基因工程復習課件書籍能培養我們的道德情操，給我們巨大的精神力量，鼓舞我們前進一、基因工程的工具及其操作程序1．基因工程的基本工具作用作用部位限制酶DNA連接酶載體切割目的基因和載體連接DNA片段，形成重組DNA攜帶目的基因進入受體細胞核苷酸的脫氧核糖與磷酸間形成的磷酸二酯鍵2021/6/182限制酶DNA連接酶載體作用特點(條件)常用類型學.科.網zxxk.(1)識別特定的核苷酸序列(2)在特定位點上切割(1)E·coliDNA連接酶只連接黏性末端(2)T4DNA連接酶連接黏性末端和平末端(1)能在宿主細胞內穩定存在并大量復制(2)有多個限制酶切割位點(3)具有特殊的標記基因EcoRⅠ限制酶SmaⅠ限制酶E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶質粒、噬菌體、動植物病毒2021/6/1831.限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。2.DNA連接酶起作用時不需要模板。2.載體(1)作用①將目的基因轉移到宿主細胞內。②利用它在宿主細胞內對目的基因進行大量復制。(2)具備的條件①能在宿主細胞內穩定保存并大量復制。②有多個限制酶切割位點。③具有特殊的標記基因，以便進行篩選。2021/6/184【例1】

(2010·江蘇高考·T27)下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSma

Ⅰ識別序列及切割位點G↓GATCCCCTAG↑GA↓AGCTTTTCGA↑AG↓AATTCCTTAA↑GCCC↓GGGGGG↑CCC2021/6/185(1)一個圖1所示的質粒分子經SmaⅠ切割前后，分別含有________個游離的磷酸基團。(2)若對圖中質粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多，質粒的熱穩定性越________。(3)用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________________。(4)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優點在于可以防止________。限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSma

Ⅰ識別序列及切割位點G↓GATCCCCTAG↑GA↓AGCTTTTCGA↑AG↓AATTCCTTAA↑GCCC↓GGGGGG↑CCC0,2高SmaⅠ會破壞質粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環化2021/6/186(5)為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入________________酶。(6)重組質粒中抗生素抗性基因的作用是為了________。(7)為了從cDNA文庫中分離獲取蔗糖轉運蛋白基因，將重組質粒導入喪失吸收蔗糖能力的大腸桿菌突變體，然后在________________________的培養基因培養，以完成目的基因表達的初步檢測。限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSma

Ⅰ識別序列及切割位點G↓GATCCCCTAG↑GA↓AGCTTTTCGA↑AG↓AATTCCTTAA↑GCCC↓GGGGGG↑CCCDNA連接鑒別和篩選含有目的基因的細胞蔗糖為唯一含碳營養物質2021/6/1871.獲取目的基因和切割載體時使用同一種限制酶，目的是產生相同的黏性末端。2.獲取一個目的基因需限制酶切割兩次，共產生4個黏性末端或平末端。3.限制酶切割位點的選擇必須保證標記基因的完整性，以便于檢測和篩選。學.科.網zxxk.2021/6/1882.基因工程的基本操作程序(1)目的基因的獲取①從基因文庫中獲取目的基因優點：有了基因文庫，就可以隨時從中提取所需要的目的基因，引入受體細胞使之表達。目的基因的獲取、基因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞、目的基因的檢測與鑒定2021/6/189②人工合成目的基因2021/6/1810③利用PCR技術擴增目的基因a．PCR：是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。PCR擴增是獲取目的基因的一種非常有用的方法，也是進行分子鑒定和檢測的一種很靈敏的方法。b．目的：通過指數式擴增獲取大量的目的基因。(2)基因表達載體的構建學.科.網zxxk.①目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并可以遺傳給下一代，并使目的基因能夠表達和發揮作用。2021/6/1811(2)基因表達載體的構建方法2021/6/1812 (1)一般來說，天然載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據不同的目的和需要，需要對某些天然的載體進行人工改造。(2)插入的目的基因的表達需要調控序列，因而用作載體的質粒的插入部位之前需有啟動子，之后需有終止子。2021/6/18131．(2009年濰坊模擬)質粒作為“分子運輸車”的條件是 (

)①能夠自我復制②雙鏈環狀DNA分子③有多個限制酶切點④有標記基因⑤真核細胞中沒有A．①②③④⑤ B．①②③④C．①③④ D．②③⑤【答案】

C2021/6/18142．(2009年南通調研)下列關于基因表達載體構建的相關敘述，不正確的是 (

)A．需要限制酶和DNA連接酶B．必須在細胞內進行C．抗生素抗性基因可作為標記基因D．啟動子位于目的基因的首端【答案】

B2021/6/1815(3)將目的基因導入受體細胞①目的：目的基因進入受體細胞內并在受體細胞內維持穩定和表達的過程。②受體細胞種類不同，導入方法不同。受體細胞種類方法植物細胞①農桿菌轉化法：目的基因插入Ti質粒的T－DNA→轉入農桿菌→導入植物細胞→穩定維持和表達②基因槍法③花粉管通道法2021/6/1816受體細胞種類方法動物細胞顯微注射法：目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→新性狀動物微生物細胞Ca2＋處理受體細胞→感受態細胞→表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子2021/6/1817③受體生物不同，所用的受體細胞種類也不相同。a．植物：可以是卵細胞(受精卵)、體細胞(可經組織培養成為完整植株)。b．動物：受精卵(因為體細胞的全能性受到嚴格限制)。④轉化實質：目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。2021/6/1818基因工程中受體細胞的選擇基因工程的目的不同，可選用的受體細胞不同。(1)培育轉基因動物，受體細胞一般選用受精卵。(2)培育轉基因植物，受體細胞可選用受精卵或體細胞，若選用體細胞，再通過植物組織培養，即可獲得轉基因植株。(3)若生產基因工程藥品，受體細胞一般選用細菌，利用細菌繁殖速度快的特點，可在短期內獲得大量產品。2021/6/1819(4)目的基因的檢測與鑒定類型步驟檢測內容方法結果顯示分子檢測導入檢測目的基因是否插入受體細胞染色體的DNA上表達檢測目的基因是否轉錄出mRNA目的基因是否翻譯出蛋白質DNA分子雜交技術(DNA和DNA之間)核酸分子雜交技術(DNA和mRNA之間)蛋白質分子雜交(抗原和抗體之間)是否成功顯示出雜交帶同上同上2021/6/1820個體生物學水平的鑒定①抗蟲或抗病的接種實驗②基因工程產品與天然產品活性的比較2021/6/1821【例2】

