1現代組織化學（ModernHistochemistry)病理學系劉秀萍東1號樓203室Tel:54237539E-mail:xpliu1228@2組織化學發展簡史組織化學是在組織學和化學的基礎上發展起來的。歷史悠久。十九世紀初：把顯微鏡與化學技術結合起來，開始觀察組織中的化學反應。法國植物學家F.V.Raspail(1826):植物花和果受精過程中的碘淀粉反應；

M.Perls(1867):用普魯士藍顯示出鐵；

A.N.F.Millon(1844):敘述了蛋白質反應；生物組織染色核、質、細胞外基質319世紀中葉：酶發現Klebs(1868)和Stuve(1872):用愈創木酯酊同膿作用產生藍色證明組織中有過氧化物酶；P.Ehrlich(1885):發現了細胞色素氧化酶；R.Heidenhain(1868):指出核糖核酸是一種嗜堿性物質，可被醋酸沉淀；*A.Bencke(1862):把苯氨染料用于組織學領域，相繼各種蛋白質被染色出來。如脂肪的蘇丹Ⅲ染色等；420世紀中葉

：E.Takamatsu和G.Gomori(1939)：同時證明了鹼性磷酸酶的組織化學方法后，酶組織化學飛速發展------H.Coons等(1950)：異氰酸熒光素標記Ab（熒光抗體法），免疫學引入組織化學實驗中。P.K.Nakane(60年初):HRP（辣根過氧化物酶）標記Ab,對酶進行觀察（免疫酶標抗體法）Gall&Pardue(1969):分子雜交技術應用到組織切片和細胞標本上，

ISH(放射同位素）；

Sternberg(1970):Peroxidase-anti-Peroxidase(PAP)ABC法：5許世民(1981):ABC（親和免疫組化）Avidin-Biotin-PeroxidaseComplex90年代中期：EnhancedPolymerOneStep(EPOS)EnVision(EnhancedLabelledPolymerSystem,ELPS)簡稱二步法620世紀80-90年代ISH非同位素法

Biotin標記

Digoxigenin標記(洋地黃)

熒光素標記化學修飾法：磺化標記

AAF標記7現代組織化學：緒論運用物理學、化學、免疫學、分子生物學等原理與技術，對組織與細胞的化學成分、化學反應及其變化規律進行定性、定位和定量研究的科學，是介于這些學科之間的一門邊緣科學。8許多分支：如：核酸與核蛋白、蛋白質與氨基酸等有機物組織化學、無機物組織化學、酶組織化學、電鏡組織化學、熒光組織化學、免疫組織化學、同工酶組織化學和放射自顯影技術等。現代組織化學的概念已經遠遠超過了原有范圍，無論從理論、內容、技術手段、研究范圍都比過去更廣泛、更深入。

這與相關學科的發展是分不開的，其中細胞生物學、生物化學及分子生物學是組織化學形成和發展的基礎。9現代組織化學的應用1、腫瘤診斷與鑒別診斷上皮性腫瘤------角蛋白、上皮膜抗原（EMA）

間葉來源腫瘤------波形蛋白

肌源性腫瘤-----肌動、肌紅蛋白

B細胞淋巴瘤------L26（CD20），CD22

T細胞淋巴瘤------UCHL-1，CD3，CD4，CD8102、原位研究細胞功能

ISHmRNA基因轉錄水平免疫組化基因表達產物p53、AFP

酶組織化學酶活性（心肌琥珀酸脫氫酶）RACK1:(receptorofactivatedC-kinase1)113、組織細胞內病原體檢測病毒：HBV、HCV、HIV等細菌：軍團菌、幽門螺桿菌寄生蟲、霉菌4、疾病發病機理研究免疫性腎小球腎炎、器官纖維化等

