ICS65.020.30本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由山東省畜牧協會提出并歸口。本文件起草單位:山東省飼料獸藥質量檢驗中心、中國農業大學動物醫學院、齊魯動物保健品有限公司、山東亞奧特乳業有限公司、南京豐頓科技股份有限公司、青島農業大學、濰坊市寒亭區畜牧業發展中心、臨朐縣畜牧業發展中心、寧陽縣畜牧獸醫事業發展服務中心、海陽市動物疫病預防與控制中心、泰安金蘭奶牛養殖有限公司。本文件主要起草人：強莉、魏茂蓮、宋祥彬、李有志、湯文利、章安源、戰余銘、郝智慧、孔梅、趙有臣、李玉軍、崔進、鄒明、王乃建、井偉、寧尚鍇、李寶華、法文靜。本文件是首次發布。2規模化奶牛場乳房炎分級防治技術規程本文件規定了規模化奶牛場乳房炎診斷、分級治療、預防措施、獸藥管理和檔案管理。本文件適應于奶牛養殖場細菌性乳房炎防治。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1450中國荷斯坦牛生產性能測定技術規程NY/T4142動物源細菌抗菌藥物敏感性測試技術規程微量肉湯稀釋法NY/T4144動物源細菌抗菌藥物敏感性測試技術規程紙片擴散法NY5047無公害食品奶牛飼養獸醫防疫準則GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4乳房炎診斷4.1臨床診斷乳房炎按臨床表現分為隱性乳房炎和臨床型乳房炎，臨床型又可分為急性乳房炎、亞急性乳房炎、慢性乳房炎。4.1.1隱性乳房炎乳房和乳汁肉眼觀察無異常，但乳汁理化性質發生變化，乳汁體細胞數增加。4.1.2臨床型乳房炎急性乳房炎，突然發病，乳房發紅、腫脹、變硬、疼痛，乳汁顯著異常和減少，出現全身癥狀。病牛體溫升高，食欲減退，反芻減少，脈搏增速，脫水，全身衰弱、沉郁。3亞急性乳房炎，病牛一般沒有全身癥狀，最明顯的異常是乳汁中有絮片、凝塊，并呈水樣。乳房有輕微發熱、腫脹和疼痛。慢性乳房炎，慢性乳房炎多由長時間持續感染引起，或由于急性乳房炎未及時進行有效治療而轉。長期保持亞臨床型乳房炎，或亞臨床型和臨床型交替出現，臨床癥狀長期存在。4.2實驗室檢測4.2.1體細胞計數體細胞計數檢測參照NY/T1450規定執行。體細胞數與乳房炎判定關系見表1。表1體細胞數值與乳房炎判定關系弱陽性(+)陽性)>500強陽性(+++)4.2.2病原菌分離鑒定按照附錄A執行。4.2.3藥敏實驗微量肉湯稀釋法按照NY/T4142執行。紙片擴散法按照NY/T4144執行。5分級治療5.1治療原則堅持早發現早治療、及時排除炎性物質、局部與全身用藥相結合、選擇敏感藥物、結合中獸藥辨證施治。5.2治療方式45.2.1排毒采取增加擠奶次數等方式，及時排出細菌內毒素和乳區內炎性分泌物。5.2.2抗菌選擇敏感抗生素選擇性治療，可采取乳區灌注、肌肉注射、靜脈注射等一種或者幾種方式聯合用藥，抑制和殺滅病原微生物。5.2.3消炎炎性早期及時使用消炎藥物抑制炎性，也可使用外用藥物外敷患病乳區緩解炎性癥狀。5.2.4解毒伴有內毒素血癥時可以使用大劑量葡萄糖等緩解癥狀。5.2.5營養支持牛只應根據實際情況補充鉀、鈣、鈉等。