STYLEREF標題摘要第2章臨床PCR檢驗2.1標本的類型在臨床PCR中，血清（血漿）、血液、外周血單核細胞、痰、棉片、膿液等體液（胸腔積液、腹水、腦脊液、尿液等）、乳液、運輸和保存對檢測結果有影響。因此，為了驗證試驗結果的正確性，必須制定收集、運輸和保存臨床樣品的標準程序。2.2標本的采集2.2.1標本采集時間采集過早或過晚都可能會給出假陽性結果，所以一定要把握好最佳時間。2.2.2標本采集部位消毒在開始取樣之前，應清潔取樣點，以去除受污染的微生物或其他雜質。但是，這必須是適當的，過度凈化可能會去除或破壞目標微生物。2.2.3采樣量樣本的類型和數量應根據已經識別出的引起疾病的微生物來確定，一般要根據引起充足數量疾病的微生物樣本來確定，用于提取核酸和測量此后的增長。在病原體含量低的樣品中，樣品的尺寸是測量的關鍵。例如，PCR用于血液檢查，血液中的特異性抗原或抗體一般含有較少的病原體，因此需要更多的樣本。2.2.4樣品采集器衛生棉條和其他收集的材料必須是一次性的，運輸容器還必須是密封的一次性消毒器。材料中使用的抗凝劑和相關試劑不應妨礙基因的擴大和測試。2.2.5采樣過程中的防污染最好使用一次性材料，而不是直接治療；采集時應特別注意防止污染，混入作業人員皮膚細胞、痰盂等；如果使用玻璃器皿，則必須在0.1%高壓水下處理，以使核糖核酸酶能夠存活和降解，這可以抑制聚合酶鏈反應。2.3標本的運送一旦收集了所有的PCR樣品，就應暫時儲存在2-8℃之下，然后再送往實驗室。應盡快將其送到實驗室。在無菌條件下收集的DNA靶標樣品應在室溫下交付實驗室8小時；如果核酸是RNA，它可以在室溫下運輸10分鐘。如果需要很長的時間，它應該在冰上運輸。2.4標本驗收、拒收采集的樣本必須從原容器中采集，不能與生化、免疫學等其他樣本混用，因為它們之間感染的可能性很高。應拒收溶血或高脂血癥等血樣。對于沙眼衣原體的擴張，應在顯微鏡下觀察表皮，因為病原體是在上皮細胞中形成的，如果下一層上皮沒有或很少，如果在顯微鏡下觀察到的白細胞很少，說明沒有收集到合格標本。2.5標本的預處理和保存血清(漿)標本

如果血清樣品用于DNA提取和檢測，請遵循血清樣本的一般處理程序。如果EDTA更適合RNA捕獲檢測，則嚴禁使用海洛因。因為它抑制了PCR的增加，在核酸提取過程中很難完全清除，防止凝固后1h內分離血清，4h內分離血漿，放入1.5ml無菌離心管保存。外周血單個核細胞

外周血單個核細胞可以在抗凝劑中產生。主要有兩種方法：一種是用淋巴細胞分離液分離產生外周血單個核細胞，另一種是用紅細胞溶解液分解全血中的紅細胞，用生理鹽水反復洗滌可獲得單核細胞。痰

痰屬于分泌物，臨床上經常使用DNA檢測結核，痰中含有大量粘稠雜質，DNA提取需要初步處理在室溫下用NaOH或變性劑液化約三十分鐘，如果液體樣品不能立即用于DNA提取，可以保存在-70℃下。棉拭子

在檢測性病病原體的PCR程序中，臨床樣本通常是棉絮，可將棉絮棒置于室溫下適量的生理鹽水溶液中，完全搖勻洗凈，然后在室溫下放置5至10分鐘。立即離心殘余物，隨后的沉淀可用于提取DNA。如果不立即使用膠囊提取核酸，則應將其儲存于-70℃下。膿液

