第三章

細(xì)菌感染的病原學(xué)診斷第一節(jié)標(biāo)本的采集和處理原那么一、標(biāo)本采集的一般原那么1.早期采集2.無菌采集無菌部位:嚴(yán)格無菌操作有正常菌群部位：明確目的菌；選擇適宜的選擇培養(yǎng)基3.采用不同方法采集需氧菌或兼性厭氧菌厭氧菌：穿刺法采集4.采集適量標(biāo)本和適當(dāng)標(biāo)本采集有明顯病變的標(biāo)本根據(jù)病程采集不同的臨床標(biāo)本5.平安采集二、標(biāo)本的處理1.及時(shí)送檢2.運(yùn)送與保存1〕根據(jù)待檢菌特點(diǎn)對標(biāo)本進(jìn)行冷藏、保溫或保持厭氧狀態(tài)2〕注意平安防護(hù)第二節(jié)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查顯微鏡種類1.普通光學(xué)顯微鏡〔lightmicroscope〕光源：可見光2.暗視野顯微鏡〔darkfieldmicroscope〕暗背景，菌體發(fā)光用于檢查不染色的活細(xì)菌和螺旋體的形態(tài)及運(yùn)動(dòng)觀察3.相差顯微鏡檢查不染色活細(xì)菌的形態(tài)及某些內(nèi)部結(jié)構(gòu)4.熒光顯微鏡光源：100W~200W的高壓汞燈5.電子顯微鏡光源：電子流透射電鏡：觀察細(xì)菌內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡：對細(xì)菌外表結(jié)構(gòu)及附件觀察一、不染色標(biāo)本的檢查常用方法壓滴法懸滴法毛吸管法用于檢查厭氧菌動(dòng)力用途動(dòng)力試驗(yàn)——檢查細(xì)菌有無動(dòng)力制動(dòng)試驗(yàn)——鑒定血清型三、染色標(biāo)本的檢查〔一〕常用染料色基：決定染料的顏色助色基：決定染料的酸堿性1.堿性染料電離后色基帶正電荷細(xì)菌染色常用，如美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等2.酸性染料用于細(xì)胞漿染色，如伊紅、酸性復(fù)紅、剛果紅3.復(fù)合染料〔中性染料〕堿性染料與酸性染料的復(fù)合物，如瑞氏染料、姬姆薩染料等4.單純?nèi)玖先缣K丹染料，溶于脂肪溶劑，不溶于水，化學(xué)親和力低〔二〕常用的細(xì)菌染色法單染色法只用一種染料，如呂氏美藍(lán)復(fù)染色法用兩種或兩種以上不同顏色的染料細(xì)菌染色的一般程序1.涂片2.枯燥：自然枯燥為好3.固定4.初染5.媒染媒染劑6.脫色脫色劑7.復(fù)染1.革蘭染色法〔Gramstain〕〔1〕原理1〕細(xì)胞壁學(xué)說：兩種細(xì)菌細(xì)胞壁通透性不同2〕等電點(diǎn)學(xué)說3〕化學(xué)學(xué)說：兩種細(xì)菌含有RNA鎂鹽不同〔2〕方法：制片→結(jié)晶紫初染→碘液媒染→酒精脫色→復(fù)紅復(fù)染→結(jié)果革蘭陽性菌﹙G＋﹚：紫色革蘭陰性菌﹙G－﹚：紅色

2.抗酸染色法細(xì)菌著色后不被鹽酸酒精脫色的染色方法染料：石炭酸復(fù)紅、鹽酸酒精、美藍(lán)方法初染：5%石炭酸復(fù)紅加熱染色5min脫色：3%鹽酸酒精復(fù)染：呂氏美藍(lán)肺炎鏈球菌莢膜染色墨汁負(fù)染法芽胞染色第三節(jié)細(xì)菌別離培養(yǎng)和鑒定一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基〔culturemedium〕由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)物制品。〔一〕培養(yǎng)基的組成成分1.營養(yǎng)物質(zhì)碳源、氮源、無機(jī)鹽、水、生長因子〔1〕蛋白胨提供氮源植物胨:大豆動(dòng)物胨：牛肉、動(dòng)物組織等〔2〕肉浸液碳源、氮源〔3〕牛肉膏氮源〔4〕糖〔醇〕類碳源和能源〔5〕血液提供特殊生長因子、觀察溶血〔6〕無機(jī)鹽類常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等微量元素：Co、Zn、Mn、Cu、Mu等〔7〕雞蛋與動(dòng)物血清用于某些特殊培養(yǎng)基〔8〕生長因子維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等2.凝固物質(zhì)即賦形劑〔1〕瓊脂〔2〕明膠動(dòng)物膠原組織熬制而成3.抑制劑和指示劑〔1〕抑制劑：膽鹽、煌綠、染料、抗生素等選擇培養(yǎng)基：參加一定種類的抑制劑，以抑制雜菌生長或減少生長，有利于檢出菌生長的培養(yǎng)基。〔2〕指示劑：酚紅、中性紅、中國藍(lán)等鑒別培養(yǎng)基：參加特定底物和指示劑〔二〕培養(yǎng)基的種類1.按培養(yǎng)基的物理性狀〔1〕液體培養(yǎng)基：增菌〔2〕固體培養(yǎng)基：純化，增菌〔3〕半固體培養(yǎng)基：動(dòng)力檢測，保種

