1.1植物細胞的全能性植物細胞全能性（totipotency）：是指任何攜帶完整遺傳信息的植物活細胞都具有表達其所有遺傳信息的能力，能夠發(fā)育成完整的植株。全能性是一種可能性，變?yōu)楝F(xiàn)實必須滿足兩個條件：解除抑制和給予刺激。細胞需經過脫分化和再分化過程才能表現(xiàn)其全能性。1植物組織培養(yǎng)的基本原理1.2植物細胞的分化與脫分化脫分化（dedifferentiation）：成熟細胞或分化細胞轉變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)（即形成愈傷組織）的過程。再分化（redifferentiation）：成熟細胞或分化細胞脫分化轉變?yōu)橛鷤M織后重新分化成異質細胞的過程。1.3植物的形態(tài)建成

1.3.1愈傷組織的誘導、生長和保持傷口可能導致愈傷組織的形成。愈傷組織形成可以在幾乎所有的活的植物中發(fā)現(xiàn)。傷口愈傷組織的開始是植物的一種自我保護反應；內源植物激素水平的改變，結果使細胞分裂具有活性。機械損傷、微生物入侵以及昆蟲的襲擊也可以導致愈傷組織產生。Woundcallusonthestem

ofanErythrinatree1.3.1.1愈傷組織的誘導愈傷組織起源于母體組織增殖細胞。在培養(yǎng)時，通過把全植株的一小部分（外植體）在無菌條件下放到支持生長的培養(yǎng)基上來產生愈傷組織。激素改變了細胞的代謝使之從靜止轉變?yōu)榫哂谢钚浴碜杂谌~組織來源于根來源于維管組織來源于胚組織培養(yǎng)條件固體培養(yǎng)基暗培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的缺點污染損失大不利于氣體交換，影響愈傷組織形成。誘導期（啟動期）細胞準備分裂。因植物種類和外植體狀況而異。對大多數(shù)植物，愈傷組織建立相對比較容易；如雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、蕨類植物以及苔蘚等。來自多種器官的組織在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上可能都有分裂和增生擴散的潛能，然而，某些組織似乎比另一些更傾向于使細胞快速分裂。一般需要1天到幾天。1.3.1.2愈傷組織的生長誘導期后，外植體外層細胞開始分裂，在組織受傷表面形成一種創(chuàng)傷形成層，愈傷組織的細胞數(shù)目迅速增加。特點：細胞分裂速率大大超過細胞伸長速率，單個細胞的平均重量下降，體積變小。如菊芋外植體培養(yǎng)7d后，細胞數(shù)目增加10倍以上，鮮重僅增加1倍。愈傷組織類型質地：松脆、致密高生長素：致密變松脆。低或無生長素或高細胞分裂素：松脆變致密。

顏色：白色、黃色、綠色、紅色1.3.1.3愈傷組織的保持一段時間后，由于基本培養(yǎng)物的損耗、凝膠的干燥以及代謝物的積累，需要將愈傷組織轉到新鮮的培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)。愈傷組織繼代培養(yǎng)時要有適當?shù)拇笮。员ＷC在新鮮培養(yǎng)基上可以重建生長。通常每3～6周進行繼代培養(yǎng)。Typicalcallusgrowthcurve.Xindicatestimeforsubculture大多數(shù)情況下，隨繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加和培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織出現(xiàn)生長勢下降、褐變、分化和形態(tài)發(fā)生能力逐漸降低甚至死亡或發(fā)生能力完全喪失。