靜脈用中藥注射劑類過敏反應檢測技術規范2022-03-16發布2022-03-16實施I前言 引言 1 13術語和定義 14試驗操作要點 14.1檢測方法概述 14.2基本原則 24.3主要試劑與器材 2 25結果觀察和分析 4 45.2試驗結果判斷標準 46注意事項 5本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》給出的規則起草。請注意本文件中的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國中醫科學院中藥研究所、創新天然藥物與中藥注射劑國家重點實驗室共同提出。本文件由中華中醫藥學會歸口。本文件起草單位：中國中醫科學院中藥研究所、創新天然藥物與中藥注射劑國家重點實驗室、江西青峰藥業有限公司、中國食品藥品檢定研究院、北京市藥品檢驗所、軍事科學院軍事醫學研究院、暨南大學、上海中醫藥大學、天津中醫藥大學、天津天士力之驕藥業有限公司、華潤三九(雅安)藥業有限公司、神威藥業集團有限公司、麗珠集團利民制藥廠、無錫濟煜山禾藥業股份有限公司、上海凱寶藥業股份有限公司、廣西梧州中恒集團股份有限公司、山東丹紅制藥有限公司、安徽華潤金蟾藥業股份有限公司。本文件主要起草人：梁愛華、謝寧、易艷、高月、蔣春紅、張晗、胡宇馳、耿興超、李春英、趙雍、金若敏、葉文才、鞠愛春、張宇實、韓佳寅、李科、劉地發、鄧雙炳、劉紹勇、陳明、黃文華、姜國志、朱音、高波、王臣臣、楚慧倫、田婧卓、潘辰、王連嵋、劉素彥、方禮、陳宣坤。本文件是指導靜脈給藥途徑的中藥注射劑類過敏反應檢測的技術規范文件。在藥物過敏樣反應中，類過敏反應占比約為77%;但美國FDA、國際組織ICH的相關研究指南、美國藥典、歐洲藥典等至今仍然沒有可靠的類過敏反應動物模型和評價方法。注射劑的過敏樣反應預測、產品風險識別和控制的方法學問題一直是國際上未解決的重大科技難題。因此，建立適合于靜脈用中藥注射劑的安全性評價方法學體系、產品風險控制技術體系和技術規范是國內外醫藥領域的重大需求。本文件是在進行了系統、嚴謹的方法學研究后制定的，包括不同動物品系敏感性比較(如ICR小鼠、昆明小鼠、C57小鼠、BALB/C小鼠等),不同性別以及不同體重動物的類過敏反應差異比較研究，藥品前處理和處理后各種影響因素考察，用藥方式(劑量、濃度、體積、速度)的影響考察，樣品重復性、操作重復性、人員比對驗證等。并采用多種陽性對照品、陰性對照品以及30余種注射劑(包括中藥、西藥注射劑)等對方法學進行了驗證，證明了方法敏感性適宜、重復性好，結果判定客觀、可靠。本文件有利于促進企業對注射劑產品的工藝優化及質量提升、保障用藥安全。1靜脈用中藥注射劑類過敏反應檢測技術規范本文件提供了適用于靜脈用中藥注射劑類過敏反應評價與檢測的主要技術規范。本文件適用于靜脈用中藥注射劑研發過程中的非臨床安全性評價、已上市產品生產過程中的風險控制及上市后安全性再評價。同時，可作為從事中藥注射劑相關工作的企業、科研、檢測人員用于類過敏風險的評價、檢測與控制工作參考。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成于本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB14925-2010實驗動物環境及設施藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則(EB/OL)[國家食品藥品監督管理總局(2014年)]3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。類過敏反應pseudo-allergicreactions藥物進入體內后直接刺激肥大細胞、嗜堿性粒細胞或其他細胞，釋放血管活性物質或致敏介質而引起的反應。血管滲透性物質透過血管壁的能力。4試驗操作要點4.1檢測方法概述臨床上，類過敏反應癥狀與毛細血管通透性增高有關。毛細血管通透性增高是產生類過敏反應癥狀的主要病理機制之一。在血管通透性正常情況下，血管內的大分子膠體物質維持正常的血漿滲透壓，2保持液體在血管內循環。