoxP在發揮作用時，機制如圖二，則保留圖二中片段________(填序號)，就能實現目標基因的敲除。②磷酸二酯鍵2(2)Cre/LoxP重組酶系統可以調控基因的表達，在目的基因________(填“上游”或“下游”)插入一個帶有LoxP位點的編碼終止密碼子的序列，在Cre酶存在的情況下，目的基因________(填“表達”或“不表達”)。若經Cre酶作用使得2個LoxP位點間的序列發生反轉，其原因可能是______________________________。上游表達兩個LoxP序列相反(3)“腦彩虹”是一項最新的大腦成像技術，通過熒光蛋白“點亮”大腦內的神經元，幫助科學家了解大腦。①研究者設計如圖所示的DNA片段。已知三種熒光蛋白的氨基酸序列，則可通過________________法獲得相關基因，再利用限制酶和____________酶將三種熒光蛋白基因和兩種LoxP序列、啟動子M與載體連接，形成重組質粒，采用____________法將其導入小鼠的受精卵細胞中，經過篩選、培育，獲得轉基因小鼠。人工化學合成DNA連接顯微注射②在Cre酶的幫助下，一些熒光蛋白基因可能會被隨機“剪掉”，但兩個LoxP1或兩個LoxP2之間的基因，最多會被Cre酶敲除一次，Cre酶基因在環境中存在化學物質Tam時才能激活表達，因此該小鼠“腦彩虹”的出現可受Tam的調控：a.若無Tam作用時，該小鼠腦組織的色彩為________色，其他組織細胞顏色為________色。b.若有Tam作用時，該小鼠腦組織會出現“腦彩虹”，請闡述機理：______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。紅無若有Tam作用時，則啟動Cre酶基因的表達，在該酶的作用下，一些熒光蛋白基因可能會被隨機“剪掉”，若隨機敲除兩個LoxP1之間的紅色熒光蛋白基因，此時細胞為黃色，敲除兩個LoxP2之間的紅色和黃色熒光蛋白基因，此時細胞為藍色，也有可能未成功敲除熒光蛋白基因，此時細胞為紅色，這樣就會出現不同腦細胞差異表達紅色、黃色或藍色熒光蛋白基因，進而出現“腦彩虹”突破2

融合基因、融合蛋白及蛋白質相互作用1.(2023·遼寧卷，8)CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受體。為實時監控CD163蛋白的表達和轉運過程，將紅色熒光蛋白RFP基因與CD163基因拼接在一起(如圖)，使其表達成一條多肽。該拼接過程的關鍵步驟是除去(

)A.CD163基因中編碼起始密碼子的序列B.CD163基因中編碼終止密碼子的序列C.RFP基因中編碼起始密碼子的序列D.RFP基因中編碼終止密碼子的序列B2.(2023·浙江6月選考，19)某研究小組利用轉基因技術，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實驗得到能正常表達兩種蛋白質的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3－GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設計了引物1和引物2用于PCR擴增，PCR產物電泳結果如圖乙所示。B下列敘述正確的是(

)A.Gata3基因的啟動子無法控制GFP基因的表達B.翻譯時先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2號條帶的小鼠是野生型，4號條帶的小鼠是Gata3－GFP基因純合子D.若用引物1和引物3進行PCR，能更好地區分雜合子和純合子1.融合基因與融合蛋白 (1)融合基因：是指將兩個或多個基因的編碼區首尾相連，置于同一套啟動子和終止子內部構成的嵌合基因。啟動子基因1基因2基因3終止子(2)融合蛋白：是指融合基因的表達產物。(3)啟動子及其類型啟動子是一段具有特殊序列結構的DNA片段，是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA。主要包括以下三種類型：①組成型啟動子：能夠調控基因表達，使其基本恒定在一定程度上，從而使基因在不同部位或組織中的表達水平不存在明顯差異。這類啟動子一般來自管家基因，可連續不斷地啟動基因的表達。②組織特異性啟動子：其調控作用使得基因往往只在某些特定器官或組織中表達，且表現出發育調節的特性。如構建乳腺生物反應器時所用的在乳腺中特異表達的基因的啟動子。③誘導型啟動子：即在某些特定的物理或化學信號刺激后，使目的基因的轉錄水平有所提高。2.融合基因的種類(1)目的基因＋報告/標記基因其主要目的是對目的基因進行示蹤，研究其功能及特性。標記基因有綠色熒光蛋白基因(GFP基因)、β－半乳糖苷酶基因(LacZ基因)、β－葡萄糖苷酸酶基因(GUS基因)、蟲熒光素酶基因(Luciferasese基因)等。啟動子目的基因綠色熒光蛋白基因終止子(1)報告/標記基因一般連在目的基因的下游，這樣才能確信表達了標記基因的受體細胞也表達了目的基因，即受體細胞出現綠色熒光，說明目的基因已經表達。如果報告/標記基因在前，目的基因在后，有可能受體細胞只成功表達報告/標記基因，而未成功表達目的基因。(2)編碼信號肽或單體蛋白序列的基因＋目的基因其主要目的是利用信號肽或單體序列攜帶目的基因高效表達，從而提取純化目的蛋白，為生產或科研所用。(3)功能基因＋功能基因分為兩類：一是相同功能基因的融合(目的是增強基因的功能，擴大基因的應用范圍，例如殺蟲基因之間的融合)；二是不同功能基因的融合(為特殊需要而構建，例如將編碼大腸桿菌熱不穩定性毒素B亞單位基因EtxB與腫瘤抗原基因連接，制成一種融合基因腫瘤疫苗。腫瘤抗原的免疫原性弱，而細菌抗原EtxB的免疫原性強，免疫系統對細菌抗原會產生很強的免疫應答反應，而在反應中被激活的針對細菌抗原的CD4Th免疫細胞可通過鏈接產生針對腫瘤抗原的體液免疫和細胞免疫，從而高效增強腫瘤疫苗的效力)。[例1]