HBsAgHBcAg125、染色體研究：

FISH染色體著絲粒探針染色體區域特異性探針應用乳腺癌HER-2:赫賽汀;腦膠質瘤1p、19qloss-放療136、其它：細胞凋亡癌前病變顯示:端粒體酶—宮頸癌早期預測展望：活細胞內免疫熒光根據自己的研究方向討論現代組織化學的應用14重要性：能否得到可記錄下來的令人信服的好的科研結果的因素之一。組織細胞的處理

組織細胞的結構和形態能否很好保存;生物大分子的活性(酶等)或抗原性能否盡可能保存;能否順利并重復地獲得高質量的組織切片。15一、取材：組織來源：手術切除標本，鉗取活檢，穿刺活檢，尸體解剖取材時注意事項：尸解標本死后盡快（防自溶或彌散）；代表性部位，交界處，避開壞死處用鋒利的刀刃，防止組織擠壓變形16細胞來源------細胞片的制備及處理方法：①組織印片(上皮性腫瘤)：晾干后入冷丙酮或醋酸-乙醇10分，自然干燥后使用或-20℃保存②細胞培養片：多格培養片的使用，節省時間③細胞懸液涂片：血、尿、腦脊液；體腔積液；組織穿刺吸取物；懸液中細胞濃度≈106/ml-----直接涂片使用細胞濃度低-----細胞離心涂片器（cytospin)

涂片范圍：直徑〈1厘米為好

經干燥、固定、冷藏后使用17留組織標本：免疫組化181920二.固定(Fixation)

固定的目的和意義①防止自溶；抑制組織中細菌的繁殖，防止組織腐敗。使細胞各種成分凝固成不溶性物質，防物質擴散并維持原有的組織形態結構；固定后的組織對染料有不同的親和力，染色后產生不同的折射率，顏色清晰鮮明，便于觀察。③固定劑往往兼有硬化作用，便于切片。21固定時須注意的事項:①

越早越好②根據研究目的選用合適的固定劑固定要充分和徹底（固定液充足：20倍以上；時間足夠：組織厚度5mm以內----2?3mm）④整體動物或器官灌流的方法進行預固定。(腦-----)22常用固定液的優、缺點:

（一）福馬林（Formalin）：市售的甲醛（37%-40%）,常用為10%的福馬林,實為4%的甲醛溶液。優點:

穿透力強，組織收縮小;

脂肪、神經、髓鞘固定較好；也可固定高爾基體和線粒體等;對糖有保護作用；細胞核染色佳;

可使蛋白游離氨基之間發生共價交聯，故對低分子的多肽和蛋白也有良好的固定作用;

價格低廉缺點:

甲醛易氧化為甲酸，使溶液變酸，影響核的染色;

固定時間長，產生福馬林色素影響觀察；

可使抗原結構(尤其是空間構象)發生變性而影響免疫組化染色23緩沖福馬林的配制:克服酸性，免疫組化常規的組織固定劑甲醛原液120ml磷酸二氫鈉4g磷酸氫二鈉13g蒸餾水880mlpH為7.0或:磷酸二氫鉀4g磷酸氫二鈉6.5g完全溶解后,加蒸餾水至900ml,再加甲醛原液100ml,pH為6.8～7.0附:4%多聚甲醛磷酸緩沖液:電鏡多聚甲醛40g溶于0.1mol/L，pH=7.4的PBS緩沖液500ml，加熱至60℃，攪拌下加入1mol/LNaOH數滴至溶液變清，冷卻后用0.1mol/L，pH=7.4的PBS緩沖液加到1000ml.配制藥品簡法:24（二）、酒精（乙醇）：

80～95%好,優點:

固定兼有硬化和脫水的作用;

能很好保存尿酸結晶和糖類;

對蛋白有沉淀作用，故對高分子蛋白的固定有良好效果，如漿細胞內的免疫球蛋白;缺點:

滲透力不如甲醛;

能溶解脂肪、類脂和色素;

核蛋白被酒精沉淀后能溶于水，故核著色不良，不利于染色體的固定;

