慢病毒載體構建、病毒包裝實驗操作手冊

一、簡介

慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎發展起來的基因治

療載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可以在體內較長期的表達且安全

性高。我們提供的慢病毒為復制缺陷型病毒，即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，

也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的

基因所取代,屬于假型病毒。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學危險，我們建議不要

使用編碼已知或可能會致鹿的基因的假型病毒，除非已經完全公認某個基因肯定沒有致癌

性，否則均不建議采用彳鯉病毒進行生物學實驗。

復百澳公司所用的慢病毒載體是在Clonetech公司的慢病毒包裝系統上改進而來。包

括載體質粒(PFV：PLVX)、輔助質粒psPAX2(pHelper1)和輔助質粒pMD2G(pHelper2)

三種質粒組成。載體質粒PFV載體中含有HIV的基本元件5'LTR和3'LTR以及其他輔

助元件。通常根據不同的實驗目的針對載體質粒進行改造來進行啟動子活性研究、基因表

達研究?口RNA干擾等研究。pHelper1載體中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的

結構蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因，編碼調節gag和pol基因表達的調

節因子。pHelper2載體中含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因,提供病毒包裝所需要的

包膜蛋白。

本手冊為復百澳公司慢病毒載體的構建和病毒包裝的通用操作流程，目的是為了方便大家

交流使用,部分細節內容未能做到一詳述,敬請諒解.同時希望大家能夠針

對手冊中的錯誤和問題，提出寶貴的意見。

服務及實驗流程

1.病毒包裝服務流程圖

客戶提供公司服務

呼酒潘.德

2.病毒包裝實驗操作流程圖

三質粒共轉病毒上清液超速

293T細胞離心濃縮純化

24H第一次收毒換液慢病毒質檢

48H第二次收毒

三、實驗材料

1.細胞株：293T細胞，用于病毒包裝。

2.大腸桿菌菌株：TOP10,用于擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒。

3.病毒載體質粒：載體質粒、pHelper1質粒和pHelper2質粒

4.試劑：

試劑名稱試劑來源-

胎牛血清胎牛血清Sh30084.03

DMEM（高糖）HycloneSh30022.01B

胰酶HycloneSH30042.01

Lipofectamine2000Invitrogen11668-500

限制性內切酶NEB

NEBLife15224-041

5.儀器

儀器名稱儀器來源cat.No.

熒光顯微鏡LeicaDMILLED

C02培養箱力康生物醫療科技控股有限公司HF90

生物安全柜力康生物醫療科技控股有限公司HFsafe-1200TE

超速離心機beckmanoptimal-90K

微量高速離心機ThermoPICO17

四、質粒構建

1.目的基因合成和干擾序列設計

示例1.過表達基因克隆構建：EPO基因（human）的全基因合成。

MCS_ATGGGGGTGCACGMTGTCCTGCCTGGCTGTGGCTTCTCCTGTCCCTGCTGTCGCTCCCT

CTGGGCCTCCCAGTCCTGGGCGCCCCACCACGCCTCATCTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGT

ACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAATATCACGACGGGCTGTGCTGAACACTGCAGCTTGA

ATGAGAATATCACTGTCCCAGACACCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGG

GCAGCAGGCCGTAGAAGTCTGGCAGGGCCTGGCCCTGCTGTCGGAAGCTGTCCTGCGGGGCCA

GGCCCTGTTGGTCAACTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAAGCCGTC

AGTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAGGAAGCCATCTCCC

CTCCAGATGCGGCCTCAGCTGCTCCACTCCGAACAATCACTGCTGACACTTTCCGCAAACTCTTC

CGAGTCTACTCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCCTGCAGGACA

GGGGACAGAGGTATGGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAG

GACTATAAGGATGATGACGACAAAGCTAGCTAA-MCS-

示例2:基因干擾克隆構建：nucleolin基因干擾腺病毒設計

1）干擾序歹！J設計:shRNA:GGATGAAGATGAAGAGGATGA

2)合成shRNAoligo

ShRNA-1

CCGGGGATGMGATGMGAGGATGACTCGAGTCATCCTCTTCATCTTCATCCTTTTTTG

shRNA-2

AATTCAAAAAAGGATGAAGATGAAGAGGATGACTCGAGTCATCCTCTTCATCTTCATCC

3)退火體系：

名稱體積

Oligo1(100pM)1ul

Oligo2(100pM)1ul

10XT4LigationBuffer(NEB)2ul

ddH2015ul

T4PNK(NEBM0201S)1ul

total20ul

37℃30分鐘，95℃5分鐘，然后按照5℃/分鐘的速度降至25℃。

2.教體前切：

名稱體積

ddH2OXpL

10Xbuffer1ML

純化的DNA質粒載體1Mg

NEB內切酶I0.5|JL

NEB內切的II0.5|jL

Total20ul

3.載體和目的片段鏈接

按摩爾比配制連接體系:目的片段：載體=3:1

名稱體積

酶切回收質粒Xul

稀釋后退火引物（或合成Yul

的目的基因）

5XT4DNALigaseBuffer2ul

T4D\ALigase(5U/ML)1ul

total10ul

4.質粒轉化

1）50ulDH5a感受態放冰上融化，取2ul連接產物和感受態細胞混勻；

2）冰浴30min,42°C水浴熱擊90sec,冰浴2min;

3）轉化產物轉移到含500ul無抗性LB液體培養基的EP管中，置于搖床中，37℃,250

轉/分，培養30分鐘；

4）將含有轉化菌的EP管,16000G離心Imin;

5）在超凈臺中倒去上清，將沉淀均勻涂于LB培養平板（Amp+）;

6）將平板倒扣置于37℃細菌培養箱培養過夜（12~16H）。

2.單克隆培養與鑒定

1）從上述平板中擬微單克隆菌落于5mlLB液體培養基中，37℃,250

轉/分，培養過夜（12~16H）;

2）質粒提取（按照天根質粒提取試劑盒說明書提取）

3）質粒測序鑒定，將測J序結果與設計序列進行比對鑒定。鑒定結果正確的質粒,進行后

續病毒包裝實驗。

五、病毒生產部分

（-）病毒包裝

1.24h,用胰蛋白酶消化又擻生長期的293T細胞,重新接種于10cm細胞培養皿，

37℃、5%CO2培箱g內培養，待細胞密度達70%~80%時即可用于轉染；

2.轉染前2h將更換細胞培養基培養基；

3.向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液（載體質粒10pg,pHelper1.0載體5p

g,pHelper2.0載體5pg）,與相應體積的Opti-MEM混合均勻,調整總體積為0.5

ml,在室溫下溫育5分鐘。

4.取50ulLlpofectamlne2000試劑與450ulOptl-MEM混合,在室溫下溫育5分鐘c

5.把稀釋后的DNA與稀釋后的轉染試劑混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。

6.混合后，在室溫下溫育10分鐘。

7.將上述轉染混合物滴加到293T細胞培養液中，搖勻，于37°C,5%C02

8.細胞培養箱中培養。

9.培養6-8h后倒去含有轉染混和物的培養基,每盤細胞更換10ml的10%FBS完全

培養基,37°C、5%C02培養箱內繼續培養。

10.轉染后24H,用顯微潦觀察含標簽熒光（GFP/RFP）細胞的數量判定轉染效率。

11.確定轉染成功后（熒光細胞比例70%），進行第一次收毒操作。收集細胞培養基于一

個無菌50ml離心管中，4。（：保存。更換新鮮的10%FBS培養基10ml,繼續培養24HO

12.轉染后48H,進行二次收毒操作。收獲含病毒培養基于無菌50ml離心管，4。（：保存。

（二）病毒濃縮純化

1.將收獲的含病毒顆粒的培養基，經過0.22um濾膜過濾并收集于無菌超速離心管中，

配平、密封；

2.超速離心80,000g,離心4H;

3.棄去離心后上清，用Virusstorebuffer（復百澳?）重懸沉淀；

4.收集重懸液,再次經過0.22um濾膜過濾除菌，分裝于無菌病毒管中；

5.每個病毒管上貼好相應的標簽，轉于-80℃冰箱保存，

（=）滴度檢測

1.實驗前24H,接種HEK293T細胞于96孔板中,約1*103個/孔，503/孔,于37℃,

5%C02條件下培養；

2.實驗前在顯微鏡下，對實驗用細胞進行觀察，確定細胞飽滿、分部均勻、無污染后再

進行后續實驗。

3.病毒梯度稀釋：

1）準備1個新的96孑飯，由