第二章常規(guī)組織病理技術(shù)活體組織檢驗(yàn):活檢目幫助臨床對(duì)病變作出診療或?yàn)榧膊≡\療提供線索了解病變性質(zhì)、發(fā)展趨勢(shì),判定疾病預(yù)后驗(yàn)證及觀察藥品療效,為臨床用藥提供參考依據(jù)參與臨床科研,發(fā)覺新疾病或新類型,為臨床科研提供病理組織學(xué)依據(jù)活檢應(yīng)用范圍幫助臨床對(duì)病變作出診療或?yàn)榧膊≡\療提供線索了解病變性質(zhì)、發(fā)展趨勢(shì),判定疾病預(yù)后。驗(yàn)證及觀察藥品療效,為臨床用藥提供參考依據(jù)參與臨床科研,發(fā)覺新疾病或新類型,為臨床科研提供病理組織學(xué)依據(jù)活檢標(biāo)本類型手術(shù)摘除器官、組織,如闌尾、甲狀腺、膽囊、淋巴結(jié)等穿刺抽取組織,如肝、腎、淋巴結(jié)穿刺組織自病變部位切取小塊組織,包含用纖維胃鏡、纖維支氣管鏡等內(nèi)鏡鉗取病變組織刮取組織:刮出子宮內(nèi)膜組織（診刮）,外科手術(shù)刮取病變骨組織等活體組織標(biāo)本固定與送檢固定存放送檢組織與細(xì)胞取材一張好切片是確保病理診療和科研結(jié)果正確性前提和基礎(chǔ)與正確取材、適宜固定和良好染色親密相關(guān)組織處理要求完整保留組織細(xì)胞形態(tài)最大程度保留組織或細(xì)胞成份抗原性抗原不彌散,以確保其正確定位組織取材（一）通常標(biāo)準(zhǔn)厚度0.2～0.3cm;面積1～1.5cm2較薄皮膚、腔道器官及囊壁組織等應(yīng)剪成細(xì)條纏繞成同心圓狀骨組織需先經(jīng)脫鈣處理若需保留新鮮組織,應(yīng)將所取組織用錫箔紙包好,浸入液氮速凍,然后置-70℃冰箱中（二）取材注意事項(xiàng)刀剪應(yīng)鋒利、避免前后拉動(dòng)和擠壓避免使用有齒鑷,動(dòng)作輕柔以免挫傷或擠壓組織避開壞死組織和血凝塊,去掉異物取病變主體、病變與正常交界和正常組織各一塊固定及常見固定劑一、概念:將組織浸入一些化學(xué)試劑中,使組織細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)能盡可能保持其生活狀態(tài)時(shí)形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置二、固定作用1.保持組織、細(xì)胞與生活狀態(tài)時(shí)相同結(jié)構(gòu)和形態(tài),預(yù)防組織自溶和細(xì)菌繁殖造成組織腐敗2.保持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等成份凝固并定位于原有部位3.便于區(qū)分不一樣組織成份:固定可使組織細(xì)胞中多種成份沉淀、凝固并易著色4.有利于切片:固定劑兼有組織硬化作用,能使組織細(xì)胞從半液體狀變?yōu)榘牍腆w狀5.有利于免疫組化染色和核酸原位雜交:完整保留及正確定位抗原、DNA和RNA成份三、組織固定注意事項(xiàng)1.取材后要立刻固定,尤其是溫度高季節(jié),以免腐敗2.容器:最好選擇廣口容器,一是避免組織受擠壓變形,二是方便取材時(shí)易于取出3.固定液要足量,最少應(yīng)為組織塊總體5倍以上4.依據(jù)不一樣研究目選擇不一樣固定液Masson染色,最好用甲醛升汞、Zenker液或bouin液固定保留細(xì)胞內(nèi)糖原應(yīng)選擇Carnoy液固定顯示尿酸鹽結(jié)晶可用100%酒精固定5.