液體培養(yǎng)基固體斜面培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基2.按營養(yǎng)成分和用途分類〔1〕根底培養(yǎng)基：只有根本營養(yǎng)成分〔2〕營養(yǎng)培養(yǎng)基：加有血液、血清等〔3〕鑒別培養(yǎng)基：含有特定底物和指示劑〔4〕選擇培養(yǎng)基：含有抑制劑〔5〕特殊培養(yǎng)基：厭氧、細(xì)菌L型〔三〕培養(yǎng)基的選擇1.血平板最常用2.巧克力血平板奈瑟菌屬、流感嗜血桿菌3.腸道選擇培養(yǎng)基別離腸道細(xì)菌常用中國藍(lán)、EMB、MAC、SS4.堿性瓊脂或TCBS別離霍亂弧菌5.血液增菌培養(yǎng)基血液、骨髓增菌用6.營養(yǎng)肉湯增菌用〔四〕培養(yǎng)基的制備1.常用各種器具滅菌前的準(zhǔn)備〔1〕培養(yǎng)皿：用紙包裹〔2〕試管：加塞后用紙包好〔3〕吸管和毛細(xì)管〔4〕燒瓶2.培養(yǎng)基制備的一般程序〔1〕調(diào)配根據(jù)培養(yǎng)基組成，準(zhǔn)確稱取各組分，先加需要蒸餾水的一局部，再加培養(yǎng)基干粉，最后補(bǔ)足水量。〔2〕溶化液體培養(yǎng)基不需加熱〔3〕調(diào)整pH值一般7.2~7.6〔4〕過濾澄清〔一般可以省略〕液體培養(yǎng)基：濾紙固體培養(yǎng)基：紗布〔5〕分裝平板：滅菌后冷卻至50℃~60℃時(shí)傾倒90mm25~30ml〔4mm〕：藥敏用90mm13~15ml(3mm)：培養(yǎng)用瓊脂斜面：分裝量為試管的1/4~1/3，滅菌后趁熱制成斜面，斜面長度2/3高層、半固體、液體：分裝量為試管長度1/4~2/3〔6〕滅菌高壓蒸汽滅菌無糖：103.4kPa121.3℃15~30min含糖：68.4kPa115℃15min流動(dòng)蒸汽滅菌法血清、牛乳、雞蛋間歇蒸汽滅菌法〔7〕鑒定無菌試驗(yàn)：將制好的培養(yǎng)基在35℃孵育過夜，判定是否滅菌合格。效果檢查：按不同的培養(yǎng)要求，接種相應(yīng)菌種，觀察細(xì)菌的生長狀況，判斷培養(yǎng)基是否符合要求。〔8〕保存4℃冰箱保存，一周左右本卷須知1.器皿中性硬質(zhì)玻璃器皿2.化學(xué)藥品化學(xué)純以上3.準(zhǔn)確稱量，正確溶解4.準(zhǔn)確測定培養(yǎng)基酸堿度5.保持澄清6.滅菌時(shí)間不宜過長，不宜反復(fù)滅菌二、別離培養(yǎng)3.移種或接種的根本步驟4.常用的接種方法〔1〕平板劃線法分區(qū)劃線法用于雜菌量較多的標(biāo)本連續(xù)劃線法用于雜菌不多的標(biāo)本〔2〕瓊脂斜面接種法—純培養(yǎng)〔3〕穿刺法—觀察細(xì)菌動(dòng)力〔4〕液體培養(yǎng)基接種法—增菌〔5〕傾注平板法—計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量〔6〕涂布法—紙片法藥敏試驗(yàn)〔二〕細(xì)菌的培養(yǎng)方法1.需氧培養(yǎng)法普通培養(yǎng)2.二氧化碳培養(yǎng)〔1〕二氧化碳培養(yǎng)箱〔2〕燭缸法〔3〕化學(xué)法3.厭氧培養(yǎng)〔三〕細(xì)菌的生長現(xiàn)象1.固體培養(yǎng)基上的生長現(xiàn)象菌落：單個(gè)細(xì)菌在培養(yǎng)基上分裂繁殖成一堆肉眼可見的細(xì)菌集團(tuán)。CFU：菌落形成單位，活菌計(jì)數(shù)用細(xì)菌菌落的描述大小、形狀、突起或扁平、邊緣、顏色、外表、透明度〔1〕光滑型菌落〔S型菌落〕外表光滑、濕潤、邊緣整齊〔2〕粗糙型菌落〔R型菌落〕外表粗糙、枯燥、邊緣不齊〔3〕粘液型菌落〔M型菌落〕菌落粘稠、有光澤、似水珠樣卷發(fā)樣菌落粗糙型菌落〔L-J〕粘液型菌落2.液體培養(yǎng)基中的生長情況外表生長均勻混濁生長沉淀生長三、細(xì)菌生化反響鑒定〔一〕碳水化合物的代謝試驗(yàn)1.糖〔醇、苷〕類發(fā)酵試驗(yàn)原理各種細(xì)菌酶系不同，分解糖〔醇、苷〕的能力各異，產(chǎn)物也不同。培養(yǎng)基單糖、雙糖、三糖、多糖應(yīng)用腸道桿菌科細(xì)菌的鑒定