(2009·福建高考·T32)轉基因抗病香蕉的培育過程如圖所示。質粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四種限制酶切割位點。請回答：(1)構建含抗病基因的表達載體A時，應選用限制酶__________________，對_________________進行切割。(2)培養基中的卡那霉素會抑制香蕉愈傷組織細胞的生長，欲利用該培養基篩選已導入抗病基因的香蕉細胞，應使基因表達載體A中含有______________，作為標記基因。PstⅠ、EcoRⅠ含抗病基因的DNA、質粒抗卡那霉素基因2021/6/18221.使用限制酶切割目的基因和質粒時，既要保證形成相同黏性末端，又要考慮保證目的基因和質粒中的標記基因的完整性。2.標記基因是鑒別受體細胞中是否含目的基因的依據。利用質粒作載體時往往利用其上的某抗性基因作標記基因，又可利用其抗性在適當的選擇培養基上選擇培養。2021/6/18232.如圖表示從蘇云金芽孢桿菌分離出殺蟲晶體蛋白基因(簡稱Bt基因)及形成轉基因抗蟲植物的圖解。請分析回答：(1)寫出b過程的表達式________________________。(2)人工合成目的基因的方法有①________；②________。(3)將目的基因和載體(質粒)結合的工具酶有________酶和________酶。(4)科學家計劃從哺乳動物的乳汁中提取某種抗體，應將控制抗體合成的基因導入該種動物的________中，導入基因成功表達的標志是________。【答案】(1)Bt基因mRNA原毒素(晶體蛋白)

(2)①反轉錄法②化學合成法(3)限制性核酸內切DNA連接(4)受精卵動物乳汁中含此種抗體2021/6/1824二、基因工程的應用成果及蛋白質工程1．基因工程的應用成果(1)乳腺生物反應器與微生物生產的比較2021/6/1825類型項目乳腺生物反應器微生物生產基因結構動物基因結構與人類基因結構相同與人類基因結構不同基因表達與天然蛋白質活性沒有區別由于缺少內質網、高爾基體等細胞器，產物可能不具有生物活性產物提取從乳汁中較易分離提取從細胞中提取，較為復雜生產設備畜牧業生產，加工提取設備工業生產，設備精良2021/6/1826

乳腺生物反應器受生物性別的限制，若從動物尿液中提取目的基因產物則不受性別限制。2021/6/1827(2)基因治療項目類型外源基因類型及舉例過程特點成果舉例體外基因治療腺苷酸脫氨酶基因①從病人體內獲得某種細胞②細胞培養③體外完成基因轉移④篩選并擴增培養⑤重新輸入患者體內操作復雜，但成功率高治療復合型免疫缺陷癥體內基因治療治療遺傳性囊性纖維化病的基因外源基因―→載體攜帶體內相應組織細胞操作簡單，成功率低治療遺傳性囊性纖維化病2021/6/1828

基因治療是治療人類遺傳病的根本方法，但由于尚未全面了解基因調控機制和疾病的分子機理，基因治療只處于初期的臨床試驗階段。2021/6/18292．蛋白質工程(1)概念：是指以蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產和生活的需求。(2)過程：預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列。2021/6/1830(3)蛋白質工程與基因工程比較項目蛋白質工程基因工程區別過程預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列獲取目的基因→構建基因表達載體→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定實質定向改造或生產人類所需蛋白質定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產品結果生產自然界沒有的蛋白質一般是生產自然界已有的蛋白質聯系蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程。對現有蛋白質的改造或制造新的蛋白質，必須通過基因修飾或基因合成實現2021/6/1831

蛋白質工程的實施步驟(蛋白質工程的實質即“中心法則”的逆推：2021/6/18323．繼哺乳動物乳腺生物反應器研發成功后，膀胱生物反應器的研究也取得了一定進展。最近，科學家培育出一種轉基因小鼠，其膀胱上皮細胞可以合成人的生長激素并分泌到尿液中。請回答：(1)將人的生長激素基因導入小鼠受體細胞，常用方法是______________。(2)進行基因轉移時，通常要將外源基因轉入____________________中，原因是_____________________________________。顯微注射技術受精卵(或早期胚胎)受精卵(或早期胚胎細胞)具有全能性，可使外源基因在相應組織細胞表達2021/6/1833(3)通常采用__________________技術檢測外源基因是否插入了小鼠的基因組。(4)在研制膀胱生物反應器時，應使外源基因在小鼠的________細胞中特異表達。(5)為使外源基因在后代長期保持，可將轉基因小鼠體細胞的________轉入________細胞中構成重組細胞，使其發育成與供體具有相同性狀的個體。該技術稱為________。DNA分子雜交(核酸探針)膀胱上皮細胞核去核的卵核移植(或