B50DB130B50DB1302/T318—20112011-11-01發布2011-12-01實施唐山市質量技術監督局發布DB1302/T318—2011本標準由唐山市質量技術監督局提出。本標準起草單位：唐山市畜牧水產品質量監測中心。本標準起草人：張建民、蒙君麗、葛懷禮、李愛軍、苗建民、董李學、肖琎、陳秋江、張蘭穩、張瑞寶。1DB1302/T318—2011水產品中孔雀石綠的快速測定酶聯免疫吸附法1范圍本標準規定了水產品中孔雀石綠殘留量的酶聯免疫吸附測定方法。本標準適用于快速測定水產品中孔雀石綠的殘留量。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規則和試驗方法3制樣3.1樣品的制備取新鮮或解凍的供試水產品組織，剪碎，置于組織勻漿機中高速勻漿。3.2樣品的保存-20℃冰箱中貯存備用。4測定方法4.1方法原理利用萃取液通過均質及振蕩的方式提取樣品中的孔雀石綠進行免疫測定。經過前處理的樣品溶液到包被有抗體的測試孔，樣品中的孔雀石綠和酶標記物競爭與抗體結合，結合的酶標記物加入底物后，終止反應，在450nm處測定。吸光度值與試樣中孔雀石綠濃度的自然對數成反比，與標準曲線比較再乘以稀釋倍數，即可得出樣品中孔雀石綠的含量。4.2試劑和材料以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純試劑，水為符合GB/T6682規定的二級水。4.2.1孔雀石綠檢測試劑盒：2℃~8℃冰箱保存。4.2.2乙腈。4.2.3中性氧化鋁：100目-200目（孔徑150μm～75μm）。4.3儀器和設備4.3.1酶標儀：配備450nm濾光片。4.3.2均質器。4.3.3天平：感量0.01g。4.3.4振蕩器或混旋器。4.3.6氮氣吹干裝置。4.3.7微量移液器：單道20μL～200μL、200μL～1000μL，多道50μL～300μL。4.3.8計時器。2DB1302/T318—20114.4樣品提取氮氣吹干。加入0.5mL稀釋好的復溶工作液（試劑盒自帶混合3s，然后靜置30min。稱取0.1g復溶試劑（試劑盒自帶）加入到上述5mL離心管中，混合3s，然后靜置10min。取50μL上清液加入0.95mL樣品稀釋液1：20稀釋并混勻。移取120μL進行分析。4.5試樣測定4.5.1取出試劑盒中所有試劑及試驗需要數量的微孔板條，插入框架，使其回溫至室溫（19℃~25℃),4.5.2給編好號的混合微孔加入120μL的標準液、樣品，每個樣本和標準品做2孔平行。4.5.3使用多道移液器，每孔快速加入120μL酶標記物到每個孔中混合至少10s。4.5.4從混合孔中吸取200μL混合液到相應的測試孔中，室溫下避光靜置孵育30min。4.5.5甩出孔中液體，每孔每次用250μL洗滌液沖洗，洗液不得溢出，連洗3～5次，每次都要倒掉孔內液體并在吸水紙上拍干，保證完全除去孔中液體。4.5.6使用多道移液器，每個微孔中加入100μL底物溶液，室溫下避光靜置孵育30min。4.5.7每個微孔加入100μL終止液。4.5.8輕輕振蕩混勻，用酶標儀在450nm波長處讀取吸光度值。5結果判定與表述標準品或樣本的百分吸光度值等于標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值（雙孔）除以空白標準溶液百分吸光度值（%）=B/B0ⅹ100%………………（1）式中：B——標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0——空白標準溶液的平均吸光度值然后以標準品濃度的對數為橫坐標，以標準品百分吸光值為縱坐標，在半對數坐標紙上繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣品中孔雀石綠的實際殘留量。也可利用試劑盒專業分析軟件進行計算，樣本準確、快速的分析出結果。方法篩選結果為陽性的樣品，需要用確證方法確證。6靈敏度、檢測限、回收率6.1