1楊樹葉枯病診斷技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了楊樹葉枯病田間診斷及室內(nèi)技術(shù)要求。本文件適用于遼寧省楊樹葉枯病的室內(nèi)及田間診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T15161林業(yè)資源分類與代碼林木病害GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法LY/T3101林業(yè)有害生物代碼3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1楊樹葉枯病（poplarleafblight）由鏈格孢菌（Alternariaalternata）引起的一種楊樹葉部真菌病害。3.2鏈格孢菌（Alternariaalternata）格孢腔菌科（Pleosporaceae），一種典型的腐生性病原真菌，其寄主廣泛，可以引起瓜果采后腐爛病、花卉花枯病、中草藥及林木等的葉斑病和葉枯病。3.3柯赫氏法則（Koch'sRule）柯赫氏法則又稱柯赫氏假設(shè)或柯赫氏證病律，是確定侵染性病害病原物的操作程序，主要包括共存性觀察、分離、接種和再分離。在病植物上常伴隨有一種病原微生物存在，該微生物可在離體的或人工培養(yǎng)基上分離純化而得到純培養(yǎng)，將純培養(yǎng)接種到相同品種的健康植株上，引起癥狀相同的病害，從接種發(fā)病的植物上再度進(jìn)行分離到其純培養(yǎng)，性狀與接種物相同。經(jīng)上述步驟并得到確實(shí)的證明，就可以確認(rèn)該生物即為該病害的病原物。24診斷準(zhǔn)備4.1儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、顯微鏡、高壓滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、冰箱、分析天平、電磁爐、不銹鋼鍋（2L~4L）。4.2診斷用具解剖剪、鑷子、接種針、載玻片、蓋玻片、酒精燈、培養(yǎng)皿、量杯（1L）、量筒（1L）、錐形瓶（150mL）、藥匙、自封袋、記號(hào)筆、稱量紙、酒精棉球、噴壺、封口膜。4.3試劑0.1%氯化汞（HgCl）、75%酒精、95%酒精、無菌水（GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法）。4.4培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PDA）：配置方法詳見附錄A。5楊樹葉枯病害診斷5.1診斷時(shí)間7月上旬至9月中下旬。5.2田間診斷調(diào)查有疑似癥狀的葉片，依據(jù)出現(xiàn)典型癥狀的病狀和病癥，楊樹葉枯病癥狀見附錄B。5.3病原物分離培養(yǎng)5.3.1病害樣本采集采集疑似病害樣品，對(duì)其癥狀特點(diǎn)描述記載，裝入自封袋內(nèi)，做好標(biāo)記，帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)于4℃冰箱5.3.2分離培養(yǎng)采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原物分離。采集帶有典型病斑的病葉，于超凈工作臺(tái)中首先用無菌水清洗病葉3遍，然后經(jīng)75%酒精消毒2min，無菌水漂洗3次，再用0.1%HgCl消毒2min，無菌水漂洗3次，剪取病健交界處葉片組織約0.5cm×0.5cm接種至馬鈴薯蔗糖瓊脂（PDA）固體平板培養(yǎng)基中，置于25℃生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待菌落直徑達(dá)到2cm左右時(shí)，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接、純化，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.4致病性測(cè)定根據(jù)柯赫氏法則，以菌絲塊作為接種材料進(jìn)行致病性測(cè)定。4℃冰箱中保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，用直徑為6mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。選擇健康的一年生楊樹盆栽苗中上部葉片，葉片表面用75%酒精擦拭消毒后，將菌餅放置在主脈兩側(cè)葉片上，每側(cè)放置一個(gè)菌餅菌絲面朝下，對(duì)照處理接種PDA培養(yǎng)基塊，用蘸有無菌水的脫脂棉覆蓋后用保鮮膜包好固定保濕，25℃條3件下培養(yǎng)，觀察葉片發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，從發(fā)病部位進(jìn)行再次分離，葉片癥狀與B.1規(guī)定一致，獲得病原物形態(tài)與B.2規(guī)定一致，確定分離物為致病菌。5.5病原物鏡檢5.5.1病害樣本的鏡檢選取疑似病害植物組織病健交界處組織，制作徒手切片并進(jìn)行鏡檢，觀察病原特征菌絲體和分生孢子特征。5.5.2病原物純培養(yǎng)鏡檢采用玻片培養(yǎng)法對(duì)分離的菌種進(jìn)行菌絲和孢子形態(tài)觀察。