高濃度---組織硬化，時間長使組織脆;

酒精本身是還原劑，易被氧化，不能與鉻酸、重鉻酸鉀、鋨酸等混合。25（三）、

A-F液（酒精-甲醛液）:

配制:無水酒精或95%酒精(A)90ml+甲醛原液(F)10ml;優點:有固定兼脫水作用，固定后可直接入95%酒精繼續脫水缺點:已在2中闡明（四）、Bouin液：用前配制配制:

苦味酸飽和水溶液75ml+甲醛原液25ml+冰醋酸5ml。

80%酒精150ml+甲醛原液60ml+冰醋酸15ml+結晶苦味酸1g。優點:

滲透力強,收縮小,染色鮮艷;(例如:腦研究---)

不會使組織變硬、變脆缺點:

固定后的組織必須經水或70～80%的酒精洗滌12h以上，以清除組織塊上的黃色;

配制較繁復，有時須新鮮配制26（五）、Carnoy液

配制:

無水酒精60ml+冰醋酸10ml+氯仿30ml

優點:

穿透力很強，適合外膜致密的組織;

對顯示DNA、RNA的效果很好，亦適用糖原和尼氏小體的固定;

固定后不需水洗，可直接投入95%脫水缺點:氯仿等有機溶劑對人體有害27（六）、以重鉻酸鉀為主的固定液：如Zenker液、Helly液、Muller液等,

各有優缺點。Zenker液：固定的組織細胞核、細胞質染色頗為清晰;Helly液：細胞質固定好，適于顯示胞質顆粒，對顯示胰島和腦垂體前葉各種細胞有良好效果;Muller液：固定作用慢，收縮小，固定需時間長。

共同缺點：配制繁復，有時需使用有毒物質（如升汞）28（七）、PLP(periodate-lysine-paraformaldehyde)固定液

A液(8%多聚甲醛):8g多聚甲醛溶于100ml雙蒸水，加熱至60℃，滴加1mol/LNaOH數滴,直至溶液透明,過濾備用;

B液（0.1mol/L鹽酸-賴氨酸緩沖液,pH7.4）:先配0.2mol/L鹽酸-賴氨酸溶液,用0.1mol/LNa2HPO4調節pH至7.4,再以pH7.4的0.1mol/L的PBS稀釋至于100ml;

臨用前：A液25ml+B液75ml，再加214mg過碘酸鈉，最終pH為6.2

優點:

固定的機制:先由過碘酸氧化糖蛋白的糖基產生醛基,再通過賴氨酸的雙價氨基與醛基結合，使糖之間發生交聯，故對保存糖蛋白的抗原性有較好效果。缺點:

配制繁復，不經濟29（八）、戊二醛-多聚甲醛緩沖液:光、電鏡免疫組織化學配制:4%多聚甲醛磷酸緩沖液中+0.5～1%戊二醛。（九）、

1%鋨酸固定液：

多用于電鏡材料的固定。配制:

A液:2%鋨酸水溶液，先將裝有鋨酸的安瓿在清潔液內洗凈，再用雙蒸水沖洗，將安瓿放入盛有50ml雙蒸水的棕色瓶中，用玻棒搗碎安瓿，使鋨酸溶于雙蒸水中，放4℃冰箱1周,注意避光；B液:0.2mol/L,pH=7.4磷酸緩沖液（PB）***A液10ml+B液10ml充分混勻即可使用（pH為7.2～7.4）。

4℃冰箱可保存1～2周，變色后則不可再用。30（十）、其它:丙酮:常用于冰凍切片或細胞涂片固定，保存抗原較好，用前4℃冰箱預冷，切片在冷丙酮中只需固定5～10min;AAA液(無水酒精85ml+冰醋酸5ml+甲醛原液10ml)：酒精冰醋酸固定液(無水酒精95ml+冰醋酸5ml):

