B39DB1302唐山市質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布DB1302/T349—2013本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由唐山市質(zhì)量技術監(jiān)督局提出。本標準起草單位：唐山師范學院。本標準主要起草人：范永山、張運峰、張淑紅、李小六。DB1302/T349—2013平菇原生質(zhì)體脫毒技術規(guī)程本標準規(guī)定了平菇原生質(zhì)體脫毒的實驗室準備、原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體再生、鑒定。本標準適用于平菇菌種的原生質(zhì)體脫毒。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是標注日期的引用文件，僅標注日期的版本適用于本文件。凡是不標注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T12728-2006食用菌術語GB19172-2003平菇菌種GB/T27405-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測NY/T528-2010食用菌菌種生產(chǎn)技術規(guī)程NY/T1743-2009食用菌菌種真實性鑒定RAPD法NY/T1845-2010食用菌菌種區(qū)別性鑒定拮抗反應JJG552-1988血細胞計數(shù)板試行檢定規(guī)程DB1302/T306-2011無公害平菇栽培技術規(guī)范3術語和定義GB/T12728-2006中確定的及下列術語和定義適用于本文件。3.1平菇指層菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬的主要品種。3.2初始菌株保存于PDA斜面或其它適合培養(yǎng)基內(nèi)的平菇帶毒菌株。平菇病毒病病原和癥狀見附錄A。3.3原生質(zhì)體脫去細胞壁的植物、真菌或細菌細胞。3.4穩(wěn)滲劑用于維持原生質(zhì)體形狀和功能的滲透壓穩(wěn)定劑。3.5再生菌株指原生質(zhì)體經(jīng)過培養(yǎng)獲得的單菌落。3.6脫毒菌株2DB1302/T349—2013經(jīng)過栽培試驗，無病毒感染癥狀的優(yōu)良再生菌株。4實驗室準備4.1實驗室要求實驗室質(zhì)量控制規(guī)范應符合GB/T27405-2008的規(guī)定。4.2儀器和設備4.2.1超凈工作臺：無菌風的純度≤0.5個/皿?時(φ90mm培養(yǎng)平皿)，風速可調(diào)。4.2.2高壓蒸汽滅菌器：溫度可控制在121℃。4.2.3水浴鍋：溫度可控制在25℃~50℃。4.2.4氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱：溫度可控制在10℃~50℃,轉(zhuǎn)速0～200rpm。4.2.5光學顯微鏡：放大倍數(shù)400倍。4.3試劑應使用分析純試劑，水為GB/T6682-2008規(guī)定的水。4.3.1穩(wěn)滲劑0.6mol/L甘露醇（pH7.0）。配制后在高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min。4.3.2細胞壁降解酶應采用溶壁酶（Lywallzyme）。4.4培養(yǎng)基4.4.1PD液體培養(yǎng)基稱取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L沸水中煮20min，然后用三層紗布過濾，向濾液中加入葡萄糖20g，定容至1L。在高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min。4.4.2PDA固體培養(yǎng)基在1LPD液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15g，加熱煮沸15min。在高壓蒸汽滅菌器中，121℃滅菌20min。4.4.3PSA固體培養(yǎng)基稱取土豆200g，切片（厚度3mm～5mm）后置于1L穩(wěn)滲劑中煮20min，然后用三層紗布過濾，向濾液中加入蔗糖20g，用穩(wěn)滲劑定容至1L，加入瓊脂粉15g，加熱煮沸15min。在高壓蒸汽滅菌器中121℃滅菌20min。5原生質(zhì)體制備5.1菌絲體活化在超凈工作臺中用接種針挑取少許初始菌株的菌絲，接種于PDA平板表面，25℃培養(yǎng)5d～7d。5.2搖瓶培養(yǎng)在超凈工作臺中用接種鏟鏟取菌落近邊緣處菌絲和少許培養(yǎng)基3～5塊，置于含有50mLPD培養(yǎng)基的搖瓶中，25℃、180rpm振蕩培養(yǎng)5d。DB1302/T349—20135.3破碎菌絲體在超凈工作臺中，利用接種針從PD培養(yǎng)基中挑取菌絲球置于重量為G1的1.5mL離心管中，10000rpm離心5min，去掉上清，用天平稱重為G2，菌絲體重量G=G1-G2（控制在G=0.1g左右）。用玻璃棒（直徑6mm）將菌絲球搗碎。5.4酶解稱取0.02g溶壁酶于1mL穩(wěn)滲劑中，用0.22μm的微孔濾膜過濾（現(xiàn)配現(xiàn)用）。將溶壁酶液加入裝有菌絲碎片的離心管中，顛倒混勻。將離心管放置于35℃水浴鍋中孵育2.5h左右。每隔30min顛倒混勻一次。5.5原生質(zhì)體分離利用300目細胞篩過濾酶解產(chǎn)物，獲得含有原生質(zhì)體的濾液。5.6原生質(zhì)體觀察和計數(shù)利用光學顯微鏡觀察原生質(zhì)體。按照JJG552-1988的要求進行原生質(zhì)體計數(shù)。6原生質(zhì)體再生將制備好的原生質(zhì)體用穩(wěn)滲劑稀釋至1.0×105個/mL，30℃靜置培養(yǎng)過夜；然后按0.5mL/皿均勻涂布在PSA再生培養(yǎng)基上，25℃靜置培養(yǎng)，直到平板上長出菌落。將單菌落轉(zhuǎn)接到PDA平板上，22℃~28℃靜置培養(yǎng)5d～7d，選擇邊緣整齊、菌絲致密的再生菌株進行鑒定。7鑒定7.1再生菌株的真實性鑒定7.1.1拮抗反應鑒定將再生菌株與初始菌株對峙培養(yǎng)于同一個PDA平板上，按照NY/T1845-2010的要求進行拮抗反應試驗。選擇無拮抗反應的再生菌株進行遺傳學鑒定。7.1.2遺傳學鑒定按照NY/T1743-2009的要求進行。選擇與初始菌株具有相似RAPD指紋圖譜的再生菌株進行以下鑒定。7.2脫毒菌株的鑒定按照DB1302/T306-2011進行出菇試驗，觀察無病毒感染癥狀，獲得脫毒菌株。按照NY/T528-2010進行菌種生產(chǎn)，脫毒菌種應符合GB19172-2003的規(guī)定。DB1302/T349—2013附錄A(資料性附錄)平菇病毒病病原和癥狀A.1病原糙皮側(cè)耳球形病毒（oystermushroomsphericalvirus，OMSV）糙皮側(cè)耳等面體病毒（oystermushroomisometricvirus，OMIV）糙皮側(cè)耳病毒-I（Pleurotusostreatusvirus-I，POV-I）糙皮側(cè)耳病毒-SN（Pleurotusostreatusvirus-SN，POV-SN）A.2癥狀A.2.1菌絲體感染病毒后多表現(xiàn)于生長速度變緩，菌落邊緣