生化工程學(xué)實驗一、實驗?zāi)康?1)通過超氧化物歧化酶的分離純化,了解有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)以及纖維素離子交換層析方法的原理。(2)掌握測定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。二、原理超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)簡稱SOD,它廣泛存在于各類生物體內(nèi),按其所含金屬離子的不同,可分為3種:Cu·Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。SOD催化如下反應(yīng):O2.-+O2-+2H+→H202+02------自由基清除劑實驗一、SOD酶粗酶液的分離純化

分離純化的原理

（1）Mn-SOD易溶于乙醇；（2）K2HP04極易溶于水；（3）極性有機溶劑丙酮沉淀SOD;(4)纖維素陰離子交換柱純化。X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋X＋Z＋X＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上樣吸附洗雜洗脫離子交換法（2）根據(jù)分子電離性質(zhì)的差異性進(jìn)行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法。三、實驗步驟：1、粗酶液的獲得：收集50mL發(fā)酵液菌體，離心收集菌體。15mL磷酸鉀緩沖液重懸菌體，并加入75ulTriton冰上裂解菌體10min，超聲破碎（400w,5’’-3’’,90次），8000rpm離心10’，上清即為SOD粗酶液,取上清12ml（留樣1mL測酶活和蛋白含量--A）。2、氯仿去蛋白：上清中緩慢加入1/4體積的4℃下預(yù)冷過的95%乙醇3mL,然后再緩慢加入在4℃下預(yù)冷過的氯仿1.8mL(0.15倍體積),充分?jǐn)嚢?8000rpm離心10min,棄去沉淀,收集上清液約10mL(留樣0.5mL測酶活和蛋白含量---B)。3、K2HP04去水：加入K2HP04·3H20(按43gk2HP04·3H20/100mL粗提液的比例),約4g充分振搖，靜止分層，收集上層，離心8000rpm，10min,棄沉淀,得上清液約8mL(留樣0.5mL測酶活和蛋白含量-C)

4、丙酮沉淀蛋白并透析：上一步得到的上清液加入0.75倍體積在4℃下預(yù)冷過的丙酮,Mn-SOD便沉淀下來。離心8000rpm，10min,收集灰白色沉淀物。將沉淀物溶于約3mLddH2O中,在4℃下,對250mLpH7.6,2.5mmol/L的磷酸鉀緩沖液透析,每隔20’以上,換透析外液1次,共換2-3次。透析內(nèi)液如出現(xiàn)沉淀,需8000rpm，10min,棄去沉淀,收集上清液約5ml(留樣0.3mL-D)

。5、DE-52纖維素柱層析：將上一步所得離心上清液過DE-52纖維素柱。用pH7.6,2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液作層析柱平衡液,用pH7.6,2.5mmol/L(100mL)-200mmol/L(l00mL)的磷酸鉀緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。流速30mL/h,每管收集3mL,記錄總體積。實驗二、SOD蛋白濃度及酶活測定一、實驗?zāi)康恼莆盏鞍缀亢蚐OD酶活性的測定方法。二、原理酶的比活性用每毫克蛋白質(zhì)具有的活性單位來表示，因此，測定樣品的比活性必須測定：（1）每毫升樣品中的蛋白質(zhì)毫克數(shù)。（2）每毫升樣品中的酶活性單位數(shù)。SOD測定方法采用鄰苯三酚自氧化法:鄰苯三酚在堿性條件下,能迅速自氧化,釋放出O2-,生成帶色的中間產(chǎn)物。中間物在420nm波長處有強烈光吸收,當(dāng)有SOD存在時,由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成02和H202,從而阻止了中間物的積累,因此,通過計算就可求出SOD的酶活性。非變性電泳分離膠配方分離膠10%共12mlH2O5ml30%凝膠貯存液4ml4X分離膠緩沖液（PH=8.8）3ml10%過硫酸銨200ulTEMED16ul非變性電泳濃縮膠配方濃縮膠4.5%共8mlH2O4.8ml30%凝膠貯存液1.2ml4X濃縮膠緩沖液（PH=8.8）2ml10%過硫酸銨100ulTEMED10ul三、實驗步驟1.測蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣0.4mg/ml：立即混勻，室溫放置2-3分鐘，595nm比色，空白管調(diào)零。（2）計算出各階段樣品的蛋白濃度。mlABCDE空白蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣ml0.050.100.150.200.25DD水0.200.150.100.050.25G2505.05.05.05.05.05.0三、實驗步驟1.卡馬斯亮藍(lán)法測蛋白（1）取7只試管，編號，按下表操作：