多用于冰凍切片后固定。31

抗原固定劑切片類型細胞表面抗原不固定或酒精、丙酮固定冰凍切片

神經多肽、胺類、酶甲醛或多聚甲醛固定冰凍切片

胞內水溶性抗原,甲醛蒸氣固定冰凍切片經冷凍干燥內分泌多肽Bouin液固定石蠟切片免疫球蛋白類甲醛或Zenker液固定

肽類激素Bouin液固定

腫瘤胚胎抗原Bouin液固定石蠟切片胞外抗原酒精、丙酮固定冰凍切片

免疫電鏡戊二醛-多聚甲醛緩沖液固定常見抗原固定劑的選擇32預實驗：摸索最佳固定和切片方案。例：肝組織AFP免疫組化染色丙酮-甲醛固定為首選石油醚透明石蠟包埋較好保存AFP的抗原性，陽性染色強，幾乎沒有背景染色;其次：PLP固定液苦味酸-多聚甲醛固定液。33丙酮-甲醛PLP苦味酸-多聚甲醛95%乙醇34三、脫水(dehydration)：用不同濃度的脫水劑(常用酒精)逐步把組織中的水分置換出來，該過程---組織脫水

脫水目的：水不能與石蠟混合，石蠟包埋前必須脫去組織中水分。

常用脫水劑:

酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、環己酮等

最常用酒精，因其脫水能力強、可與水按不同比例混合、與透明劑二甲苯互溶。35

脫水注意事項:由低到高濃度。多從70%酒精開始。如組織含水多，則從更低的濃度開始(如30～40%的酒精)。以防止組織收縮過快變脆。脫水時間要適當：據組織塊大小、厚薄及組織的不同適當調整。時間短：脫水不徹底，透明及浸蠟受影響，切片難切，質量差，染色效果也差；

時間過長：組織會收縮變硬變脆。適當時間：各級酒精〈12h，無水酒精〈4h。不能進行下去，標本退回至80%酒精保存。（脂肪組織、疏松的纖維組織適當增加脫水時間；胃粘膜、支氣管粘膜活檢組織應適當縮短脫水時間）3.最后兩次無水酒精必須保持無水（保證脫水徹底），酒精定時更換，一般兩周更換一次；在無水酒精中放置無水硫酸銅吸水。36脫水的步驟和時間：如1.8cmX1.8cm,厚0.2～0.3cm的組織塊，按下步驟和時間脫水:70%酒精1～2h80%酒精2～4h90%酒精2～4h95%酒精2～4h

無水酒精12～4h

無水酒精22～4h37免疫組織化學染色

70%酒精4℃冰箱2～4h或過夜

80%酒精4℃冰箱2～4h90%酒精4℃冰箱2～3h95%酒精14℃冰箱1～2h95%酒精24℃冰箱1～2h

無水酒精14℃冰箱1h

無水酒精24℃冰箱1h

二甲苯14℃冰箱1h

二甲苯24℃冰箱0.5h

石蠟160℃1h

石蠟260℃2h38

為縮短固定、脫水、包埋的時間，盡可能保存組織的抗原性，提高免疫組化染色的陽性結果，

組織塊應盡量修得小一些、薄一些，使組織能在較短的時間內充分地完成固定、脫水、透明和浸蠟。39四.包埋(embedding)目的：使組織塊保持一定的形狀和硬度，以便在切片機上切成薄片。方法：石蠟包埋和冷凍包埋兩種方法。（一）石蠟包埋：包埋時要觀察面朝下。（脫水）---透明、浸蠟、包埋：透明：組織脫水后，因為酒精等脫水劑不能溶解石蠟，所以在浸蠟前需要一個既能與酒精混合又能溶解石蠟的媒劑進行處理，以便能使石蠟滲入到組織中。由于所用媒劑的折光率與組織蛋白質的折光率相近，可使組織透明，因此把這一過程稱之～。(二甲苯)40（二）冷凍包埋冷凍包埋能較好保存抗原，新鮮及已固定材料均適合冷凍包埋、切片。

