B40DB130B40DB1302/T327—2012克侖特羅等3種β-受體激動劑2012-03-01發布2012-04-01實施唐山市質量技術監督局發布DB1302/T327—2012前言本標準由唐山市質量技術監督局提出。本標準起草單位：唐山市畜牧水產品質量監測中心。本標準起草人：鄭百芹、李愛軍、張建民、葛懷禮、董李學、蒙君麗、苗建民、肖琎、張曉利、趙納新。1DB1302/T327—2012克侖特羅等3種β-受體激動劑檢測技術規范1范圍本標準規定了豬、牛、羊的尿液和組織（肌肉/肝臟）中克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺3種β-受體激動劑殘留檢驗的膠體金免疫層析測定方法、酶聯免疫吸附測定方法和液相色譜-串聯質譜測定方法。本標準適用于豬、牛、羊的尿液和組織（肌肉/肝臟）中克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺單個或混合物殘留量的快速集成檢測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單或修訂版）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規則和試驗方法農業部1063號公告-3-2008動物尿液中11種β-受體激動劑的檢測液相色譜-串聯質譜法農業部1025號公告-18-2008動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法3總體要求基層動物衛生監督部門和養殖企業采用膠體金快速檢測試紙條進行現場快速檢測；縣（市、區）級檢測中心采用酶聯免疫試劑盒進行檢測；市級畜牧水產品質量監測中心采用液相色譜-串聯質譜法進行確證檢測。4抽樣方法豬尿液和組織（肌肉/肝臟）抽樣方法按照NY/T763-2004執行；牛、羊的尿液和組織（肌肉/肝臟）5膠體金免疫層析法5.1適用范圍本方法適用于豬、牛、羊的尿液和組織（肌肉/肝臟）中克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺的現場快速檢測。5.2方法原理膠體金快速檢測試紙條應用了競爭抑制免疫層析的原理，樣品中的克侖特羅（沙丁胺醇/萊克多巴胺）在流動的過程中與膠體金標記的特異性單克隆抗體結合，抑制了抗體和NC膜檢測限上的克侖特羅（沙丁胺醇/萊克多巴胺）—BSA偶聯物的結合。5.3試劑和材料克侖特羅快速檢測試紙條/沙丁胺醇快速檢測試紙條/萊克多巴胺快速檢測試紙條、一次性吸管、一次性塑料手套。5.4樣品前處理2DB1302/T327—20125.4.1尿液前處理方法5.4.2組織（肌肉/肝臟）前處理方法5.5操作方法取出檢測試紙條，用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加2～3滴（約80μL）于加樣孔，液體流動圖1結果的判定5.6環境控制膠體金快速檢測試紙條進行現場快速檢測時，環境溫度應控制在10℃~30℃。5.7結果判定陰性（-T線和C線都顯色，表示樣品中克侖特羅（沙丁胺醇/萊克多巴胺）濃度低于檢測限。陽性（+T線無顯色，C線顯色，表示樣品中克侖特羅（沙丁胺醇/萊克多巴胺）濃度高于檢測限。無效：未出現C線，表明不正確的操作過程或試紙條已變質失效。在此情況下，用新的試紙條重新測試。6酶聯免疫吸附測定法6.1克侖特羅酶聯免疫吸附法6.1.1適用范圍本方法適用于豬、牛、羊尿液和組織（肌肉/肝臟）中克侖特羅殘留量的快速篩選檢測。6.1.2方法原理本方法采用直接競爭ELISA法檢測樣品中的克侖特羅。在微孔板上預包被抗克侖特羅單克隆抗體，樣品或標準溶液中的克侖特羅和HRP標記的克侖特羅競爭結合微孔板中抗克侖特羅單克隆抗體，洗滌后用H2O2-TMB底物系統顯色，樣品吸光度值與其所含克侖特羅量成負相關，與標準曲線比較即可得出克侖特羅含量。6.1.3儀器設備6.1.3.2均質器。6.1.3.3振蕩器。6.1.3.4渦旋儀。6.1.3.5離心機（轉速3000r/min）。3DB1302/T327—20126.1.3.6天平（感量0.01g）。6.1.3.7微量移液器（20μL～200μL、100μL～1000μL）。6.1.4試劑和材料以下所用的試劑，除特殊注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T6682規定的二級水。6.1.4.1氫氧化鈉溶液：1mol/L。6.1.4.2鹽酸溶液：0.1mol/L。6.1.4.3氯化鈉溶液：40g/L。6.1.4.5克侖特羅酶聯免疫檢測試劑盒。6.1.5樣品前處理6.1.5.1尿液前處理方法取50μL清亮尿樣直接測定（如尿樣渾濁必須通過過濾或3000r/min，室溫離心10min暫不使用的樣品冷凍保存。