固定時(shí)間:視組織塊大小、固定溫度、固定液種類而定通常固定6小時(shí)以上,然后保留于70%酒精中溫度低于4℃時(shí),固定時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)比較大標(biāo)本除延長(zhǎng)固定時(shí)間外,還應(yīng)做多個(gè)切面固定,以免固定不均勻四、固定方法1.浸泡法2.蒸汽固定法:常見于固定組織中可溶性物質(zhì)3.灌注固定法:用于組織塊過大或固定劑難以進(jìn)入其內(nèi)部標(biāo)本（如整個(gè)器官、整只動(dòng)物）4.滴加法:細(xì)胞涂片5.微波固定法（63℃～65℃）:含有核膜清楚、染色質(zhì)均勻、組織結(jié)構(gòu)收縮小等優(yōu)點(diǎn),但因?yàn)槠涔潭〞r(shí)間不易掌握,通常不主張利用于小組織塊固定常見固定液及其配制（一）單純固定液:由單一化學(xué)物質(zhì)組成1.甲醛（1）優(yōu)點(diǎn):價(jià)格廉價(jià)、組織穿透力強(qiáng)、固定均勻、組織收縮小,可長(zhǎng)久保留標(biāo)本（2）缺點(diǎn):易揮發(fā),有一定毒性（3）性質(zhì):交聯(lián)性組織固定劑（4）適用范圍:適合多個(gè)特殊染色,對(duì)脂類和類脂體、神經(jīng)及髓鞘都有良好固定效果;也可固定高爾基體、線粒體和糖類（5）使用濃度:10%formalin,即10ml市售原液（40%）加90ml水,此液甲醛實(shí)際濃度為4%2.中性甲醛以pH7.2～7.4磷酸緩沖液（PBS）為溶劑配制甲醛溶液,濃度同前優(yōu)點(diǎn):固定效果及對(duì)組織抗原保留均優(yōu)于通常甲醛溶液是科研用組織最常見固定液3.乙醇（1）優(yōu)點(diǎn):含有硬化、固定、脫水等作用,還能保留糖原和尿酸結(jié)晶（2）使用濃度:固定組織用80%～95%為好,70%乙醇可用于保留組織;證實(shí)尿酸結(jié)晶和保留糖原用100％濃度（3）缺點(diǎn):組織滲透力較弱能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白,核蛋白沉淀后能溶于水,使核染色不良高濃度乙醇固定組織硬化顯著,組織收縮顯著且脆,既影響切片,又致組織形態(tài)改變,影響診療溶解脂肪、類脂質(zhì)和血紅蛋白,還損害其它色素（二）混合固定液:由多個(gè)化學(xué)物質(zhì)混合組成1.A-F液酒精-甲醛固定液固定兼脫水,固定后可直接入95%酒精脫水配制方法:95%以上濃度酒精90ml,40%甲醛10ml,混合而成2.Bouin液（1）優(yōu)點(diǎn):滲透力強(qiáng),對(duì)組織固定均勻,收縮很小,不會(huì)使組織變硬變脆,適適用于睪丸活檢等小組織固定（2）固定時(shí)間:小塊組織只需數(shù)小時(shí),較大臟器固定12～二十四小時(shí)（3）配制方法:苦味酸飽和水溶液75ml,40%甲醛水溶液25ml,冰醋酸5ml80%酒精150ml,40%甲醛60ml,冰醋酸15ml,加入結(jié)晶苦味酸1g（用前配制）3.Zenker液（1）優(yōu)點(diǎn):HE染色最好固定液,此液固定標(biāo)本,胞核和胞質(zhì)染色清楚（2）固定時(shí)間:12～二十四小時(shí)（3）缺點(diǎn):配制該液試劑較昂貴,且需處理汞（4）配制方法:重鉻酸鉀2.5g,升汞5.0g,蒸餾水100ml將升汞、重鉻酸鉀和蒸餾水混于燒杯中,加熱（40～50℃）溶解,冷卻后過濾,貯存與棕色瓶中臨用時(shí)取貯存液95ml,加入冰醋酸5ml4.Carnoy液（1）優(yōu)點(diǎn):穿透力強(qiáng),能很好地固定胞質(zhì)和染色質(zhì)尤其適合固定外膜致密組織在固定組織同時(shí),能溶解大部分脂肪用于糖原及尼氏小體固定對(duì)顯示DNA和RNA效果很好（2）固定時(shí)間:小塊組織固定1～2小時(shí)（3）配制方法:無水乙醇60ml,冰醋酸10ml,氯仿30ml。