SugarFermentation

2.葡萄糖氧化/發(fā)酵試驗(yàn)〔O/F〕原理氧化型專性需氧菌發(fā)酵型產(chǎn)堿型不分解葡萄糖培養(yǎng)基Hugh-Leifson二氏培養(yǎng)基結(jié)果氧化管發(fā)酵管氧化型變黃不變發(fā)酵型變黃變黃產(chǎn)堿型不變不變〔陰性〕應(yīng)用

鑒別腸桿菌科細(xì)菌與非發(fā)酵菌3.β-半乳糖苷酶〔ONPG〕試驗(yàn)原理ONPG無色，經(jīng)β-半乳糖苷酶水解后生成黃色的鄰硝基酚方法〔1〕在含ONPG的培養(yǎng)基中接種純種細(xì)菌〔2〕制成菌懸液，參加甲苯，再加ONPG試劑結(jié)果陽性：變黃〔20~30min〕應(yīng)用緩慢發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定4.七葉苷水解試驗(yàn)原理葡萄糖七葉苷七葉素+Fe2+黑色化合物培養(yǎng)基七葉苷、膽汁七葉苷培養(yǎng)基結(jié)果陽性：培養(yǎng)基變黑用途鑒別腸球菌、G-桿菌及厭氧菌5.甲基紅〔methylredMR〕試驗(yàn)原理葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇甲基紅-葡萄糖→丙酮酸→各種酸甲基紅+培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水結(jié)果陽性：紅色陰性：黃色應(yīng)用鑒別腸桿菌科細(xì)菌6.VP〔Voges-Proskauer〕試驗(yàn)原理葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→二乙酰＋肌酸＋α萘酚→紅色化合物培養(yǎng)基葡萄糖蛋白胨水結(jié)果陽性：紅色應(yīng)用鑒別腸桿菌科細(xì)菌〔二〕蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)1.明膠液化試驗(yàn)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生明膠酶，分解明膠，使其失去凝固能力。方法：將待檢物接種于明膠培養(yǎng)基22℃培養(yǎng)7天結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌鑒別

3.硫化氫試驗(yàn)原理含硫氨基酸→H2S+硫酸亞鐵→FeS黑色醋酸鉛→PbS黑色培養(yǎng)基醋酸鉛培養(yǎng)基結(jié)果陽性：黑色沉淀用途腸桿菌科菌屬間的鑒定4.尿素分解試驗(yàn)原理尿素NH3+CO2+H2O(NH4)2CO3培養(yǎng)基尿素肉湯或尿素瓊脂培養(yǎng)基結(jié)果陽性：紅色用途腸桿菌科中變形桿菌的鑒定5.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)原理苯丙氨酸苯丙酮酸+10%氯化鐵綠色化合物培養(yǎng)基苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基

