PCR是擴增DNA的一項技術，在設計好引物后可以實現線性DNA的指數式擴增。那么環形質粒能否進行PCR，如何設計引物，擴增的產物是什么？

如果是線性DNA的話，引物一般是依據模板DNA兩端的序列進行設計，延伸到模板的末端即停止。質粒是環形雙鏈沒有末端，每條鏈均需要引物，引物需要2種。由于沒有末端理論上來說引物結合在模板鏈的任何一個位置均可以，延伸至該引物的5’端停止，由于PCR體系無DNA連接酶，因此最后一個脫氧核苷酸無法和引物的5’端磷酸形成磷酸二酯鍵成環，因此質粒如果做PCR只能得到線性DNA。

如何實現質粒線性化

由于兩條鏈的引物位置設計不同，可能導致環形質粒的擴增產物有2種，一是松散環形DNA（也可以說帶有黏性末端DNA），二是線性DNA。

1、產物是線性DNA

若要想得到環形DNA，兩個引物的5’末端相對“接在一起”中間不能再有堿基，這樣能夠得到末端平齊完全線性化的雙鏈DNA。如上圖所示。

2、產物是具有粘性末端（3’突出）的線性DNA

如果兩個引物的5’末端之間有堿基的話，會得到具有粘性末端的線性DNA，如下圖。不過由于末端互補，可以靠堿基互補配對黏合在一起形成環形。（可以聯想目的基因如果用同一種限制酶酶切的話可能造成目的基因環化），不過如果沒有DNA連接酶的話，這個環形質粒是有切口的，屬于松散環形DNA，其本質還是線性DNA。

3、產物是具有粘性末端（5’突出）的線性DNA

如下圖的質粒，我們把引物設計成完全互補，紅色是引物，那么PCR后的產物是有粘性末端的線性DNA，由于5’段突出，所以在DNA聚合酶（PCR體系里的耐高溫的DNA聚合酶）的作用下沿著3’端繼續延伸，直至補齊末端成為完全平齊的線性DNA。當然也有可能因為粘性末端的互補成為松散環形DNA。

4、在引物的5’添加非互補序列得到具有粘性末端（5’突出）的線性DNA

如果引物按照下圖設計，在引物的5’添加非互補序列也會得到具有粘性末端的線性DNA。同樣有可能被DNA聚合酶補齊成為平齊的線性DNA，也可能因為堿基互補成為松散環形。

質粒線性化的用途1

反向PCR

一般的PCR我們需要知曉目的基因兩端的序列方便我們設計引物，如果僅僅知道目的基因內部一小段DNA，我們如何才能擴增該基因進而進行測序呢？我們可以想法先把目的基因環化（用同種限制酶切產生相同的粘性末端即可），然后根據剛才分析的第一種引物設計方法即可擴增得到線性DNA，得到的線性DNA可以用于測序。如下圖所示

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同源重組在質粒的任意位點插入目的基因

如圖所示，質粒經PCR后可以線性化，目的基因PCR時采用的引物除了和目的基因特異性互補外，在每個引物的5’端需要添加線性化載體兩個末端的序列，這樣擴增后的目的基因產物含有線性質粒兩端的同源序列，根據同源重組插入載體中，同源重組的模式圖如下。類似于減數分裂時的交叉互換。

除了擴增目的基因添加線性質粒末端同源序列外，也可以反過來，線性質粒PCR時設計引物如上述第4種類似在引物5’端添加目的基因兩端的同源序列，可以達到相同的效果。如下圖所示

這種做法的優點相比雙酶切來說同樣可以保證插入方向，重組效率比雙酶切高，而且可以不受質粒上酶切位點的限制，可以通過合理設計引物在任意位點插入目的基因。

在上述采用同源重組的方法插入目的基因時，