(2024·南通高三質檢)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四個基因分別編碼四種不同的酶，研究人員將這些基因分別與葉綠體轉運肽(引導合成的蛋白質進入葉綠體)基因連接，構建多基因表達載體(載體中部分序列如下圖所示)，利用農桿菌轉化法轉化水稻，在水稻葉綠體內構建了一條新代謝途徑，提高了水稻的產量。下列敘述正確的是(

)A.四個基因轉錄時都以DNA的同一條單鏈為模板B.四個基因都在水稻葉綠體內進行轉錄、翻譯C.應選用含卡那霉素的培養基篩選被農桿菌轉化的水稻細胞D.可用抗原—抗體雜交技術檢測四種酶在轉基因水稻中的表達情況D[例2]

(2024·北京海淀區高三上學期期末節選)(2)熱纖梭菌中Co和Do蛋白能以高親和力相互作用，形成復合物?？蒲腥藛T將Cas9蛋白的N端和C端兩個片段分別與Co和Do蛋白融合，構建Cas9(N)－Co復合物和Cas9(C)－Do復合物，這兩個復合物在細胞中相遇時，Cas9可恢復全酶活性，科研人員構建圖1所示的表達載體，導入受體細胞。啟動子1為遠紅光誘導型啟動子，啟動子2為持續表達啟動子。據此分析，在沒有遠紅光照射時，受體細胞中Cas9(N)、Cas9(C)和Cas9蛋白的存在狀態及位置是_____________________________________。無Cas9(N)和Cas9，Cas9(C)存在于細胞質與持續表達Cas9全酶相比，上述方法的優勢是__________________________________________________________________________________________________。

僅在遠紅光誘導時才有全酶進入細胞核，可減少Cas9全酶長時間在細胞核中對非目標DNA的切割3.獲得融合基因的方法——以重疊延伸PCR技術為例以融合基因M和基因N為例，步驟是：(1)設計4種引物：引物1和引物4為普通引物。引物2的3′端含有基因M的序列，5′端含有基因N的序列；引物3的3′端含有基因N的序列，5′端含有基因M的序列；引物2和引物3完全互補配對。(2)PCR擴增：利用引物1和引物2擴增基因M，2輪循環可得到M′型DNA分子；利用引物3和引物4擴增基因N，2輪循環可得到N′型DNA分子。(3)獲得融合基因M＋N：將M′型DNA分子和N′型DNA分子放在同一個PCR管里，變性、復性、延伸后，就得到了拼接好的融合基因M＋N。[例3]

(2024·江西南昌質檢)透明顫菌血紅蛋白基因vgb表達產物VHb蛋白能使其在低氧的環境中生長良好。頂頭孢霉是好氧型真菌，其發酵產物頭孢菌素C有很大的市場需求量，但低氧環境影響其產量，傳統發酵生產的增氧成本高。為提高產量科研人員將透明顫菌血紅蛋白基因vgb基因和頂頭孢霉pcpC啟動子進行PCR拼接，并與質粒1構建重組質粒，如下圖。注：hph是潮霉素抗性基因，Vgb基因與hph基因共用終止子?；卮鹣铝袉栴}：(1)PCR過程除了需要引物外，還需要的條件有________________________________________________________(寫三點)。pcpC啟動子是____________識別和結合的部位。(2)據圖所示，重疊延伸PCR拼接時，若啟動子啟動方向與引物3延伸方向一致，引物2和引物3的5′端需分別添加_______________的酶切位點。拼接形成重組基因的目的是_________________________________________________________________________。DNA模板、四種游離的脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶RNA聚合酶XbaⅠ、BamHⅠ使頂頭孢霉在低氧的環境中生長良好，提高其發酵產物頭孢菌素C的產量(3)利用含有____________的選擇培養基初步篩選菌種；最后從個體生物學水平上鑒定，若在低氧環境下，檢測到頭孢菌素C表達量________，則表示轉化成功。潮霉素增多4.融合蛋白的分離(1)融合蛋白存在的問題如果二者翻譯成一條多肽鏈，有可能影響彼此的折疊和空間結構，進而影響彼此的生物學活性；如果二者翻譯成一條多肽鏈，有可能影響彼此的亞細胞定位。目的蛋白不能正確的進入它正常要去的場所，導致不能正常的發揮生物學功能。(2)融合蛋白分離措施①使用2A序列：2A序列是一對來源于病毒的短肽(18～25個氨基酸)，通常被稱為“自我剪切肽”，能使一條轉錄產物產生多種蛋白，其原理如圖：②使用“IRES序列”：“IRES”是內部核糖體進入位點序列，能招募核糖體對mRNA進行翻譯，使用單個啟動子啟動多個基因表達時，可以將多個基因通過IRES序列分隔開，一條mRNA就會翻譯成多條多肽鏈，其原理如圖：[例4]