結(jié)果陽性：綠色用途腸桿菌科中變形桿菌的鑒定6.氨基酸脫羧酶試驗(yàn)〔三〕碳源和氮源利用試驗(yàn)1.枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)原理銨鹽碳酸鈉+氨培養(yǎng)基枸櫞酸鹽培養(yǎng)基結(jié)果陽性：藍(lán)色陰性：綠色2.丙二酸鹽利用試驗(yàn)利用枸櫞酸鹽生長+不能利用-

IMViC試驗(yàn)大腸埃希菌++--產(chǎn)氣桿菌--++〔四〕各種酶類試驗(yàn)1.氧化酶試驗(yàn)原理方法菌落法濾紙法試劑紙片法結(jié)果深紫色為陽性2.過氧化氫酶試驗(yàn)3.硝酸鹽復(fù)原試驗(yàn)4.脂酶試驗(yàn)5.卵磷脂酶試驗(yàn)6.DNA酶試驗(yàn)7.凝固酶試驗(yàn)8.CAMP試驗(yàn)9.膽汁溶菌試驗(yàn)〔五〕抑菌試驗(yàn)1.O/129試驗(yàn)用于弧菌科的屬間鑒別2.桿菌肽試驗(yàn)用于A群鏈球菌與其他鏈球菌間的鑒別3.奧普托欣試驗(yàn)用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別第四節(jié)細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測方法一、免疫學(xué)檢測利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，用已知抗原檢測未知抗體，或用抗體檢測未知抗原。反向間接血凝試驗(yàn)1.直接法：熒光素標(biāo)記抗體2.間接法：熒光素標(biāo)記二抗〔抗抗體〕3.免疫熒光菌球法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)-ELISA1.雙抗體夾心法2.競爭法陽性-無色〔二〕抗體檢測用的細(xì)菌或其特異性抗原檢測病人血清中有無相應(yīng)抗體及其效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化，輔助診斷某些傳染病。二、分子生物學(xué)檢測三、細(xì)菌毒素的檢測〔一〕內(nèi)毒素1.內(nèi)毒素的致熱作用〔體內(nèi)實(shí)驗(yàn)〕原理：內(nèi)毒素產(chǎn)生于G-菌，菌體死亡后釋放，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱。方法：〔1〕將家兔分成兩組，每組4只，測量基礎(chǔ)體溫并記錄。〔2〕用無菌注射器抽取待檢物注入一組家兔耳靜脈，另一組注射等量生理鹽水。〔3〕觀察動(dòng)物反響，并間隔30min測量兩組家兔體溫。結(jié)果：陽性試驗(yàn)組體溫升高對照組體溫正常應(yīng)用：無菌的生物制品2.鱟試驗(yàn)〔體外實(shí)驗(yàn)〕原理：鱟血液中含有一種變形細(xì)胞，此細(xì)胞裂解物可與微量內(nèi)毒素起凝膠反響，即細(xì)胞裂解物中的一種酶被激活，使細(xì)胞裂解物中的蛋白質(zhì)形成凝膠。鱟試劑：鱟變形細(xì)胞裂解物方法〔1〕翻開3支鱟試劑安瓶，各加0.1ml無菌蒸餾水使之溶解，同時(shí)編號(hào)。〔2〕向3支安瓶中分別加待測物、標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素、無熱原生理鹽水各0.1ml。〔3〕輕輕搖勻，垂直放37℃水浴，15~30min后觀察結(jié)果。鱟試驗(yàn)結(jié)果-不形成凝膠+形成凝膠，但不牢固++形成牢固凝膠，倒持安瓶凝膠不動(dòng)。應(yīng)用鱟試驗(yàn)〔二〕外毒素1.體內(nèi)毒力試驗(yàn)原理：細(xì)菌外毒素對機(jī)體具有強(qiáng)烈毒性作用，但可被相應(yīng)抗毒素中和，中和后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不產(chǎn)生中毒病癥。如：破傷風(fēng)外毒素的毒性作用和抗毒素保護(hù)作用。2.體外毒力試驗(yàn)抗原抗體反響四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)〔一〕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分類1.遺傳學(xué)控制方法分類〔1〕近交系動(dòng)物純系動(dòng)物〔2〕突變種純系動(dòng)物〔3〕雜種動(dòng)物2.微生物學(xué)控制方法分類〔1〕無菌動(dòng)物〔GF〕〔2〕悉生動(dòng)物〔GB〕〔3〕無特殊病原體動(dòng)物〔SPF〕〔4〕清潔動(dòng)物或最低限度疾病動(dòng)物〔5〕普通動(dòng)物〔二〕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇1.選擇敏感動(dòng)物2.選擇不同種類和品系動(dòng)物3.