目的：減少組織中的水分以減少冰結晶的產生；

方法：已固定、沖洗的組織塊放入20～30%蔗糖緩沖液內，4℃冰箱過夜，再將組織塊埋于OCT包埋劑或甲基纖維素內，以備速凍；但實際操作時可不一定經過蔗糖緩沖液預脫水。日本研究----腦研究：★防止冰結晶的方法1-----進行預處理：41目的：使溫度很快下降,迅速通過冰點，防止冰結晶產生。液氮法:將OCT包埋的組織塊投入液氮數秒，組織塊凍結后，立即移入低溫冰箱(裝入封口塑料袋內密封)或放入恒冷切片機恒冷箱內以備切片;干冰-丙酮法:將200ml丙酮注入小型廣口保溫瓶或保溫杯內，逐漸加入干冰至飽和不再冒泡為止，溫度可達-70℃；將裝有50ml異戊烷的小燒杯緩慢置入干冰-丙酮飽和液中；然后將OCT包埋的組織塊投入異戊烷內速凍半分至一分鐘。異戌烷干冰丙酮★防止冰結晶的方法2-----速凍：例子42五.切片(cutting)免疫組化用的石蠟切片注意點：⑴切片要平整，盡量避免因切片刀的缺口造成組織破損或劃痕，影響形態完整、出現非特異著色。

⑵不間斷的連續切片，以便在相鄰切片上作不同染色(包括常規H.E.染色)，供觀察時對照、比較。⑶切片附貼牢固,免疫組化染色常需長時間、反復多次浸泡于試劑以及振蕩洗滌，有的尚須經蛋白酶消化，容易造成切片漂浮、脫落。43防石蠟切片脫片的措施：①載玻片須仔細清洗(清洗液浸泡、流水漂洗、烘干)，絕無油污；②附貼切片前，在潔凈載玻片上涂抹粘附劑（可用白膠、多聚賴氨酸或氨丙基三乙氧基硅烷，方法見附錄10)；③蠟片在溫水中充分展開，去除皺折，用粘附劑預處理過的載玻片撈取、附貼；④載有切片的玻片經56℃1h后37℃過夜徹底烘片；⑤備用切片裝在盒中4℃冰箱保存，如需長期保存，切片宜用鋁箔包裹后進冰箱，染色前取出再經37℃烘過夜。44免疫組化用的冰凍切片注意事項：

①同樣要求附貼平整，并有連續性。為此載玻片也應清潔無油污，但一般無需涂抹粘附劑。

②切片時，使用恒溫冷凍切片機，在箱內溫度-25℃、防卷板角度恰當的情況下，可獲得滿意的切片。

③附貼后的冰凍切片室溫下自然晾干1～2h后，進冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，待干燥后作免疫組化染色或封存于-20℃。

*注意:

冰凍切片由于切片技術要求較高，不易得到連櫝性很好的切片，其形態結構亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便于長期貯存，因此冰凍切片的應用受限。45六.染色

免疫組化顯色后，為顯示組織形態，常襯染；蘇木精細胞核紫藍色甲基綠細胞核綠色；亮綠或核固紅使組織背景呈綠色或紅色。免疫熒光染色后：一般不用襯染，組織形態的分辨有一定困難，必要時可以PropidiumIodide顯示細胞核(紅色熒光)或DAPI(淺藍色熒光)。46七.切片封固和保存封固：多數免疫酶染色后的切片可用樹膠封片，既利于觀察、攝影，又能保存較長時間（與常規H.E.染色相同，經脫水、透明后滴加樹膠、加蓋玻片）。

有些免疫酶呈色反應后，有色沉淀物能溶于乙醇，則不能用乙醇脫水，可烘干(或晾干)后直接樹膠封片。另一些免疫酶染色及免疫熒光染色須用水溶性封固劑，如明膠、甘油緩沖液，也可用聚乙烯乙醇(Elvanol)。