(2024·江蘇南通一模)通常真核細胞翻譯的起始必須依賴于mRNA的5′端帽子結構，而內部核糖體進入位點(IRES)則是位于mRNA內部的核糖體識別、結合序列，IRES使翻譯可以從mRNA內部開始。人溶菌酶和人乳鐵蛋白是人乳中重要的抗菌蛋白，科研人員構建人溶菌酶基因(hLYZ)和人乳鐵蛋白基因(hLTF)雙基因表達載體，并獲得轉基因牛胚胎。如圖表示雙基因表達載體的主要構建過程，請回答下列問題。限制酶識別序列：BamHⅠ：G↓GATCCNheⅠ：G↓CTAGCXbaⅠ：T↓CTAGA相關結構：Ori：復制原點AmpR：氨芐青霉素抗性基因NeoR：新霉素抗性基因(1)IRES的基本組成單位是__________，翻譯時核糖體在mRNA移動的方向是________(填“5′→3′”或“3′→5′”)。與兩個基因直接連接形成融合基因相比，兩個基因之間插入IRES序列的意義是_____________________________________________________________________。核糖核苷酸5′→3′便于得到兩種具有功能的蛋白質(一種mRNA可翻譯形成兩種蛋白質)(2)為實現hLTF與IRES序列的連接，在PCR擴增基因片段時通常在引物的5′端添加特定的限制酶識別序列，而不在3′端添加的原因是__________________________________________________________________。(3)過程①中，用_________________切割質粒a、b后，再用________(方法)分離，收集質粒a的hLTF片段，與質粒b的大片段連接，獲得重組質粒1。使引物的3′端與模板鏈嚴格互補配對，保證子鏈的延伸XbaⅠ和NheⅠ電泳法(4)過程②中，用BamHⅠ分別處理重組質粒1和質粒c，再連接形成的重組質粒不止一種，這是因為___________________________________________________________________。用BamHⅠ對重組質粒2進行酶切，獲得的DNA片段大小為_______________________。

目的基因與質粒c存在正反連接、目的基因多拷貝與質粒c連接等3.2kb和8.2kb(5)科研人員以包含重組質粒2的脂質體轉染乳腺上皮細胞時，在細胞培養液中加入一定濃度的新霉素的主要目的是______________________________________。選擇乳腺上皮細胞作為受體細胞便于檢測______________________________________。便于篩選導入重組質粒2的牛乳腺上皮細胞hLYZ和hLTF(目的基因)能否表達(6)研究人員試圖以轉hLYZ與hLTF的奶牛乳腺上皮細胞作為供體細胞，培養轉基因克隆胚胎，在此過程中主要涉及的現代生物技術有________________________________________________________________________________________________________(答出兩條即可)。體細胞核移植技術、早期胚胎培養技術(動物細胞培養技術、卵母細胞采集與培養技術)突破3