如果在病理因素刺激下血管通透性增高，則造成大分子物質透過血管壁漏到血管外組織，并吸引血管內的液體滲出而進入組織間隙，造成組織水腫，引起皮膚黏膜起疹、水腫、瘙癢、肺水腫、呼吸困難、缺氧、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等。血管滲透嚴重時可導致血容量下降，加之引發的滲出性炎癥導致毛細血管擴張，可導致血壓下降，促進或加重休克的發生。因此，可以以毛細血管通透性增高為指征來預測潛在的類過敏反應。具有致類過敏反應潛能的藥物首次經靜脈注射進入體內后，可能刺激肥大細胞、嗜堿性粒細胞等釋放組胺或其他致敏活性因子，從而導致毛細血管通透性增高、血管擴張。伊文思藍(EvansBlue,EB)為常用的血管通透性指示劑。EB與血漿白蛋白具有很強的親合力，經靜脈注射進入體內后，迅速與血漿白蛋白結合，形成白蛋白-EB復合物(ALB-EB)。當毛細血管通透性正常時，ALB-EB不會滲出到血管外，但當致類過敏物質導致血管通透性增高時，ALB-EB可滲出到血管外的組織間隙，而造成組織藍染。在小鼠體內，血管通透性增高造成的組織藍染可以很直觀地在小鼠耳廓觀察到(耳藍染)。通過分析小鼠發生耳廓藍染的程度以及定量檢測耳廓組織內滲出的EB含量，可以客觀地評價類過敏反應及其4.2基本原則實驗動物環境條件要求：符合GB14925-2010的規定。按照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》要求，實驗應遵循隨機、對照、重復的原則。類過敏反應檢測試驗均應設立陽性對照組、陰性對照組以及受試物不同劑量(或不同濃度)組。按照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》要求，受試物為臨床試驗樣品或上市藥品。應注明受試物的名稱、來源、批號、含量或規格、保存條件、配制方法、有效期。4.3主要試劑與器材4.3.1主要試劑主要試劑如下所示：a)EB(CAS(美國化學文摘服務社)登記號：314-13-6);b)所檢測的靜脈用中藥注射劑在臨床所使用的溶媒；c)甲酰胺(CAS登記號：75-12-7);d)組胺(CAS登記號：51-45-6);e)Compound48/80(CAS登記號：848035-21-2)。4.3.2器材電子天平(感量為“0.1mg”針對試劑稱量；感量為“0.1g”針對動物稱量);酶標儀或分光光度計；0.22μm濾膜；120目篩網；微孔板。4.4操作步驟4.4.1動物ICR小鼠或昆明小鼠，體重范圍23g~26g(10周齡~11周齡),雌雄各半，每組每種性別動物數不少于5只。如果經預試證明檢測結果無明顯性別差別，或者臨床上只用于單一性別，則可選用單3一性別動物進行試驗，每組動物數不少于10只。同一批實驗中同一性別動物之間體重差異不超過20%。實驗前動物適應環境1天～2天。采用與受試物配制相同的溶媒，將EB配制成0.8%的溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，室溫避光保存；配制后的EB溶液在一周內使用。溫度降低可導致EB溶解度降低而析出沉淀，故EB溶液不宜保存于冰箱。4.4.3對照設置陰性對照：采用臨床推薦使用的溶媒作為陰性對照。如果受試物在臨床上被推薦為直接靜脈注射時，則選用0.9%氯化鈉注射液作為陰性對照。陽性對照：采用組胺或Compound48/80作為陽性對照。采用與陰性對照相同的溶媒，臨用前配制成1%組胺溶液或2.5%Compound48/80溶液。4.4.4受試物劑量設置受試物劑量應設置不少于2個劑量水平。可采用以下兩種方式之一設置劑量：a)根據人與小鼠體表面積折算系數換算為人的臨床劑量倍數進行劑量設置，最低劑量不低于臨床等倍劑量。為了找出安全窗，最高劑量應不低于臨床5倍劑量。如果最高劑量達不到該水平，則依動物倫理原則可接受的最高給藥體積和臨床允許的最高用藥濃度作為最高劑量設計b)根據受試物臨床使用的濃度進行劑量設置，最高濃度不低于臨床最大用藥濃度，或可采用制劑原液；最低濃度不低于臨床最低用藥濃度。4.4.5注射給藥受試物和EB溶液均為靜脈注射給予。如果說明書對注射液最高輸液滴數有明確規定，則換算成對應mL·s1的注射速度。