遺傳因素：染色體畸變、基因突變。生理因素：細胞內激素平衡或細胞對外源生長物質的敏感性發(fā)生改變。延長培養(yǎng)期可能使愈傷組織對生長素的需求發(fā)生變化，導致生長素的自給或自養(yǎng)，出現(xiàn)馴化現(xiàn)象。一般1年以上或10代以上出現(xiàn)。生理因素導致的形態(tài)發(fā)生能力下降可通過改變培養(yǎng)條件而恢復。1.3.2愈傷組織再分化愈傷組織生長過程中，開始細胞分裂局限在外層細胞，當表面細胞分裂逐漸減慢并停止時，內部較深處的細胞才開始分裂，且分裂的方向也發(fā)生改變，形成了維管化組織和瘤狀結構，這是愈傷組織生長的一個共同特征。很多情況下，它們往往變成生長中心，但不進一步分化，并從它們的周圍產生薄壁細胞，結果形成一種“泡沫球”增殖物，這仍然是生長活躍的愈傷組織的特點。隨后這些小疣狀物可以經歷另一個發(fā)育過程，出現(xiàn)器官分化和體細胞胚狀體的發(fā)生。在愈傷組織的培養(yǎng)過程中細胞分化的程度和類型有相當大的可變性。很難找到由完全一致的實質細胞組成的均一的愈傷組織。當形成導管元件、篩管元件、栓化細胞、分泌細胞等時就發(fā)生了細胞分化。一些分裂的細胞形成擬分生組織或維管節(jié)結，以后它們將變成芽頂點、根原基或初始胚形成的中心。xylemtissuemeristematicactivityunorganisedtissue再分化途徑器官發(fā)生途徑：愈傷組織先產生芽（或根），再在另一種培養(yǎng)基上產生根（或芽），然后形成完整植株。胚狀體發(fā)生途徑：愈傷組織形成胚狀體，再在另一種培養(yǎng)基上同時發(fā)展成帶有根的苗。也叫無性胚胎發(fā)生（無性系）。胚狀體是指愈傷組織中形成的與種子中胚相似的具有苗端和根端的雙極性結構。也叫體細胞胚。1.3.2.1器官發(fā)生先形成芽，后在芽基部長根。先形成根，后在根基部形成芽。在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后根、芽的維管束接通形成完整植株。僅形成芽或根。如茶樹花粉愈傷組織往往只能形成根。Shoot(caulogenesis)(a)androotdevelopment(b&c)oncallusofHypoxis1.3.2.2體細胞胚胎發(fā)生起源：合子胚是配子細胞融合的產物，即受精卵；對體細胞胚而言（合成的無性胚）融合是不需要的。形態(tài)：一個完全發(fā)育的胚是具有兩極的軸，一端是芽分裂組織，另一端是根分裂組織；也可以根據(jù)一種特殊類型的葉片——子葉來辨別。進化：胚胎發(fā)育有連續(xù)的典型形態(tài)階段（球形胚、心形胚和魚雷胚）。體細胞胚胎的特征：體胚最根本的特征是具有兩極性。即在發(fā)育的早期階段從方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都是單向極性。體胚的維管組織與外植體的該組織無解剖結構上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往住總與愈傷組織的維管組織聯(lián)系。體胚的維管組織的分布是獨立的Y字形，而不定芽的維管組織則無此現(xiàn)象。Typicalmorphologicalstagesduringembryodevelopment:(A)globular,(B)heartshaped,(C)torpedo體胚發(fā)生的方式體胚發(fā)生的方式分為直接發(fā)生和間接發(fā)生兩類。