項目三

無菌操作技術任務三外植體的選擇與處理任務二無菌操作技術任務一虛擬無菌操作任務二無菌操作技術知識目標理解有菌和無菌的范疇；掌握常用的滅菌方法；掌握無菌操作過程。

123掌握組織培養相關的滅菌方法；熟練掌握無菌操作技術；12

滅菌和接種

任務講解滅菌和接種一、滅菌二、無菌操作三、接種第一節滅菌和接種

滅菌是組織培養重要的工作之一。初學者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。無菌室等未經處理的地方、超凈臺表面、簡單煮沸的培養基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。滅菌和接種第一節滅菌和接種

這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不人。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。滅菌和接種第一節滅菌和接種

無菌的范疇是：經高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經其他物理的或化學的滅菌方法處理后的物體(當然這些方法必須已經證明是有效的)，高層大氣、巖石內部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內部，強酸強堿，化學元素滅菌劑等表面和內部等等都是無菌的。滅菌和接種第一節滅菌和接種消毒：殺死、消除或抑制部分微生物，使之不發生作用。滅菌：用物理或化學方法，殺死物體表面和孔隙內一切微生物或生物體，即所有生命的物質全部殺死。滅菌和消毒的區別是什么？一、滅菌滅菌和接種滅菌概念1.培養基滅菌◆高壓濕熱滅菌◆某些激素、維生素采用過濾滅菌視頻3-1培養基滅菌自動高壓濕熱滅菌鍋1電源水位指示燈溫度、壓力顯示窗溫度壓力設置鈕壓力表放汽閥滅菌鍋1臥式滅菌鍋2臥式滅菌鍋2臥式滅菌鍋結構

過濾滅菌濾膜?0.45um以下1.過濾器先滅菌，滅菌溫度不超過121℃。2.溶液先進行初濾(濾膜?0.65um)過濾滅菌

培養基高壓蒸汽滅菌所必需的最少時間容器體積(mL)121℃滅菌所需最少時間(min)20-501575-15020250-50025100030高壓蒸汽滅菌2.玻璃器皿滅菌◆干熱滅菌：160-180℃,1.5-2.0h◆濕熱滅菌：121℃,20-40min◆接種前用酒精棉球擦試，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。3.接種工具滅菌◆用前干熱滅菌：160～180℃,1.5～2.0h◆用前濕熱滅菌：121℃,20～30min◆接種前用酒精棉球擦試，浸入95%酒精液中，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。◆濕熱滅菌：121℃，20～30min◆實驗服滅菌后置于緩沖間或密封好。4.實驗服、口罩、濾紙滅菌4.實驗服、口罩、濾紙滅菌5.接種室滅菌紫外燈照射(接種室、超凈臺、接種箱)：波長260nm，距離小于1.2m，15～20min。臭氧滅菌機：1～2h熏蒸滅菌：2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高錳酸鉀；冰醋酸；1～3%高錳酸鉀或3%來蘇兒。

接種臺噴霧消毒：75%酒精。

◆用化學滅菌劑消毒◆常用化學滅菌劑6.接種材料滅菌視頻3-2

接種材料滅菌水洗莖尖選取酒精滅菌氯化汞滅菌無菌水沖洗接種滅菌圖示常用滅菌劑的使用濃度與效果比較滅菌劑使用濃度持續時間去除難易效果次氯酸鈣9-10%5-30min易很好次氯酸鈉2%5-30min易很好氯化汞0.1-1%5-8min較難最好抗菌素4-50mg/L30-60min中較好滅菌劑的使用濃度與效果8.培養室滅菌新建培養室用前一定要徹底熏蒸1次；隔2-5天用洗衣粉水或來蘇水拖地1次，用高錳酸鉀擦架1次。

熏蒸滅菌：

2ml/m3甲醛+0.2g/m3

高錳酸鉀二、無菌操作

接種時由于有一個敞口的過程，所以是極易引起污染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內保持定期用1%～3%的高錳酸鉀溶液對設備、墻壁、地板等進行擦洗。視頻3-3無菌操作

除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進行：(1)在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內紫外燈進行滅菌；(2)在接種前20min，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外燈；(3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復過火尖端處，對培養皿要過火烤干；(6)接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30min。注：若連續接種，每5天要大強度滅菌一次。三、接種三、接種三、接種滅菌和無菌操作是組織培養的關鍵，在各環節中都要保持無菌的環境；滅菌的方法很多，要根據材料和目的來選擇