膿液如用于分枝桿菌測定的標本，黏液可采用痰標本的處理方法來處理，先液化，再離心取沉淀提取DNA;水樣的膿液則直接離心沉淀用生理鹽水洗2-3次后，即可用于DNA提取。第3章案例分析3.1案例一男性,44歲,腹脹、厭食、乏力間作5年余，加重10余天。飲酒史15年，每天飲白酒約200毫升。患者緣于5年余前無明確誘因出現上腹部脹滿不適，食欲不振，周身乏力。到當地衛生院就診，化驗乙肝五項提示“乙肝表面抗原陽性，乙肝e抗原陽性，乙肝核心抗體陽性”，診斷為“慢性乙型病毒性肝炎”，間斷服用“護肝片”等藥物治療，病情遷延不愈。近10余天來，患者飲酒后出現上腹部脹滿不適癥狀加重，無腹痛腹瀉，無惡心嘔吐。食欲不振，周身乏力。在家口服“護肝片、奧美拉唑腸溶膠囊”等藥物治療，癥狀無減輕，為系統診治。（一）體查：T36.5℃,P86次/分,R:15次/分,BP130/80/mmhg。神清語利，周身皮膚粘膜無黃染，未見蜘蛛痣及肝臟，未見皮下出血點。口唇無發紺，咽部無充血發紅，扁桃體無腫大。頸軟無抵抗，甲狀腺未觸及腫大。胸廓對稱，語顫無增強或減弱，叩診呈清音，雙肺呼吸音清，未聞及干濕啰音。心律86次/分，律齊，各瓣膜聽診區未聞及病理性雜音。腹平軟，右上腹輕壓痛，無反跳痛，肝脾臟未觸及，肝區叩擊痛，移動性濁音陰性，腸鳴音正常存在。雙腎區無叩擊痛，雙下肢無浮腫，四肢肌力、肌張力正常，病理征陰性。（二）輔助檢查乙肝表面抗原：500ng/ml。乙肝病毒指數：9.3+7。肝功能：ALT(谷丙)：138.6，AST（谷草）：193U/L，GGT（谷氨酰基轉移酶）：867U/L，前白蛋白：41.3mg/dl。尿素氮：2.3mmol/L，肌酐：36.2umol/L，尿酸：440.3umol/L，總膽固醇（TBIL）：6.9mmol/L，高密度脂蛋白：2.91mmol/L，載脂蛋白A：2.60g/L。LDH（乳酸脫氫酶）：248U/L，HBDH（α-羥丁酸脫氫酶）：188U/L。上腹部超聲：肝臟實質回聲增粗。（三）初步診斷1.慢性乙型病毒性肝炎2.高尿酸血癥3.高脂血癥（四）診斷依據1.患者上腹部脹滿不適，無腹痛腹瀉惡心嘔吐的癥狀。食欲不振，周身乏力。2.查體：Bp:130/80mmHg。周身皮膚粘膜無黃染，未見蜘蛛痣和皮下出血點。心肺未見異常。腹平軟，右上腹輕壓有痛感，無反跳痛，肝脾臟未觸及，肝區叩擊痛，移動性濁音陰性，腸鳴音正常存在。3.輔助檢查資料：化驗乙肝表面抗原：500ng/ml。乙肝病毒指數：9.3+.7。肝功能：ALT：138.6，AST：193U/L，GGT：867U/L，前白蛋白：41.3mg/dl。尿素氮：2.3mmol/L，肌酐：36.2umol/L，尿酸：440.3umol/L，總膽固醇：6.9mmol/L，高密度脂蛋白：2.91mmol/L，載脂蛋白A：2.60g/L。LDH：248U/L，HBDH：188U/L。上腹部超聲：肝臟實質回聲增粗。（五）鑒別診斷1.肝硬化：患者多有慢性肝炎病史，或者長期飲酒、脂肪肝、自身免疫性肝炎，酒精肝等病史，主要表現為右上腹不適癥狀，周身乏力，可以出現皮膚粘膜黃疸，腹水、上消化道出血等癥狀，上腹部超聲檢查可以鑒別。2.慢性胃炎：患者一般表現為上腹部不適，惡心嘔吐，可以出現上腹部燒灼感，泛酸，食欲不振等癥狀。胃鏡檢查可以鑒別。（六）診治經過入院后完善各項輔助檢查。給予感染性疾病護理常規，II級護理，低鹽低脂飲食。予護肝片口服、硫普羅寧、肝水解肽靜點以保肝降酶，恩替卡韋分散片口服以抗病毒，辛伐他丁片口服以調脂，維生素C、維生素B6靜點以加強營養支持。（七）臨床診斷1.慢性乙型病毒性肝炎2.高尿酸血癥3.高脂血癥（八）分析總結慢性乙型病毒性肝炎是由于HBV感染引起的，如果治療不及時，可以會發展為肝硬化，甚至肝癌。慢性乙型病毒性肝炎患者需要定期復查肝功能和乙肝病毒指數。如果肝功能在正常范圍內，可暫時不用抗病毒藥物治療。如果乙肝病毒指數明顯升高，谷丙轉氨酶數值在正常數值的2倍以上，無禁忌癥，需要常規使用抗病毒藥物治療。