直接發(fā)生是指體胚直接從原外植體的胚性細胞不經愈傷組織階段發(fā)育而成；而間接發(fā)生是體胚從愈傷組織或懸浮細胞、有時也從已形成的體胚的一組細胞中發(fā)育而成。多數(shù)體胚是間接發(fā)生。直接發(fā)生胚性細胞：與分生組織細胞類似，通常較小，近圓形，具有較大的核和核仁并能高度染色，胞質濃厚，可直接發(fā)育成體細胞胚胎。如柑橘的珠心組織、茶樹和龍眼的子葉、香雪蘭的花序等外植體。間接發(fā)生胚胎發(fā)生叢（EC）的形成：EC是愈傷組織中一種液泡小、胞質濃的小細胞聚集成的叢狀結構。其表面是高度分生組織化的細胞團，每個表面細胞都可能發(fā)育成胚狀體。EC原培養(yǎng)基上不能使其表面的胚狀體發(fā)育，但可增殖、崩潰而不衰。EC在轉入降低或去除生長素、降低還原氮的培養(yǎng)基后，才能完成胚狀體的發(fā)育。人工種子合成或人工種子是獨立包埋的體細胞胚。通常術語“embling”用來描述從人工種子發(fā)育而來的植株。通常用海藻酸鈉作為人工種子的包埋劑。也發(fā)展了用新的自裂膠珠的方法。直到現(xiàn)在人工種子的質量和保真度仍然是人工種子產品發(fā)展和大量生產的制約因素。1.4植物組織培養(yǎng)的基本程序無菌外植體的獲得初代培養(yǎng)物的建立形態(tài)發(fā)生和植株再生培養(yǎng)產物的觀察記載1.4.1無菌外植體的獲得外植體攜帶有各種微生物，這些微生物一旦進入培養(yǎng)容器，會造成培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料污染，實驗無法進行。所以，污染是組織培養(yǎng)的一大障礙，需要利用各種滅菌劑進行外植體的滅菌。不同器官的滅菌方法莖尖、莖段、葉片根、塊莖、鱗莖花蕾果實、種子1、莖尖、莖段、葉片的滅菌清水沖洗（茸毛較多的先用皂液洗滌），吸水紙吸干。0.1％～0.2％氯化汞浸泡2～10min；或70％酒精浸數(shù)秒，再在10％次氯酸鈣浸泡5～20min（或2％15～30min）。無菌水沖洗3～5次，吸干。適當切塊，接種。2、根、塊莖、鱗莖的滅菌帶土，易損傷。仔細刷洗，切除損傷部位，增加滅菌時間或濃度。0.1％～0.2％氯化汞浸泡5～12min；或70％酒精浸數(shù)秒，再在6～10％次氯酸鈣浸泡5～20min。3、花蕾的滅菌花蕾中的花藥處于無菌狀態(tài)，采摘后可直接滅菌。70％酒精浸10～30s，

0.1％氯化汞浸泡3～10min（或1％次氯酸鈣10～20min）。4、果實、種子的滅菌有些表面具茸毛或蠟質，需加吐溫-80。果實：70％酒精浸數(shù)秒，2％次氯酸鈣10～20min。種子：0.1～0.2％氯化汞浸泡5～10min（或10％次氯酸鈣20～30min）。1.4.2初代培養(yǎng)物的建立無菌環(huán)境：外植體、培養(yǎng)基、接種器械、接種工作臺。規(guī)范操作：無菌操作合適條件：培養(yǎng)基、激素、其他添加物、外植體、培養(yǎng)條件等。抗生素的使用外植體滅菌是表面滅菌，無法除去侵入組織內部的微生物。有時可以考慮在培養(yǎng)基中加入抗生素。抗生素對植物生長可能有抑制作用，需摸索其合適的種類和濃度。注意添加方式，一般不能高壓滅菌，有些需要過濾除菌。1.4.3形態(tài)發(fā)生和植株再生