本試驗的注射速度與該速度接近。如果無靜脈滴注速度規定，注射速度不高于一般情況下，將受試物和指示劑EB分開注射，避免互相影響。考慮到操作的便捷性，可以考慮合并注射。是否適合采取合并注射方式需通過如下預實驗判定：a)將受試物與EB溶液混合后，觀察是否發生渾濁、沉淀等性狀明顯變化，如果有變化則不宜合并注射；b)考察受試物與EB溶液合并注射、受試物與EB溶液分開注射所產生的類過敏反應是否有明顯差異(納入統計的動物數每種注射方式不少于10只)。如果兩種注射方法沒有明顯差異，則可以將受試物與EB合并注射，否則需要將二者分開注射。兩種給藥方法如下：a)受試物與EB分開注射方式：分別配制不同濃度的受試物、0.8%EB溶液。小鼠經尾靜脈注射給予受試物，隨后立即注射給予0.8%EB溶液；b)受試物與EB合并注射方式：配制不同濃度的受試物，與0.8%EB溶液1:1混合，使EB終濃4度為0.4%;小鼠經尾靜脈注射給予混合液。注射體積需符合動物倫理要求，具體體積根據給藥劑量、濃度進行確定。兩種給藥方式進行平行比較時，總的給藥體積應相同。陰性對照組和陽性對照組與受試物組處理方式一致。任何注射方式下，EB劑量均為80mg·kg?1。5結果觀察和分析5.1結果觀察小鼠靜脈注射給藥完畢后，觀察給藥后30min內以下各種反應或結果：a)全身反應：觀察動物的活動、步態、口眼鼻分泌物，是否出現呼吸急促或呼吸困難，如張口呼吸、痙攣或抽搐等；b)耳廓藍染面積評分：由兩位經培訓合格的研究者進行盲法評分，采用半定量方法分別評測并記錄每只動物兩側耳廓的藍染面積，各取其中耳廓藍染面積最大的一側計算平均值，再按照表1評分，作為對應動物的最終分值。表1耳廓藍染面積(S)評分和程度耳藍染面積010<S≤1/8(藍染面積占耳廓面積的1/8,以下類推)2345c)耳廓組織中EB滲出量定量測定：給藥后30min,麻醉后脫頸椎處死小鼠。從離耳廓與腦部折疊轉角處約2mm~3mm處剪下耳廓，再用剪刀剪碎，放入試管中；加入甲酰胺溶液2mL,室溫下浸泡48h,使耳組織中的EB染料充分被萃取到甲酰胺中，溶液用200目篩網過濾，去除組織殘留。取濾出液1mL,加入到微孔板中，用酶標儀于波長610nm處測吸光度(A)。根耳廓組織中EB滲出量定量測定之前，以甲酰胺為溶劑，配制0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10μg·mL1等不同濃度的EB溶液，各取1mL加入到48孔板中，于610nm處用酶標儀測吸光度(建議標準曲線各濃度均設置平行孔);所得各濃度的吸光度數值對應相應濃度進行線性回歸分析，繪制標準曲線。5.2試驗結果判斷標準5.2.1試驗可接受的標準以下條件均符合時，實驗被認為可接受：a)陰性對照組動物耳廓藍染評分大于等于1的動物數不超過10%,且陰性對照組所有動物耳廓藍染評分均小于2;5b)陽性對照組評分大于等于3的比例大于等于60%。5.2.2類過敏反應結果判斷標準5.2.2.1主要判斷標準以耳廓藍染面積評分為主要判斷標準：a)受試物組動物均未出現耳廓藍染，或受試物組動物耳廓藍染評分均小于等于1、且評分為1的動物數小于等于40%,則結果判斷為陰性；b)受試物組動物耳廓藍染評分大于等于1的動物數大于40%,且評分大于等于2的動物數小于等于60%、且所有動物耳廓藍染評分小于3,結果為可疑；c)受試物組動物耳廓藍染評分大于等于2的動物數大于60%,且評分大于等于3的動物數小于等于10%,則結果判斷為弱陽性；d)受試物組動物耳廓藍染評分大于等于3的動物數大于10%,且評分大于等于4的動物數小于等于10%,則結果判斷為陽性；e)受試物組動物耳廓藍染評分大于等于4的動物數大于10%,則結果判斷為強陽性。如果結果為上述b)的情形，則需進行重復試驗進一步判斷。5.2.2.2輔助判斷標準以耳組織EB滲出量作為輔助判斷標準，如下所示：a)與陰性對照組相比，受試物組EB滲出增高小于等于75%,或無統計學顯著性差異，判斷為陰b)與陰性對照組相比，受試物組EB滲出增高大于75%、小于等于150%,且有統計學顯著性差異，判斷為可疑；c)與陰性對照組相比，受試物組EB滲出增高大于150%、小于等于200%,且有統計學顯著性差異，判斷為弱陽性；d)與陰性對照組相比，受