-14-茶樹菇廢料對滑菇漆霉活性變化規律的影響1引言1.1滑菇漆酶測定滑菇作為一種白腐真菌十幾年前就被證明可以產生漆酶。而漆酶（Laccase,苯二醇氧化還原酶），因為對多種有毒性物質的分解降解均有作用，所以漆酶能夠降解木質素，這使漆酶在廢水處理和生物漂白等方面發揮著重要的作用[4]。漆酶在工業上可用于除去廢水毒性，最近幾年來，在制造除草劑、飲料飲品加工、環境保護、造紙等各個方面也都得到了廣泛的研究和應用。漆酶是一種含有銅離子的活性蛋白質，通過3種銅離子的協同傳遞電子以及變化價態的過程來實現對酚及其衍生物、羧酸及其衍生物、芳胺等物質的催化氧化作用，且漆酶的活性中心含有4個3種不同的銅離子，因此起到對毒物的降解和對環境的保護。而香菇已經被證實可產生活性很強的漆酶，因為其具有價格低、易于栽、培產量大等特點。1.2漆酶：漆酶是一種含Cu2+的多酚氧化酶[1]，能催化酚類等6大類約250多種不同類型底物的氧化反應[2]，是一類性質相近而又不完全相同的多酚氧化酶的總稱，不同來源的漆酶其氧化能力和反應性能有較大的差異[3]。由于漆酶具有特殊的催化性能和廣泛的作用底物，所以其在木質素降解[4]、染料脫色[5]、綠色有機物質的合成[6]、紙漿漂白[7]、含酚廢水檢測及處[8]、生物燃料電池的陰極反應[9]、食品飲料中酚類物質的去除[10]。研究還發現很多食用菌菌體中富含漆酶，它有利于呼吸過程中電子傳遞的正常運行，呼吸過程正常運轉，為菌體的生命活動提供充足的可利用的能量，從而加速菌體的生長發育[11]。此外，在菌絲體生長發育過程中，漆酶在分解木質素的同時還會產生酚類或醌類化合物，而酚類或醌類物質是有毒物質，是1種很好的殺蟲劑，能夠抑制雜菌的生長，從而防止雜菌進一步污染，并影響菇類菌體的生長發育[12]。由此可見，漆酶參與真菌體內的許多生物化學反應，具有重要的生理功能[13]，影響著真菌的發育及形態的發生[14]。如何縮短食用菌生產周期及提高抗雜菌能力、降低成本，是為了針對目前有些珍貴食用菌生產周期長、生產成本高的實際情況，成為目前食用菌育種亟待解決的關鍵問題之一，這也體現了食用菌在不同條件下菌絲產漆酶規律的相關性研究甚少。等方面具有廣泛的應用潛力。漆酶可存活于空氣中，不過漆酶普遍的存在菇、菌及植物中，本質上是一種環保型酵素，其反應后唯一的產物就是H2O。作為高效的生物檢測器，漆酶獨特的催化特性使其在生物檢測中有廣泛的應用，可以成為底物、輔酶、抑制劑等成分分析的有漆酶的測定方法較多，其中本次的實驗采用的是分光光度法，因為它的實驗條件要求低、并且還易于操作和靈敏度高等，其他方法還有比如高壓液相色譜法、氧吸收法、極譜法及脈沖激光光聲光譜法等。測定活性利用的可用底物還有鄰苯二酚、2，6-甲氧基酚等，這次選擇的底物是ABTS（2，2-聯氮-3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）。本實驗通過探究香菇培養基微堿化對漆酶活性的影響，從而得出不同的PH值對產生的漆酶活的性不同，同時對于香菇產漆酶的量以及活性強度提供一些的理論依據。2材料與方法2.1.1原料玉米粉、酵母膏、蔗糖均購于市場。磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、維生素B1由寧德師范學院生物實驗中心食用菌研究室提供。茶樹菇廢料由古田食用菌基地提供滑菇菌種引進單位為三明真菌研究所接種日期為2018年12月，由寧德師范學院生物實驗中心食用菌研究室保藏。2.1.2儀器設備水浴鍋、MC電子天平（YP802N）、超聲細胞粉碎機、電磁爐、高壓滅菌鍋、生化培養箱（SPX-250B-Z型）、鼓風干燥箱（DHG-9070A）、超凈工作臺（SW--CJ--2D型）、搖床、離心機（TGL-15B）、紫外可見分光度計（T6新世紀）、酒精燈、培養皿、打孔器、接種鉤、燒杯、玻璃棒、25*200試管、30ml離心管、錐形瓶等。2.1.3藥品瓊脂粉；葡萄糖粉(購于福州貝爾曼公司)；氫氧化鈉；磷酸二氫鉀(購于福州貝爾曼公司)；七水硫酸鎂；ABTS;98%乙醇；蛋白胨(購于福州貝爾曼公司)；酵母膏(購于福州貝爾曼公司)；維生素B1(購于福州貝爾曼公司);醋酸-醋酸鈉緩沖液(寧德師范學院生物實驗中心食用菌研究室提供）；試劑及其配置表2-1-3試劑配置方法表試劑名稱試劑濃度配置方法準確稱取0.137gＡＢＴＳ，ABTS緩沖液0.25mol/L用０.