體細胞胚植株外植體（愈傷組織）具根、莖的兩極器官植株器官分化單極器官先莖后根植株先根后莖植株1.4.4培養(yǎng)產物的觀察記載愈傷組織誘導率＝產生愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)*100％胚狀體誘導率＝產生胚狀體的外植體數(shù)/外植體總數(shù)*100％芽分化率＝產生芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù)*100％發(fā)根率＝發(fā)根芽數(shù)/培養(yǎng)芽數(shù)復習思考題：簡述植物細胞全能性的概念。什么是植物細胞脫分化和再分化？愈傷組織是如何形成和生長的？植物離體培養(yǎng)中再生植株有哪些途徑？何謂植物體細胞胚胎？其發(fā)生有哪些途徑？影響植物離體形態(tài)發(fā)生的因素有哪些？為什么愈傷組織誘導一般選用固體培養(yǎng)基？愈傷組織的形成時期及特點。簡述繼代培養(yǎng)的原因及要點。體細胞胚胎的特征及發(fā)生方式。4植物器官培養(yǎng)植物器官培養(yǎng)是指對植物某一器官的全部或部分或器官原基進行離體培養(yǎng)的技術。根、莖、葉、花器、果實、種子。4.1根的培養(yǎng)根系生理代謝研究的良好實驗體系；研究器官分化、形態(tài)建成的良好體系；建立根無性系，用于制藥；誘變育種。4.1.1離體根的培養(yǎng)方法固體培養(yǎng)法：平放液體培養(yǎng)法：振蕩固體－液體雙層培養(yǎng)法：根段形態(tài)學上端插入固體培養(yǎng)基，下端朝上浸露在液體培養(yǎng)基中。其他特殊方法4.1.2離體根所用培養(yǎng)基WhiteMS、B5等大量元素減半或減2/34.1.3影響離體根生長因素基因型營養(yǎng)條件：氮源、碳源、微量元素、維生素B1激素：生長素pH光照和溫度：一般黑暗有利于根的形成。4.2.1莖段培養(yǎng)植物莖段培養(yǎng)是指對植物的帶有一個以上定芽或不定芽的外植體（包括塊莖、球莖、鱗莖在內的幼莖切段）進行離體培養(yǎng)的技術。4.2莖段和莖尖培養(yǎng)莖段培養(yǎng)的目的進行植物的離體快速繁殖。研究莖細胞的分裂潛力和全能性。誘導細胞變異和突變體的獲得。莖段培養(yǎng)的特點和優(yōu)點特點：以芽生芽的方法進行增殖。優(yōu)點：容易成功、變異小、性狀均一、繁殖速度快。莖段培養(yǎng)產物單苗（芽）叢生苗（芽）單生芽和叢生芽的增殖方式適宜植物的離體快速繁殖。完整植物愈傷組織影響因素基因型激素配比：生長素、細胞分裂素4.2.2莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng)（shoottipcultureorapicalmeristemculture）是指對植物頂端的原分生組織和它衍生的分生組織的培養(yǎng)。材料莖尖分生組織培養(yǎng)：<1mm(帶有1－2個葉原基的生長錐），可去毒。普通莖尖培養(yǎng)：幾毫米至幾十毫米的莖尖、芽尖及側芽培養(yǎng)。Shoottipculture

莖尖培養(yǎng)的一般方法材料制備：精心預處理嚴格滅菌小心取材：體視顯微鏡、解剖針莖尖培養(yǎng)注意事項取材大小：脫毒小于1mm，快繁可數(shù)毫米。莖尖微小趨向于形成愈傷組織。培養(yǎng)基：多為MS，避免2,4-D（促使外植體愈傷組織化）。莖尖分生組織培養(yǎng)與脫毒普通莖尖培養(yǎng)與繁殖技術無菌物的建立芽的增殖中間繁殖體的增殖誘導生根移栽概念：Micropropagation生長狀態(tài)及原因生長太慢：莖尖不見明顯增大，但顏色轉綠。進入休眠生長素太低溫度低生長過旺：莖尖明顯增大，基部產生愈傷組織，莖尖難于伸長，色澤較淡。生長素偏高用了2,4-D光照太弱溫度過高生長正常：莖尖逐漸轉綠，基本逐漸膨大，有時形成少量愈傷組織，莖尖逐漸伸長，最終形成小枝。影響莖尖微繁的因素基因型外植體的大小供試植株的生理狀態(tài)芽的著生部位褐變玻璃化極性后生變化形態(tài)發(fā)生能力遺傳穩(wěn)定性4.3葉