目前比較常用的抗病毒藥物包括a-2b干擾素、聚乙二醇干擾素、拉米夫定片、恩替卡韋分散片等藥物，可以根據患者病情選擇，一定要按照療程用藥，避免隨意停藥，導致病情反彈。要注意定期復查肝功能、乙肝五項、乙肝病毒指數等項目。要注意飲食控制，不要吃辛辣食物，避免飲酒，防止損傷肝細胞。3.2案例二病人男，42歲，發熱、食欲減退時達10天。10天前不明原因出現發熱，體溫在38℃左右,伴有頭痛，全身乏力、食欲減退等癥,自認為是“感冒”，口服“康秦克”等藥物，5天后體溫下降至正常，食欲好轉，但家人發現患者皮膚發黃因此來醫院就診。（一）體檢:T36.5℃，p70次/分，R20次/分，BP110/70mHg鞏膜及皮膚黃染,未見肝掌且無出血點，淺表淋巴結無腫大，頸軟，心肺正常。腹軟，右肋下2.3cm質軟有壓痛感，表面光滑，脾未及。（二）實驗室檢查:血常規,血紅蛋白126g/L，白細胞5.0×10L，中性粒細胞0.66，淋巴細胞0.34，大便、尿常規正常。（三）肝功檢查:ALT450U/L，血清抗HAV-1gM(+)。（四）初步診斷：1.甲型肝炎病毒2.黃疸（五）診斷分析依據HAV主要在肝細胞胞漿內復制，通過膽汁從糞便中排出，HAV只有一個血清型和一個抗原抗體系統，肝炎又分為急性和慢性，急性黃疸型肝炎又分為。黃疸前期，黃疸期，恢復期三個階段，總病程2～4個月，黃疸前期甲型肝炎于物型肝炎發病較急，常伴全身癥狀發熱，全身乏力，消化道癥狀，食欲不振，厭油，惡心，嘔吐，腹痛，腹瀉，尿色逐漸加深。黃疸期自覺癥狀好轉，發熱消退，但尿色繼續加深，出現黃疸約于二周內達高峰。（六）輔助檢查肝功能檢查1.血清酶的檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)是反映肝細胞功能的最常用指標;天門冬氨酸氨基酶(AST)存在于線粒體中，意義與ALT相同;堿性磷酸酶(ALP)在肝外梗阻性黃疸、淤膽型肝炎患兒童中可明顯升高；γ-谷氨酰轉移酶在肝炎活動期時可升高，在肝癌或膽管阻塞、藥物性肝炎者中可顯著升高。2.膽紅素黃疸型肝炎及部分肝硬化患者血清直接和間接膽紅素測定均升高，但前者幅度高于血清膽紅素是判定肝損傷程度的重要指標之一。急性肝炎早期尿中尿膽原增加，黃疸期尿膽原和紅素均增加，梗阻性黃疸時尿膽紅素強陽性而尿膽原可陰性。3.血清蛋白慢性肝炎和肝硬化時常有血清清蛋白減少和球蛋白增加。形成A/G值下降，甚置。4.凝血酶原活動度凝血酶原活動度高低與肝損害程度成反比，凝血酶原活動度<40%時提示肝損傷嚴重。（七）超聲檢查動態的觀察肝脾的形態大小血管分布情況，觀察膽囊大小，形態，膽囊壁的厚薄，探測有腹腔積液，有無肝硬化，顯示肝門部及后腹部淋巴結是否腫大。（八）肝穿刺活體組織檢查肝穿刺活體組織檢查能準確判斷。慢性肝炎患者所處的病變階段及預后，同時可進行原位雜交和原位聚合酶鏈反應（PCR）技術確定病原及病毒復制狀態。臨床診斷為急性黃疸型甲型病毒型肝炎（九）治療原則：病毒性肝炎目前還缺乏可靠的特效治療方法，治療原則以適當休息合理營養為主，輔以適當的藥物治療，避免飲酒和使用損害肝臟的藥物。3.3案例三患者男，68歲，14年前診斷為MPN-PV（骨髓增殖），曾使用羥基脲、別嘌醇及皮下注射干擾素進行治療。現外周血常規檢查：白細胞計數：10.5*109/L升高、血紅蛋白測定：64g/L下降、血小板計數：75*109/L，白細胞分類，可見幼粒及幼紅細胞；巨脾，甲乙線：10cm，甲丙線：11cm丁戊線1cm；分子生物學檢查：jak2/v617f定量82.63%；BCR/ABLP190、BCR/ABLP210定量均為0；JAK2-Exon13、MPL-Exon10、CALR-Exon9均陰性；骨髓活檢：骨髓增生極度活躍，粒系，紅系，巨系細胞增生伴巨核細胞形態異常及纖維組織增生（MF-2）；骨髓細胞涂片：增生重度減低，成紅細胞易見淚滴形紅細胞。見圖5.1圖5.1易見淚滴形紅細胞