１ｍｏｌ／Ｌ醋酸－醋酸鈉緩沖溶液定容到１Ｌ準確稱取3.86克冰醋酸和醋酸－醋酸鈉緩沖溶液0.1mol/L2.93克醋酸鈉加入到接近1升的蒸餾水水中,充分攪拌,定容至1升2.2方法2.2.1菌種的活化以及擴種①制備1000ml的PDA培養基，用高壓滅菌鍋（121攝氏度20min）將滅菌工具放在干燥箱（60攝氏度3小時）中烘干后放入超凈工作臺和并將滅菌后的PDA培養基進行倒皿冷卻備用；②將保存于4℃冰箱中的滑菇食用菌的試管母種進行活化，菌種取出放入25℃恒溫培養箱中或者放在室內常溫活化24—48h,活化結束后將菌種轉接到PDA試管培養基上。③25℃恒溫培養10--12天，待菌絲將要長滿培養皿后，取后將剩余部分放入4℃的冰箱中保存備用，同時將未置于冰箱的PDA試管培養基利用打孔器和鑷子轉接到固化培養基上，放入25℃恒溫培養箱中培養10—15天（具體天數依據菌絲長滿培養基表面為準），放入冰箱備用。2.2.2培養基的配制本次實驗設計一個培養基配方[15]：標準液體培養基（玉米粉30g、蔗糖20g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、廢料0g）培養基的制作：液體培養基的制作：①稱量（1）廢料0g、酵母膏3g、維生素B10.05g、七水硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀1g、蔗糖20g、玉米粉30g；（2）廢料10g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖16g、玉米粉24g；（3）廢料20g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖12g、玉米粉18g；（4）廢料30g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖8g、玉米粉12g；（5）廢料40g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖4g、玉米粉6g；（6）廢料50g、酵母膏3g、磷酸二氫鉀1g、七水硫酸鎂0.5g、維生素B10.05g、蔗糖0g、玉米粉0g；②用1000ml燒杯，先加入500ml的自來水，再加入將上述稱取的相應藥品，攪拌均勻后倒入1000ml的量筒定容；③取干燥潔凈的500ml錐形瓶分裝發酵液，在瓶口包上封口膜與報紙和包好的打孔器（5mm）、鑷子等接種器具進行高壓滅菌，在121℃下滅菌20min后，將接種器具放入60℃的烘干箱烘3h。④接種，待發酵液冷卻后，與接種器具一起放入超凈工作臺進行紫外燈滅菌30min,接入上述平板菌種，每瓶接入5個5mm的菌球；⑤培養，在28℃150r/min的搖床里搖床培養16d后備用；2.2.3滅菌液體培養基的滅菌準備好500ml的錐形瓶，將上述的液體培養基分別裝入，并貼好標簽，和包好的打孔器、鑷子和離心管等接一起放入高壓滅菌鍋內進行121℃高壓滅菌，滅菌20min左右。取出，接種器和離心管放入烘干機60℃烘干。2.2.4接種及培養液體培養基的接種將已經調節好pH的液體培養基分別倒入250ml的錐形瓶中，然后和接種儀器置于超凈工作臺，紫外燈照消毒30min,然后用滑菇菌種對不同廢料比例的培養基進行接種，用內直徑為4mm的無菌打孔器，接種量為5個，將接完種的錐形瓶移入搖床中進行搖床培養，在28℃150r/min的搖床里搖床培養，2-16d左右進行酶活性檢測。2.2.5粗酶液的提取液體培養基粗酶液的提取：用四層紗布包扎，對粗酶液經過過濾處理后，使用規格為4000r/min離心機進行離心10min后取其上清液，即為粗酶液。可用冷藏箱保存備用。2.2.6酶活力的測定液體培養基的酶活力測定（1）ABTS溶液配制：用0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液將0.137g的ABTS定容至1L，配制成濃度為0.25mol/LABTS緩沖液。（2）將搖床培養2-16d左右的培養液利用過濾網過濾后得到濾液，再取濾液30ml于離心管中；（3）將離心管進行4000r/min離心,離心后放于4℃的冰箱中備用ABTS測定酶活：采用ABTS法，分別移取1ml粗酶液置于兩只試管中，設立對照組，將作為對照的其中一只試管煮沸5min，作向兩只試管中分別加入2mlABTS（濃度為0.25mmol/L）緩沖液放于40℃水浴鍋中進行水浴，水浴時間為3分鐘，水浴結束后取出后在410nm波長處測吸光度。一個酶活力單位用每分鐘吸光度增加0.1為一個酶活力單位。