保存：免疫酶染色切片在室溫、避光下一般能保存較長時間。

熒光染色后，熒光強度隨時間延長而減弱，4℃以下避光情況下可作短期保存(數天至數周)。經紫外光激發后淬滅更快，因此一般在染色后盡快觀察并攝影記錄。47必要性：1.冰凍切片能很好地保存組織抗原性，適合免疫組化和雜交組化染色，但其組織形態的清晰度或分辨率遠不如石蠟切片。如果沒有很好的冰凍組織庫，也無法進行回顧性研究。2.如果不作特殊的預處理，石蠟切片中的抗原大部不能被檢出，出現假陰性結果。

實際工作中（尤其臨床病理），大量的免疫組化染色是在石蠟切片上進行。

經常規福爾馬林固定、石蠟包埋處理的組織，其中的蛋白大分子發生分子內或分子間的交聯（cross-links），從而屏蔽抗原決定簇或使其三維結構的構象發生改變。其它固定劑也有類似的抗原屏蔽作用。

因此，石蠟組織切片免疫組化染色是否成功在很大程度上取決于組織中抗原性修復（antigenretrieval）的好壞。石蠟組織切片中抗原性的修復481976年：加拿大籍華人黃少南就首先采用胰蛋白酶來消化石蠟切片以改善免疫熒光染色，取得很好效果。1991年，Shi第一個采用微波爐進行石蠟切片抗原性的修復。在其啟發下，通過加熱進行抗原性修復的方法層出不窮（蒸氣式高壓消毒鍋，家用高壓鍋、水浴加熱法）。石蠟組織切片中抗原性的修復

綜上所述，抗原性修復的方法只有二類，即蛋白酶消化法和熱修復法。究竟采取何種方法，應根據固定劑、固定時間長短、所檢抗原的不同來決定。49（一）蛋白酶消化修復：最常用：胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶等。有些抗原需用特殊的酶進行消化，如IgE要用蛋白酶XXIV消化免疫組化染色結果好。機制：尚不完全清楚。蛋白酶消化可能切斷蛋白分子間的交聯暴露抗原決定簇。達到預期目的：除了用最合適蛋白酶外，還應注意酶的工作濃度、輔酶的使用、pH值及最適反應溫度。常用蛋白酶的工作濃度：胰蛋白酶（含0.1%CaCl2）：0.05%～0.1%；鏈霉蛋白酶為0.0025%；胃蛋白酶為0.1%。消化時間與固定時間有關，固定時間久者應適當延長消化時間。注意點：消化不足，抗原決定簇未充分暴露，免疫組化陽性染色很淡或不顯示。消化過度，組織形態結構破壞并可引起脫片。不合適的蛋白酶消化還可能出現假陽性或假陰性。50（二）熱修復(Heat-mediatedAntigenRetrieval)1991年Shi:石蠟切片放入經微波爐沸騰的重金屬溶液中加熱，原無法用免疫組化顯示的抗原顯示了很好的陽性染色，且形態結構保存完好。奠定了抗原性熱修復的實驗基礎。熱修復的原理:

眾說紛紜，二種觀點有一定說服力，

①福爾馬林固定主要通過甲烯橋形成的共價鍵和雪夫鹼（Schiffbase）形成的弱分子引力使蛋白分子發生交聯，加熱后，消除雪夫鹼引力，此時蛋白分子的構象處于固定與未固定的中間狀態，不同程度地恢復了抗原分子的自然構象。

②加熱可削弱或打斷由鈣離子介導的化學鍵，從而減弱或消除蛋白分子的交聯，恢復抗原性。優點:

熱修復增加免疫組化染色陽性細胞數及陽性強度，及熱修復所需的時間與固定時間關系不大。但對固定時間過長的組織，加熱的時間也應適當延長。