6.1.5.2組織（肌肉/肝臟）前處理方法6.0，取50μL進行檢測。6.1.6樣品檢測6.1.6.1測定條件:將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20℃~25℃)平衡30min，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。6.1.6.2編號：將克侖特羅標準溶液和待測樣品對應微孔按序編號，每個標準溶液和待測樣品均做重復孔。6.1.6.3加樣：加入標準溶液/樣品50μL，然后每孔分別加入克侖特羅標記的HRP溶液50μL。6.1.6.4溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20℃~25℃)反應30min。6.1.6.5洗滌：揭開封板膜，每孔加入1×洗滌液250μL，連續洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。6.1.6.6顯色：將底物溶液A和底物溶液B按1:1混合，振蕩混勻，每孔加入100μL，室溫（20～25℃)6.1.6.7測定：每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，于450nm處用酶標儀測定吸光度值，在加入終止液后5min內讀取吸光度值。6.1.7結果判定6.1.7.1計算百分吸光度值百分吸光度值（%）=B×100%式中：B0B：標準溶液或待測樣品溶液的吸光度值；B0：0號標準溶液的吸光度值。4DB1302/T327—20126.1.7.2繪制標準曲線計算樣品中克侖特羅濃度以克侖特羅標準溶液濃度為X軸，對應的百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣品中克侖特羅的濃度。式中：D：樣品稀釋倍數。(尿液樣品稀釋倍數：1；組織樣品稀釋倍數：4)6.2沙丁胺醇酶聯免疫吸附法6.2.1適用范圍本方法適用于豬、牛、羊尿液和組織（肌肉/肝臟）中沙丁胺醇殘留量的快速篩選檢測。6.2.2方法原理本方法采用直接競爭ELISA法檢測樣品中的沙丁胺醇。在微孔板上預包被抗沙丁胺醇單克隆抗體，樣品或標準溶液中的沙丁胺醇和HRP標記的沙丁胺醇競爭結合微孔板中抗沙丁胺醇單克隆抗體，洗滌后用H2O2-TMB底物系統顯色，樣品吸光度值與其所含沙丁胺醇量成負相關，與標準曲線比較即可得出沙丁胺醇含量。6.2.3儀器設備6.2.3.2均質器。6.2.3.3振蕩器。6.2.3.4渦旋儀。6.2.3.5離心機（轉速3000r/min）。6.2.3.6天平（感量0.01g）。6.2.3.7微量移液器（20μL～200μL、100μL～1000μL）。6.2.4試劑和材料以下所用的試劑，除特殊注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T6682-2008規定的二級水。6.2.4.1氫氧化鈉溶液：0.5mol/L。6.2.4.3沙丁胺醇酶聯免疫檢測試劑盒。6.2.5樣品前處理6.2.5.1尿液前處理方法取0.1mL尿液，加入0.2mL樣品稀釋液以1:2（3倍）稀釋待用。若待檢樣品渾濁，則建議過濾或6.2.5.2組織（肌肉/肝臟）前處理方法行檢測。6.2.6樣品檢測5DB1302/T327—20126.2.6.1測定條件:將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20℃~25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。6.2.6.2編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣品孔所在的位置。6.2.6.3加樣：每孔分別加入標準溶液/樣品30μL，然后每孔分別加入沙丁胺醇標記HRP溶液120μL。6.2.6.4溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于室溫（20～25℃)避光反應30min。6.2.6.5洗滌：揭開封板膜，每孔加入1×洗滌液250μL，連續洗板3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭戳破）。6.2.6.6顯色：每孔加入100μL底物溶液，室溫（20℃~25℃)避光顯色15min～20min。6.2.6.7測定：每孔加入終止液100μL，輕輕振蕩混勻，于450nm處用酶標儀測定吸光度值，在加入終止液后5min內讀取吸光度值。6.2.7結果判定6.2.7.1計算百分吸光度值百分吸光度值（%）=×100%式中：B：標準溶液或待測樣品溶液的吸光度值；：0號標準溶液的吸光度值。