式中：V1為反應總體積/mL；V2為測定酶活力時所取的酶液體積/mL；N為酶液稀釋倍數；Δt為反應時間的變化量；ε為3.6×104/(mol/(L?cm))；ΔA為吸光度的增量。3實驗結果與分析3.1液體培養基茶樹菇廢料比例對漆酶活性的影響菌絲培養2d后到設計的取樣點，培養2—16d，每隔2d取樣檢測表3-2-1Day2配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復1重復2重復30.050.010%13.35512.0212.0212.47±0.885abA20%16.02613.35512.0213.8±2.226aA40%12.024.0112.029.35±5.34abcAB60%10.68410.6842.678.01±5.34bcAB80%6.6774.012.674.45±2.227cdBC100%01.3400.45±0.89dC表3-2-2Day4配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復1重復2重復3單位（U/L）0.050.010%380.609364.583212.34319.18±92.87abAB20%563.568455.395401.976473.65±82.33aA40%156.25328.526312.5265.76±95.18bABC60%397.97130.876130.876219.91±154.21bcBCD80%45.40674.78696.15472.12±25.48cdCD100%030.71616.02615.58±15.36dD表3-2-3Day6配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復1重復2重復3單位（U/L）0.050.010%1017.6281069.712993.591026.98±38.91aA20%1100.4271065.7051136.4851100.87±35.39aA40%777.244572.917682.425677.53±102.25bB60%572.9166667711.806638.355641.03±69.48bB80%297.81156.25344.551266.2±98.05cC100%74.78638.729104.16772.56±32.78dD表3-2-4Day8配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復1重復2重復3單位（U/L）0.050.010%1901.7091772.1691718.751797.54±94.08bAB20%2049.9472139.4232106.0362098.47±45.22aA40%1406.251477.031860.311581.2±244.3bBC60%1237.9811335.471235.311269.59±57.07cC80%1069.712830.662771.902890.76±157.74dD100%136.218348.558132.212205.66±123.77eE表3-2-5Day10配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復1重復2重復3單位（U/L）0.050.010%2180.8232353.0982114.0492215.99±123.34bB20%2697.652649.5732800.4812715.9±77.09aA40%2048.6112202.191681.3571977.39±267.62bcBC60%1621.2611778.8461956.4641785.52±167.7cC80%1366.1861284.7221266.0261305.64±53.26dD100%311.165439.37244.391331.64±99.09eE表3-2-6Day12配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復1重復2重復3單位（U/L）0.050.010%1945.781760.151741.4531815.79±112.96bB20%2067.3082122.0622122.0622103.81±31.61aA40%1427.6181514.4231469.0171470.35±43.42cC60%1291.341371.5281