5.3臨床型乳房炎5.3.1隔離對病牛進行隔離，接觸過的用具及環境徹底消毒。5.3.2急性乳房炎發病乳區先增加擠奶次數，對患病乳區乳汁采樣后進行病原微生物檢測和藥敏實驗，根據實驗結果選擇敏感抗菌藥物。5.3.3亞急性乳房炎乳房灌注奶牛乳房注入劑，1個療程不少于3天，然后結合中獸藥辨證施治。5.3.4慢性乳房炎乳房灌注奶牛乳房注入劑，配伍非甾體抗炎藥和對癥治療，全身給藥。5.3.5牛奶處理病牛奶用專用容器集中銷毀，嚴格執行休藥期和棄奶規定。5.3.6用藥推薦使用的奶牛乳房注入劑見附錄B。5.4隱性乳房炎干乳前10天進行隱性乳房炎監測，對陽性反應在"++"以上的牛及時治療，干乳前3天再監測1次，陰性反應方可停乳。對連續檢測體細胞數呈陽性、乳汁表現異常、產奶量低、反復發作的病牛，進行淘汰。6預防措施56.1牛只管理6.1.1衛生防疫符合NY5047的要求。盡可能保持牛群穩定，減少牛只引進，避免未知病原的感染。6.1.2日常飼喂根據不同飼養階段奶牛的營養需要，制定并實施精準日糧。尤其側重圍產期飼養的順利過渡，減少奶牛代謝性疾病，提高機體抵抗力。6.1.3干奶期免疫及預防需要干奶的牛只應提前妊娠診斷，干奶后應及時標記抗生素牛只，及時分群。在奶牛干奶期根據牧場特點選擇具有針對性的奶牛乳房炎疫苗，并對所有新進入干奶期的奶牛進行隱性乳房炎檢測，陰性奶牛方可進行干奶。干奶后，向每個乳區注入適量的干乳藥。干奶牛飼養密度合理，控制在正常飼養密度的80%，做好日常工作，但不宜劇烈活動。推薦使用的奶牛乳房注入劑見附錄B。6.1.4定期檢查每月至少進行一次隱性乳房炎和體細胞檢測，高體細胞牛只應堅持隔離分群細菌鑒定，篩選淘汰致病菌牛、久治不愈慢性乳房炎牛只。6.1.5選種選擇具有優秀乳房遺傳性能的公牛選配。6.2環境控制6.2.1墊料管理選擇無機墊料如黃沙、橡膠墊、木屑、沼渣等，經常更換新鮮墊料或者翻新晾干。確保牛床清潔，厚度達15cm以上。6.2.2糞便清理每天對牛舍內的牛糞及時清理、杜絕牛糞長時間過多堆積或者堆積至道路或擠奶通道上。噴淋降溫或高濕時期適當增加牛舍的清糞次數。6.2.3消毒及時清理牛床上的牛糞和濕的墊料，牛床上可以撒一層薄石灰。每月按計劃用3%火堿500mL/㎡噴灑牛床、通道和頸架。每兩次堿液，一次過氧乙酸消毒交替消毒。經產高產牛舍、新產牛舍、圍產期牛舍可增加出棚消毒的頻率。6.2.4滅蚊蠅制定年度滅蚊蠅制度，減少蚊蠅叮咬傳播機率。6.3規范擠乳操作66.3.1擠乳前檢查先觀察或觸摸乳房外表是否有紅、腫、熱、痛癥狀或創傷。6.3.2乳房清洗乳房溫水清洗干凈，用一次性紙巾擦干。乳房污染嚴重時，可先用含消毒劑的水清洗。6.3.3乳頭預藥浴選用專用的乳頭藥浴液，對乳頭進行預藥浴，藥液作用時間應保持在20～30秒。6.3.4擠頭把奶把頭2-3把奶擠到專用容器中，檢查牛奶是否有凝塊、絮狀物或呈水樣，牛奶正常的牛方可上機擠奶；異常的，應及時報告獸醫進行治療，單獨擠奶，嚴禁將異常奶混入正常牛奶中。6.3.5上機擠奶上述工作結束后，及時套上擠奶杯組（套杯過程中盡量避免空氣進入杯組中奶牛從進入擠奶廳到套上奶杯的時間應控制在90秒內。擠奶過程中觀察真空穩定情況和擠奶杯組奶流情況，適當調整擠奶杯組的位置。