6.2.7.2繪制標準曲線計算樣品中沙丁胺醇濃度以沙丁胺醇標準溶液濃度為X軸，對應的百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣品中沙丁胺醇的濃度。沙丁胺醇實際含量(μg/kg或μg/L)＝C×D式中：C：待測液中沙丁胺醇的含量(μg/kg或μg/L)；D：樣品稀釋倍數。(尿液樣品稀釋倍數：3；組織樣品稀釋倍數：5)6.3萊克多巴胺酶聯免疫吸附法6.3.1適用范圍本方法適用于豬、牛、羊尿液和組織（肌肉/肝臟）中萊克多巴胺殘留量的快速篩選檢測。6.3.2方法原理本方法間接競爭ELISA方法檢測樣品中的萊克多巴胺。在微孔板上包被萊克多巴胺檢測抗原，樣品中的萊克多巴胺和酶標板上的萊克多巴胺檢測抗原競爭結合萊克多巴胺抗體，萊克多巴胺檢測抗原結合的萊克多巴胺抗體再與同時加入的酶標二抗結合，洗滌后，用TMB底物系統顯色，微孔板吸光度值與樣品中萊克多巴胺含量成負相關，與標準曲線比較再乘以濃度比值即可得出萊克多巴胺在樣品中的實際含量。6.3.3儀器設備6.3.3.1微孔板酶標儀（配450nm濾光片）。6.3.3.2均質器。6DB1302/T327—20126.3.3.3振蕩器。6.3.3.4渦旋儀。6.3.3.5離心機（轉速3000r/min）。6.3.3.6天平（感量0.01g）。6.3.3.7微量移液器（20μL～200μL、100μL～1000μL）。6.3.4試劑和材料以下所用的試劑，除特殊注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T6682-2008規定的二級水。6.3.4.1氯化鈉。6.3.4.2提取工作液的配制（現配現用將20×濃縮提取劑與蒸餾水(或去離子水)按1：19充分混勻。取100mL稀釋好的提取液加入4.0g氯化鈉混合均勻至完全溶解。6.3.4.3萊克多巴胺酶聯免疫檢測試劑盒。6.3.5樣品前處理6.3.5.1尿液前處理方法取20μL清亮尿樣直接測定（如尿樣渾濁必須通過過濾或3000r/min以上，室溫離心10min暫不使用的樣品應冷凍保存。6.3.5.2組織(肌肉/肝臟)前處理方法稱取2.0(±0.02g）已均質組織（組織/肝臟）樣品于50mL聚苯乙6.3.6樣品檢測6.3.6.1測定條件:將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20℃~25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。6.3.6.2編號：將樣品和標準品對應微孔按序編號，每個樣品和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣品孔所在的位置。6.3.6.3加標準品/樣品、酶標二抗和抗體工作液：加標準品/樣品20μL到對應的微孔中，隨即加入酶標二抗50μL/孔，再加入抗體工作液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反6.3.6.4洗滌：揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，每孔加入洗滌工作液250μL，充分洗滌3次，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。6.3.6.5顯色：底物溶液A和底物溶液B以1:1混合，每孔加入底物混合液100μL，輕輕振蕩混勻，室溫（20℃~25℃)避光靜置15min。6.3.6.6測定：加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，于450nm處用酶標儀測定吸光度值，在加入終止液后5min內讀取吸光度值。6.3.7結果判定6.3.7.1計算百分吸光度值百分吸光度值（%）=×100%式中：B：標準品溶液或待測樣品的吸光度值；7DB1302/T327—2012：0號標準品溶液的吸光度值。6.3.7.2繪制標準曲線計算樣品中萊克多巴胺濃度以萊克多巴胺標準溶液濃度為X軸，對應的百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線。相對應每一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法，計算出樣品中萊克多巴胺的濃度。式中：D：樣品稀釋倍數。(尿液樣品稀釋倍數：1；組織樣品稀釋倍數：5)7液相色譜-串聯質譜法7.1尿液克侖特羅等3種β-受體激動劑液相色譜-串聯質譜確證檢測法7.1.1適用范圍本方法適用于豬、牛、羊的尿液中克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺3種β-受體激動劑的測定，7.1.2方法原理樣品經氫氧化鈉溶液調節pH，叔丁醇、叔丁基甲醚混合液萃取并濃縮后用固相萃取小柱凈化，洗脫液濃縮后用含0.2%(v/v)甲酸的水溶液溶解，供液相色譜-串聯質譜儀進行檢測，內標法定量。