179.221280.7±96.59dC80%1067.041977.564892.094978.9±87.48eD100%391.293393.964169.605318.29±128.77fE表3-2-7Day14配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復1重復2重復3單位（U/L）0.050.010%1316.7741172.5431499.7331329.68±163.98aA20%1378.2051485.0431339.4761400.91±75.39aA40%1140.4911080.3951033.6541084.85±53.56bB60%1005.609897.436981.571961.54±56.8bcBC80%968.216797.276805.289856.93±96.46cC100%174.947172.276129.541158.92±25.48dD表3-2-8Day16配方酶活力酶活力平均值差異顯著性重復1重復2重復3單位（U/L）0.050.010%1018.964830.6621088.408979.34±133.36abAB20%1111.1111021.6351278.0451136.93±130.14aA40%862.714813.301759.882811.97±51.43bcBC60%962.874685.096836.004827.99±139.06bcBC80%789.263564.904699.786684.65±112.94cC100%134.882110.84482.799109.51±26.07dD從表3-2-1至表3-2-8可以看出，廢料濃度20%的漆酶活力均值最高，其中當菌絲生長到第10天時酶活力峰值達到最高2715.9±77.09U/L。滑菇液體培養基在廢料濃度20%時漆酶活性最強，培育基的廢料比例能夠影響漆酶的活力值大小。實驗表明：滑菇液體培養基廢料比例的不同對滑菇菌絲漆酶活性有影響，在廢料比例為20%時漆酶活力最大，所以廢料比例20%時對菌絲漆酶活性的促進作用最強。圖3.1.1液體培養基不同茶樹菇廢料濃度滑菇的漆酶活力值從圖3.1.1中可以看出滑菇液體培養基在不同的廢料比例中，滑菇漆酶活性隨著廢料比例的上升呈先上升后下降的鐘罩型，在時間2-16天的測試中都在第10天的菌絲酶活性達到最強。對比廢料比例不同的漆酶酶活性的大小和變化，可以看出隨著廢料比例的上升，漆酶活力值先上升再下降，廢料比例為20%時滑菇有較高的分泌漆酶的能力。圖3.1.1液體培養基不同日期滑菇的漆酶活力值4結論與討論液體培養基從菌絲的生長速度方面而言菌絲球差異較大，且廢料比例為20%時，液體培養基的滑菇菌絲球的生長速度最快。經ABTS法檢測菌絲漆酶活性，廢料比例為100%時菌絲的吸光值最小，即漆酶活性最弱；廢料比例為20%時菌絲的吸光值最大，即漆酶活性最強。計算后發現酶活力在0%、20%、40%、60%、80%、100%時差異顯著。因此，為提高漆酶活性，可使用20%的茶樹菇廢料進行培養。生產培養基從菌絲的生長速度方面而言菌絲生長差異較大，且廢料比例為20%時，生產培養基的滑菇菌絲球的生長速度均很快。經ABTS法檢測菌絲漆酶活性，從表3-1-4可以看出加廢料比例在80%時菌絲的吸光值最小，即漆酶活性最弱；廢料比例在20%時菌絲的吸光值均較大，即漆酶活性相對較強。計算后發現酶活力在0%、20%、40%、60%、80%、100%時差異顯著。因此，為提高漆酶活性，可使用20%的茶樹菇廢料進行培養。參考文獻[1]凌慶枝,董麗輝,高麗麗,等.亮菌漆酶的初步研究[J].食品科學,2009,30(19):190-193.[2]BourbonnaisR,PaiceMG,FreiermuthB,etal.ReactivitiesofvariousmediatorsandlaccaseswithKraftpulpandligninmodelcompounds[J].ApplEnviron,Microbiol,1997,63:4627-4632.[3]胡平平,付時雨.漆酶催化活性中心結構及其特性研究進展[J].林產化學與工業,2001,21(3):69-75[4]SREBOTNIKE,HAMMELKF.Degradationofnonphenolicligninbythelassace/1-hydroxy-benzotriazolesystem[J].JournalofBiotechnology,2002,81(2/3):179-188.