（4）缺點(diǎn):氯仿有毒組織脫水、透明浸蠟和包埋:切片前處理過程,關(guān)鍵目是便于切薄片和長(zhǎng)久保留組織塊一、脫水用一些溶媒（脫水劑）置換組織內(nèi)水分過程脫水劑必需能與水任意百分比混合常見脫水劑:有乙醇、丙酮及叔丁醇（2-甲基-2-丙醇）丙酮引發(fā)組織收縮作用強(qiáng)而較少應(yīng)用為了降低組織急劇收縮,應(yīng)使用從低濃度到高濃度遞增次序進(jìn)行,通常從70%濃度開始,經(jīng)80%、95%直至無水乙醇二、透明組織塊中水分被透明劑所替換,組織塊變得透亮過程最常見透明劑為二甲苯,因其既能與酒精混合,又能溶解石蠟處理時(shí)間通常為30min左右其它透明劑:苯、甲苯、氯仿、環(huán)己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等三、浸蠟組織透明后在熔化石蠟內(nèi)浸漬,讓蠟液完全滲透入組織細(xì)胞內(nèi)過程用于浸漬石蠟熔點(diǎn)為52℃～56℃浸蠟時(shí)間通常為3小時(shí),需更換3次石蠟液浸透或透入:用其它浸透劑（火棉膠、碳蠟、明膠等）滲透組織內(nèi)部過程四、包埋組織塊經(jīng)過浸蠟或浸透后,再用包埋劑包起來過程包埋后組織塊含有一定硬度和柔韌性,有利于切薄片常見包埋劑:石蠟、火棉膠、碳蠟、明膠和塑料等,可依據(jù)不一樣研究需要選擇一、石蠟切片厚度:3～5μm漂片附貼（40℃恒溫?zé)崴型耆归_）烘片:56～60℃,經(jīng)30～60min石蠟切片注意事項(xiàng)用于DNA提取石蠟切片通常為5～10μm,用小鑷子夾入微量離心管中,每管可裝5～10片切片過程中應(yīng)嚴(yán)格注意預(yù)防標(biāo)本間交叉污染,以避免假陽性應(yīng)避免刀痕、皺折和殘缺二、冷凍切片適用范圍:快速病理診療、酶組化染色、蘇丹Ⅲ染色等厚度:6～8μm適應(yīng)癥確定病變性質(zhì)確定切除腫瘤邊緣是否有殘余腫瘤組織以明確手術(shù)范圍識(shí)別手術(shù)切除組織確定切除淋巴結(jié)內(nèi)有沒有轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞不宜作冷凍切片診療情況骨、脂肪、鈣化顯著組織組織太少太小標(biāo)本需依據(jù)核分裂計(jì)數(shù)判定良惡性軟組織腫瘤疑為惡性淋巴瘤者其她風(fēng)險(xiǎn)及可能后果冷凍切片診療因?yàn)槿〔挠邢拗破椒ㄌ厥馊旧|(zhì)量差診療時(shí)間短等不足臨床應(yīng)用有一定風(fēng)險(xiǎn)性冷凍切片病理診療知情同意書難免有出現(xiàn)誤診可能性,病理醫(yī)師將承受極大壓力應(yīng)該由臨床醫(yī)師、病理醫(yī)師和患者共同來負(fù)擔(dān)這種風(fēng)險(xiǎn)讓患者知道自己可能面臨多種結(jié)果,有權(quán)接收或拒絕該項(xiàng)檢驗(yàn)常見病理染色技術(shù)及其應(yīng)用一、蘇木素-伊紅染色HE染色,被稱為常規(guī)染色能很好地顯示組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)保留時(shí)間長(zhǎng)應(yīng)用廣泛1.染色步驟（略）2.結(jié)果顯示:細(xì)胞核呈藍(lán)色;細(xì)胞質(zhì)、肌肉、結(jié)締組織、紅細(xì)胞和嗜伊紅顆粒呈不一樣程度紅色鈣鹽和多種微生物也可染成藍(lán)色或紫藍(lán)色3.