7.1.3試劑和材料除方法另有規定外，試劑均為分析純，實驗室用水符合GB/T6682-2008中一級水的規定。7.1.3.1甲醇：色譜純。7.1.3.2甲酸：色譜純。7.1.3.3氫氧化鈉。7.1.3.4叔丁醇。7.1.3.5叔丁基甲醚。7.1.3.6氨水。7.1.3.7叔丁醇叔丁基甲醚（60:40）提取液：取叔丁醇60mL，叔丁基甲醚40mL，混勻。7.1.3.8氫氧化鈉溶液：5mol/L。7.1.3.9甲酸水溶液：0.2%(v/v)。7.1.3.10氨水甲醇溶液：5%(v/v)。7.1.3.11克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺對照品，純度≥95%。7.1.3.12β-受體激動劑貯備液的配制：分別精密稱取3種β-受體激動劑類藥物對照品，用甲醇配制成濃度各約為1mg/mL的標準貯備液，2℃~8℃冷藏保存，有效期6個月。7.1.3.13混合對照品工作液：分別吸取3種β-受體激動劑貯備液，置于一棕色容量瓶中，用0.2%甲酸水溶液稀釋成為濃度為1μg/mL的對照品工作液，2℃~8℃冷藏保存，有效期1個月。7.1.3.14同位素內標：克侖特羅-D9、沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D5，純度＞92%。7.1.3.15同位素內標貯備液：分別吸取三種同位素的內標，用甲醇配成三份濃度各約為100μg/mL的貯備液。8DB1302/T327—20127.1.3.16同位素內標工作液：將上述同位素內標貯備液用0.2%甲酸水溶液稀釋成40ng/mL的混合工作液。7.1.3.17固相萃取小柱：混合型陽離子交換柱，1mL/30mg，或其他性能類似的小柱。7.1.3.18氮氣：純度99.99%。7.1.4儀器設備7.1.4.1液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧電離源。7.1.4.2旋轉蒸發儀。7.1.4.3離心機：轉速大于7000r/7.1.4.4渦旋振蕩器。7.1.4.5濾膜：0.22μm，水系。7.1.4.6天平：感量為0.0001g。7.1.4.7微量移液槍：100μL。7.1.5試樣制備供試樣置于-18℃以下冷凍保存，使用前放至室溫，如有混濁，離心后取上清液備用。7.1.6操作方法7.1.6.1提取取叔丁基甲醚5.0mL于50mL離心管中，添加內標工作液100μL，充分混勻。用5mol/L氫氧瓶中，重復提取一次，合并上清液，旋轉蒸發（40℃)至干，用0.2%甲酸水溶液1.0mL溶解殘余物，備用。7.1.6.2凈化0.2%甲酸水溶液溶解，經0.22μm濾膜過濾后進行測定。7.1.7液相色譜-串聯質譜測定按照農業部1063號公告-3-2008方法進行測定。7.2組織（肌肉/肝臟）中克侖特羅等3種β-受體激動劑液相色譜-串聯質譜確證檢測法7.2.1適用范圍本方法適用于豬、牛、羊的組織（肌肉/肝臟）中克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺單個或混合物殘留量的檢測。方法檢測限為0.25μg/kg，定量限為0.5μg/kg。7.2.2方法原理試料中的殘留藥物經酶解，用高氯酸調pH后高速離心沉淀蛋白，上清液調pH后分別用乙酸乙酯和叔丁基甲醚（TBME）提取，再用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯質譜法測定。7.2.3試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明者外均為分析純試劑；水為符合GB/T6682規定的一級水。7.2.3.1克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺對照品：純度均＞98.0%。7.2.3.2乙酸銨緩沖液（0.2mol/L稱取15.4g乙酸銨，溶解于1000mL水中，用適量乙酸調pH至9DB1302/T327—20127.2.3.3高氯酸：70%～72%。7.2.3.4高氯酸溶液：0.1mol/L。7.2.3.5氫氧化鈉溶液：10mol/L。7.2.3.6乙酸乙酯。7.2.3.7叔丁基甲醚7.2.3.8甲醇：色譜純。7.2.3.9甲酸水溶液：2%(v/v)。7.2.3.10乙腈-水溶液：10%(v/v)。7.2.3.11氨水甲醇溶液：3%(v/v)。7.2.3.12β-鹽酸葡萄糖醛甘酶/芳基硫酸酯酶(β-Glucuronidase/arylsulfatas7.2.3.13標準儲