[5]高恩麗,張數江,夏黎明.云芝菌發酵產漆酶及其對靛藍脫色的研究[J].高校化學工程學報,2007,21(1):111-115.[6]KARASMYSHEVAV,SHLEEVSV,KOROLEVAOV,etal.Laccasecatclyzedsynthesisofconductingpolyaniline[J].EnzymeMicrobTechnol,2003,33(5):556-564.[7]CALLHP,MüCKEI.Historyofoverviewandapplicationsofmediatedlignolyticsystems,especiallyhccase-mediator-systems(Ligonzym?-process)[J].JBiotechnol,1997,53(2/3):163-202.[8]GomesSASS，NogueiraJMF，ＲebeloMJF．Anamperometricbiosensorforpolyphenoliccompoundsinredwine［J］．BiosensorsandBioelectronics，2004，20(6):1211－1216．[9]FabioV，AntonioC，SantaＲ，etal．Ahighsensitivityamperometricbiosensorusingamonomolecularlayeroflaccaseasbiorecognitionelement［J］．BiosensorsandBioelectronics，2004，20(2):315－321．[10]KatzE，FilanovskyB，WillnerI．Abiofuelcellbasedontwoimmisciblesolventsandglucoseoxidaseandmicroperoxidasemonolayerfunctionlizedelectrodes［J］．NewJChem，1999(23):481－487．[11]ServiliM，DeStefanoG，PiacquadioP，etal．Anovelmethodforremovingphenolsfromgrapemust［J］．AmJEnolViticulture，2000(51):357-361[12]TurnerEM，WrightM，WardT，etal．Productionofethyleneandothervolatilesandchangesincellulaseandlaccaseactivitiesduringthelifecycleofthecultivatedmushroom，Agaricusbisporus［J］．GenMicrobiol，1975，91(1):167－176．BollagJM，ShuttleworthKL，AndersonDH．Laccase－mediateddetoxificationofphenoliccompounds［J］．ApplEnvironMicrobiol，1988，54(12):3086－3091．[14]BourbonnaisＲ，PaiceMG．Oxidationofnonphenolicsubstrates:Anexpandedroleforlaccaseinligninbiodegradation［J］.FebsLetters，1990，267(1):99－102．[15]熊艷車振明呂磊爪哇香菇液體種子培養基的優化《食品工業科技》2008,(05):138-140致謝大學四年的時光匆匆流逝，回想四年間的每一段回憶，心里滿滿的都是感激之情。無論是濃厚的師生之情、難為的同窗友誼都在我心中深深的刻下，在此我想向那些關心我的、照顧我的、疼愛我的每一位恩師、同學、家人和朋友表示崇高的尊敬和由衷的感謝。首先需要感謝學校，給了我寶貴的大學四年的學習時光；其次需要感謝學院，接納和培養著我；而后想要感謝我的恩老——張維瑞老師，在最開始愿意跨專業的收我，不厭其煩一次又一次的教我之前沒有接觸過實驗里的東西，在論文指導也是從選題到思路到構造巨細無遺的講解，更是在生活、工作、學習中給了我許多的鼓勵和支持，他為人師表的職業品德讓我感受到一位優秀教師的感染力和影響力。借此機會我要向張維瑞老師表達最崇高的尊敬和最由衷的感謝。這次大學時光的結束，不是我的終點，而是新的起點。學習也不是就走到了盡頭，而是開始的終身學習的初啟祝愿所有幫助、照顧、關心我的人一愿識盡天下好人二愿讀盡世間好書三愿看盡世間美景