酵母雙雜交系統與免疫共沉淀(2022·山東卷，25)某種類型的白血病由蛋白P引發，蛋白UBC可使P被蛋白酶識別并降解，藥物A可通過影響這一過程對該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機理，需構建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質結合，但不影響P或P△的功能。(1)為構建重組載體，需先設計引物，通過PCR特異性擴增P基因。用于擴增P基因的引物需滿足的條件是__________________________________________________________，為使PCR產物能被限制酶切割，需在引物上添加相應的限制酶識別序列，該限制酶識別序列應添加在引物的________(填“3′端”或“5′端”)。能與P基因母鏈的一段堿基序列互補配對、短單鏈核酸5′端(2)PCR擴增得到的P基因經酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據圖甲分析，出現該問題的原因是_________________________________________________________________________________________________________________________。P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRⅠ識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是_________________________________________________________________。圖甲在引物中的EcoRⅠ識別序列3′端添加1個堿基(3)融合蛋白表達成功后，將FLAG－P、FLAG－P△、藥物A和UBC按照圖乙中的組合方式分成5組。各組樣品混勻后分別流經含FLAG抗體的介質，分離出與介質結合的物質并用UBC抗體檢測，檢測結果如圖丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③組結果的差異推測，藥物A的作用是______________________________________________________________；增強FLAG－P與UBC的結合由②④組或③⑤組的差異推測，P△中缺失的特定序列的作用是______________________。(4)根據以上結果推測，藥物A治療該病的機理是_________________________________________________________________。參與P與UBC的結合藥物A通過增強P與UBC結合，促進P降解角度1酵母雙雜交系統1.酵母菌的轉錄激活因子含有兩個不同的結構域：DNA結合結構域(BD)和DNA轉錄激活結構域(AD)，這兩個結構域可以獨立分開，功能互不影響。2.BD和AD分別單獨作用并不能激活轉錄反應，只有當二者在空間上充分接近時，才呈現完整的轉錄激活因子活性，使下游基因得到轉錄，可將兩個待研究蛋白(蛋白X與蛋白Y)分別與BD、AD結構域構建質粒來探究其是否具有相互作用，如果X與Y不存在相互作用，則下游基因不會表達；如果X與Y存在相互作用，則下游基因表達。(如圖所示)命題要點提醒：(1)一般不將BD－X與AD－Y兩融合蛋白構建在同一質粒上，而是將BD－X與AD－Y構建在兩個質粒上，然后共轉染到同一酵母細胞。(2)下游常用熒光蛋白基因作為報告基因來驗證X與Y是否有相互作用。(3)融合基因的構建：如想要把兩基因(CD163與RFP)融合并成功表達出對應的融合蛋白，要將上游基因即靠近啟動子的基因(CD163)中編碼終止密碼子的序列去除，這樣才不會使得在融合蛋白表達過程中翻譯完CD163后終止。[例1]

蛋白質甲基化是最廣泛的翻譯后修飾之一，組蛋白甲基轉移酶G9a主要修飾蛋白質中賴氨酸、精氨酸，從而調控基因表達。酵母細胞基因轉錄因子BD(含賴氨酸)和AD兩結構域結合時才能激活轉錄，兩結構域分開時不能激活轉錄，為了篩選賴氨酸甲基化閱讀器(只有甲基化的賴氨酸才能被“閱讀器”識別)，研究人員進行了如圖1所示實驗，其中TRP1、LEU2分別是色氨酸、亮氨酸合成基因，G9a基因表達產物(含G9a)能與BD基因表達產物結合，當賴氨酸甲基化閱讀器與G9a、BD復合體相互作用后，BD就可以與AD一起激活報告基因LacZ轉錄，如圖2。請回答下列問題。(1)組蛋白甲基化影響基因表達水平，并可遺傳給后代，這種現象________(填“屬于”或“不屬于”)基因突變，________(填“會”或“不會”)遺傳給后代。(2)為了使“閱讀器”基因定向插入載體中，通過PCR技術擴增“閱讀器”基因時，需在引物5′端添加______________________________________序列。不屬于會GAATTC、GGATCC(3)質粒甲、乙導入代謝缺陷型酵母菌時，需用氯化鈣(CaCl2)處理酵母菌，其目的是____________________________________________________________________________________。兩培養基中需分別不添加________________才可篩選出導入重組質粒的酵母菌。轉化后需要在相應的培養基上培養和篩選，選擇導入了__________________________________________(填“融合表達載體”“報告基因載體”或“融合表達載體和報告基因載體”)的酵母細胞。使酵母菌處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，有利于吸收外源DNA色氨酸、亮氨酸融合表達載體和報告基因載體(4)已知LacZ基因表達產物，能將無色化合物X－gal水解成藍色產物。Y2H和Y187接合生殖、培養時，如需篩選Y3H中含所需的“閱讀器”，所需要進行的操作是：_______________________________________________________________________________________________________________。Y2H和Y187在含有無色化合物X－gal的培養基上完成接合生殖、培養，并在Y3H中挑選藍色菌落角度2免疫共沉淀1.探究蛋白是否有相互作用 (1)加標簽：通過構建融合基因完成，A蛋白添加Flag標簽，B蛋白添加HA標簽。 (2)拉蛋白：使蛋白提取混合物通過含有Flag抗體的介質，這樣就可將含有Flag標簽的蛋白質篩選出來。(3)共沉淀檢測：該沉淀復合物如用A蛋白抗體檢測為陽性，如圖①，然后在沉淀復合物中添加HA標簽的抗體，如果顯示陽性，則表明A蛋白和B蛋白有相互作用，如圖②，在沉淀復合物中添加B蛋白的抗體，如果