立即混勻，室溫放置2-3分鐘，595nm比色，空白管調(diào)零。（2）計算出各階段樣品的蛋白濃度。mlABCDE空白各段樣品ml0.010.010.010.050.25DD水0.240.240.240.200.25G2505.05.05.05.05.05.0三、實驗步驟2.酶活性的測定（1）鄰苯三酚自氧化速率的測定試劑對照管/ml樣品管/ml最終濃度pH8.的100mmol/LTris-二甲胂酸鈉緩沖液(內(nèi)含2mmol/L)二乙基三氨五乙酸)4.54.550,Ph8.2Tris-二甲胂酸鈉緩沖液(內(nèi)含1mmol/L)二乙基三氨五乙酸)Dd水4.24.2-10mmol/LHCL

0.3--6mmol/L鄰苯三酚

-0.30.2總體積99-25℃下保溫20min,后加入25℃預(yù)熱過的鄰苯三酚(對照管用10mmol/LHC1代替鄰苯三酚),迅速搖勻,立即傾人比色杯中,在420nm波長處測定A值,每隔30s讀數(shù)一次,要求自氧化速率控制在0.06OA/mn(可增減鄰苯三酚的加人量,使速率正好是0.06OA/min)。三、實驗步驟2.酶活性的測定試劑對照管/ml樣品管/ml最終濃度pH8.的100mmol/LTris-二甲胂酸鈉緩沖液(內(nèi)含2mmol/L)二乙基三氨五乙酸)4.54.550,Ph8.2Tris-二甲胂酸鈉緩沖液(內(nèi)含1mmol/L)二乙基三氨五乙酸)酶溶液-0.1-重蒸水

4.24.1-6mmol/L鄰苯三酚

-0.30.210mmol/LHCL0.3--總體積99-表2酶活性測定加樣表3、酶活性和比活的計算每毫升酶液活性單位（U/mL）=（0.06-酶樣品管自氧化速率）/0.06×100%×反應(yīng)液總體積×酶樣品液稀釋倍數(shù)

50%酶樣品液體積總活性（U）=每毫升酶液活性單位(U/mL)X酶原液總體積比活=每毫升酶液活性單位(U/mL)每毫升蛋白濃度(mg/mL)

=總活性單位數(shù)(U)

總蛋白(mg)

實驗三超氧化物歧化酶活性染色鑒定法一、實驗?zāi)康?1)學(xué)習(xí)超氧化酶歧化酶活性染色原理。(2)掌握超氧化物歧化酶活性染色技術(shù)，對純化方案進(jìn)行評價。二、原理

超氧化物陰離子自由基能對氯化硝基四氮藍(lán)(NBT)進(jìn)行光化還原,生成紫色的甲滕(formazan)。SOD能催化下列反應(yīng):02.-+02-+2H+→H202+02所以當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中存在SOD時,便促使超氧化物陰離子自由基02.-形成過氧化氫,從而抑NBT的光化還原,也就是抑制了藍(lán)紫色甲騰生成。三、實驗步驟：1、安裝垂直板電泳槽,2、配膠及灌膠配制10%PAA分離膠,及3.75%PAA濃縮膠。3.加樣取2OμL錳SOD溶液及純化的大腸桿菌錳SOD加人等體積40%蔗糖(內(nèi)含少量0.1%溴酚藍(lán))。每孔加人上述混合液4μL,8μL及10μL,以對稱的方式加樣,以便一分為二,分別進(jìn)行蛋白及酶活性染色。4、電泳連接電源,上槽接負(fù)極,下槽接正極，調(diào)節(jié)電流至15mA,待樣品由濃縮膠進(jìn)入分離膠時,再將電流調(diào)至20-30mA,當(dāng)染料前沿距離硅橡膠框1-2cm時,關(guān)閉電源,電泳結(jié)束取出膠片,一分為二。5、染色、脫色(1)蛋白質(zhì)染色與脫色:染色用0.05%考馬斯亮藍(lán)R250(內(nèi)含20%磺基水楊酸),脫色液7%乙酸。染色、脫色,保存。(2)SOD活性染色:取另一半凝膠板,按下列順序浸泡于培養(yǎng)皿中染色。A.2.45×10-3mol/LNBT溶液,在黑暗條件下浸泡20min。B.3.60×10-2mol/LpH7.8磷酸鈉緩沖液(內(nèi)含2.80×10-2mol/LTEMED和2.80