注意事項(xiàng)切片脫蠟應(yīng)根本依據(jù)染片多少和染液新鮮程度掌握染色時(shí)間長(zhǎng)短分化處理要適度染色后酒精脫水應(yīng)遵照從低濃度到高濃度,由快到慢,梯度脫水染色要求切片色澤鮮艷,明亮清楚二、常見特殊染色方法及其應(yīng)用（一）結(jié)締組織染色結(jié)締組織含有三種纖維:膠原纖維、網(wǎng)狀纖維和彈力纖維它們?cè)贖E染色時(shí)不易區(qū)分,特染可判別1.膠原纖維染色目:判定梭形細(xì)胞腫瘤起源:判定心肌瓣痕灶、早期肝硬化、肺纖維化以及其它纖維組織增加或降低性病變等常見方法:Masson三色染色法結(jié)果:膠原纖維呈藍(lán)色,肌纖維和紅細(xì)胞呈紅色,細(xì)胞核為藍(lán)褐色注意事項(xiàng):Masson復(fù)合染色液經(jīng)磷鎢酸分化時(shí)須在顯微鏡下控制至肌纖維清楚為止苯胺藍(lán)可用亮綠染料替換,此時(shí)膠原纖維染成綠色2.網(wǎng)狀纖維染色目:顯示網(wǎng)狀纖維和基底膜用于判別①上皮性與非上皮性腫瘤②一些間葉組織腫瘤③判定原位癌與早期浸潤(rùn)癌④觀察肝組織網(wǎng)狀支架塌陷、破壞或增生等改變常見方法:Gomori銀染色法結(jié)果:網(wǎng)狀纖維呈黑色,膠原纖維呈紅色,背景呈黃色注意事項(xiàng):①配制氨性銀溶液必需將器皿洗潔凈,所用蒸餾水要純②加氨水要適量,宜現(xiàn)用現(xiàn)配,以免銀鹽析出,影響染色結(jié)果③氧化液存放時(shí)間不能長(zhǎng),以免失去氧化作用④麗春紅復(fù)染液通常須滴染,無水乙醇沖洗時(shí)要將切片傾斜,以防染液停留在切片上而造成組織中膠原纖維分布不均假象3.彈力纖維染色目:觀察皮膚組織增殖改變老年性肺氣腫纖維斷裂、變性或萎縮高血壓病時(shí)小動(dòng)脈管壁彈力纖維異常增生AS動(dòng)脈管壁彈力纖維崩解、斷裂與缺失試驗(yàn)動(dòng)物組織中血管壁損害和增生情況常見方法:醛品紅彈力纖維染色法結(jié)果:彈性纖維呈深紫色,底色為不一樣程度黃色注意事項(xiàng):①醛品紅染液要置冰箱內(nèi)保留,用時(shí)恢復(fù)至室溫②橙黃G液要淡染,不然會(huì)掩蓋彈力纖維深紫色（二）糖類染色單糖和雙糖多糖:淀粉、纖維素、糖原黏多糖:中性黏液物質(zhì)和酸性黏液物質(zhì)1.糖原染色目:①明確細(xì)胞內(nèi)空泡性質(zhì)②糖原貯積病診療③一些透明細(xì)胞腫瘤判別診療④低分化腺癌診療⑤早期浸潤(rùn)癌判定⑥腎小球腎炎分類診療常見方法:PAS染色法（過碘酸-Schiff）結(jié)果:糖原及其它PAS陽性反應(yīng)物質(zhì)呈紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色注意事項(xiàng)①組織固定要立刻,取材要小,以免糖原顆粒居于細(xì)胞一端②配制Schiff液重亞硫酸鈉質(zhì)量必需純③Schiff液應(yīng)置冰箱內(nèi)保留,用時(shí)取出恢復(fù)室溫后再進(jìn)行染色④應(yīng)設(shè)對(duì)照片（用唾液或1%淀粉酶消化后染色）⑤染色時(shí)間示溫度而定,夏季短,冬季長(zhǎng)2.粘液物質(zhì)染色目:粘液性上皮腫瘤判別,證實(shí)腫瘤內(nèi)是否有粘液常見方法:Alcianblue-PAS染色法結(jié)果:中性粘液物質(zhì)呈紅色,酸性粘液物質(zhì)呈藍(lán)色注意事項(xiàng)①Alcianblue染色時(shí),玻片上不能涂白膠或火棉膠,以免背景著色②染PAS時(shí)采取滴染法,用過試劑不能再用3.組織中脂類顯示法目:①判別細(xì)胞內(nèi)空泡性質(zhì),對(duì)一些腫瘤診療有意義②顯示膽固醇沉積、脂