將分離菌種平板用打孔器（直徑6mm）打取菌餅，接種在培養(yǎng)皿中心位置，將無菌的蓋玻片斜插到平板中約呈45°,待菌絲長(zhǎng)到蓋玻片中央時(shí)，用鑷子輕輕將蓋玻片抽出，蓋玻片中有菌絲的一面朝上，用OLYMPUSBX51顯微鏡鏡檢，觀察菌絲及孢子形態(tài)并拍照。病菌形態(tài)描述見附錄B。5.6病原菌分子鑒定4℃冰箱中保存的菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7d，無菌刀片刮取平板菌絲約0.1g，用TIANGEN快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）進(jìn)行DNA提取劑盒提取菌絲總DNA，利用PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)擴(kuò)增鏈格孢菌ITS特異片段并進(jìn)行測(cè)序鑒定。引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)程序附錄C。6病害判定6.1田間觀測(cè)判定通過田間觀測(cè)，楊樹出現(xiàn)附錄B.1表述癥狀時(shí)，可初步診斷為葉枯病。6.2顯微鏡觀察判定按照5.5.1、5.5.2鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)與B.2描述癥狀一致時(shí)，樣品可判定為楊樹葉枯病。6.3接種觀察判定當(dāng)按照5.4接種后楊樹出現(xiàn)B.1描述癥狀，且按5.5.1、5.5.2鏡檢觀察與B.2一致時(shí)，可判定為楊樹葉枯病。6.4測(cè)序結(jié)果判定測(cè)序結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，序列相似性≥99%,可以鑒別為相同種，確定菌種為鏈格孢菌，可判定為楊樹葉枯病病原菌。4馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基成分及配制方法A.1培養(yǎng)基成分及含量新鮮去皮馬鈴薯200g、蔗糖20g、瓊脂20g、水1000mL。A.2配制方法新鮮馬鈴薯去皮，洗凈后稱取200g,切成約1cm3的小塊，放入1000mL水中，煮沸10min~20min。用8層紗布進(jìn)行過濾，然后補(bǔ)水至1000mL，加入稱好的蔗糖20g、瓊脂20g,不斷攪拌至瓊脂完全溶化，停止加熱。培養(yǎng)基分裝于錐形瓶中，封口并加注標(biāo)記，置于高壓滅菌鍋中，121℃滅菌20min，備用。5楊樹葉枯病癥狀及病菌形態(tài)描述B.1病名和癥狀描述B.1.1病名楊樹葉枯病（poplarleafblight）。B.1.2癥狀描述楊樹葉枯病是一種由鏈格孢菌引起的發(fā)生較為普遍的真菌病害，主要危害葉片，同時(shí)還可危害幼樹的嫩梢，使之發(fā)生枯梢病。危害葉片時(shí)，發(fā)病初期，感病葉片上產(chǎn)生隱約可見的褐色斑，以后病斑逐漸擴(kuò)大，病斑黃色，中央褐色；發(fā)病后期，病斑上產(chǎn)生黑褐色霉?fàn)钗铮瑸椴≡姆稚咦庸：头稚咦樱“呖上嗷ヂ?lián)成大斑，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致全葉枯死。楊樹葉枯病癥狀見圖A.1。圖B.1楊樹葉枯病癥狀B.2病原菌和形態(tài)描述B.2.1病原菌楊樹葉枯病病原菌為鏈格孢菌（Alternariaalternata(Fr.)Keissl）。B.2.2形態(tài)描述鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)24h長(zhǎng)出白色氣生菌絲，培養(yǎng)7d左右菌落直徑可達(dá)7~9cm,生長(zhǎng)速度快，菌落平展，近圓形，絨毛狀,厚實(shí),菌落邊緣整齊為白色環(huán)帶，中央稍隆起。初時(shí)菌落灰白色，后顏色變?yōu)樯钌?橄欖綠色，可產(chǎn)生色素，背面藍(lán)黑色至黑色，有同心輪紋。鏈格孢菌菌落特征見圖A.2。菌絲單生或有分枝，有隔，有索狀聯(lián)合。分生孢子梗直立或彎曲，分生孢子梗淡褐色，分生孢子淡黃褐色至深褐色，倒棒狀、倒梨形、卵形、近卵形或橢圓形，臍部明顯。具有若干橫、縱膈膜，分隔處平滑或縊縮，大小9.9~70μm×7.2~16.3μm。鏈格孢菌菌絲及分生孢子特征見圖A.3。6圖B.2鏈格孢菌菌落特征圖B.3鏈格孢菌菌絲及分生孢子特征7鏈格孢菌分子鑒定C.1鑒定方法利用核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間區(qū)(internaltranscribedspacer，ITS)進(jìn)行PCR鑒定。C.1.1引物采用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR鑒定，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見附表B.1。引物名稱引物序列(5`-3`)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp)ITS1ITS4CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAATCCTCCGCTTATTGATATGC600-700C.1.2反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系（25μL10×PCRBuffer2.5μL、dNTP（2.5mmol/L）2.0μL、上游引物（10μmol/L）0