骨髓涂片

瑞氏染色x1000圖5.2淚滴形紅細胞易見

偶見原始細胞

骨髓涂片

瑞氏染色x1000圖5.3PV后MF診斷標準（WHO，2017）乙型肝炎病毒是引起病毒性肝炎的主要病原體之一。根據有關資料統計，全球約有3.5億乙肝病毒攜帶者，我國約50%~70%的人群感染過乙肝病毒，其中乙肝病毒攜帶者已超過1.3億，肝癌發病率也在增加。肝癌偏愛的人身上往往有8個特點，分別是：1.得過乙肝2.有肝硬化3.家族中有肝癌患者4.過了40歲更要注意5.嗜酒如命6.喜歡吃霉變食品7.長期患有膽結石8.長期服用某些特定傳統藥物經過四個案例分析數據得出下圖； 圖5.4圖5.5圖5.5圖5.6 結論也就是說，分子生物學技術廣泛應用于醫學、標準化、質量管理等領域。由衛生部開發，對分子生物學的發展起到了重要作用。交叉污染的醫療檢查在一定程度上得到了解決。分子生物學的應用主要與完全自動化的醫療系統的發展有關。可有效處理聚氯乙烯污染問題的檢查。此外，分子生物學技術。例如，由于自擴增系統等技術的發展，得到了人們的認可。分子生物技術的廣泛應用和醫學實驗室的標準化大大減少了醫學檢驗過程中交叉污染的相關問題，使得醫學檢驗難度大，可以提高整體效率。分子生物學檢驗技術的臨床應用，主要指應用分子生物學檢驗技術對人類疾病進行診斷和研究的過程。包括病原微生物的診斷、人類基因組相關疾病的診斷惡性腫瘤個體化治療靶點的選擇以及在移植配型和個體識別方面的應用。分子生物學檢驗技術通過檢測病原微生物的特征性基因位點以及患者自身基因結構的變化或表達異常的存在，獲得疾病的診斷依據，完成疾病的分子診斷。隨著分子生物學檢驗技術的飛速發展,分子診斷、基因診斷正日漸成為臨床上快速、準確的進行疾病診斷的重要途徑和手段。參考文獻[1]王海英.分子生物學技術在醫學檢驗中的應用進展[J].當代醫學,2011,17(06):16.[2]李鵬.現代分子生物學技術在醫學檢驗中的應用[J].臨床和實驗醫學雜志,2007,(03):161.[3]楊振華.為21世紀中國檢驗醫學事業崛起而奮斗——寫于本刊更名之際[J].中華檢驗醫學雜志,2000,(01):4.[4]姚均,何忠平,張福杰,等.核酸序列擴增早期診斷人類免疫缺陷病毒感染[J].中華檢驗醫學雜志,2002,(06):42.[5]胡頌恩.分子生物學與檢驗技術[M].北京:人民衛生出版社,2018.[6]武衛杰,冷遠逵,沈夢飛等.基于功能納米材料的液相生物芯片檢測技術[J].化學進展,2019,31(2/3):283-299.[7]徐疏梅.新一代DNA測序技術的應用與研究進展[J].徐州工程學院學報,2018,33(4):60