排乳接近結束，先關閉真空，再移走擠奶杯組。嚴禁下壓擠奶機，避免過度擠奶。6.3.6擠奶后藥浴擠奶結束后，應迅速進行乳頭藥浴，停留時間為3～5秒。6.3.7及時飼喂擠奶結束后，應及時飼喂日糧，使其保持站立，保證乳頭導管完全閉合。減少牛只調動、機械故障、粗暴趕牛等任何打亂正常生產秩序帶來的應激。7獸藥管理7.1嚴格使用國家獸藥主管部門批準的獸藥，對所有購進的獸藥產品進行產品合法性等確認登記，確保藥物合法性、安全性、有效性、可追溯性。7.2根據奶牛場奶牛疾病流行特點，依據獸藥產品庫存量對下月獸藥產品進行訂購、驗收、入庫、使用等。7.3嚴格按照獸藥貯存條件保存，定期維護獸藥倉庫，分類擺放整齊，標識清楚，遵循“先進先出、近效先出”原則，進出庫記錄準確清晰，確保有效保存，無過期藥物、破損藥物等。7.4嚴格遵循棄奶期等安全使用規定，針對性用藥。8檔案管理根據農業農村部發布的《畜禽標識與養殖檔案管理辦法》建立奶牛個體病例檔案，及時、正確記錄治療過程，檔案保存不低于3年。7奶牛乳房炎病原菌分離鑒定A.1原理乳房炎常見病原菌在5%綿羊鮮血平板（BHI瓊脂加5%綿羊血）上，37℃的恒溫箱中培養24h～48h可以生長出肉眼可見菌落。奶牛病原菌的PCR鑒定是利用可見菌落的一段DNA為模板，在DNA聚合酶、核苷酸底物和細菌的通用引物共同參與下，將該段DNA擴增至足夠數量，進行結構分析。A.2試劑或材料A.2.1水：GB/T6682，一級。A.2.25%綿羊血瓊脂平板（BHI瓊脂加5%綿羊血）。A.2.3無菌接種環：1μL及10μL。A.2.4腦心浸液肉湯（BHI肉湯）：商品化試劑。A.2.5LB肉湯：商品化試劑。A.2.65%血清。A.2.7微量移液器：0.5μL～1000μL。A.2.8一次性無菌培養皿。A.2.9細菌DNA提取試劑盒。A.2.102xTaqpremix。A.2.11細菌通用引物[27F(5'to3')AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R(5to3')GGTTACCTTGTTACGACTT]：商業合成。A.3儀器設備A.3.1恒溫培養箱：37℃±1℃。A.3.2冰箱:4℃和-20℃或以下。A.3.3分析天平：感量0.1g。A.3.4PCR儀。A.3.5生物安全柜。A.3.6高速離心機：轉速≥10000r/min。A.3.7高壓滅菌鍋。8A.3.8恒溫振蕩培養箱：37℃±1℃。A.4采集樣品先用碘伏擦拭消毒動物乳頭及周邊，棄前3把乳汁，擠取10mL～20mL乳汁于無菌容器，0℃~4℃保存、運輸，不宜超過24h，或-20℃冷凍保存、運輸。A.5實驗步驟A.5.1分離培養將奶樣混勻，用10μL的無菌接種環蘸取奶樣，劃線接種到5%綿羊血瓊脂平板。將平板放在37℃的恒溫箱中培養24h～48h（剩余的奶樣放在4℃冰箱中保存，備用），觀察菌落生長情況及形態特征，并做好記錄。菌落眼觀特征見表2。A.5.2純化用1μL的無菌接種環挑取A2.4中分離的典型單個菌落,接種到相應増菌肉湯中于37℃搖床中增菌培養16h，相應增菌肉湯見表2。隨后用1μL的無菌接種環在血平板上進行劃線培養，將平板放在37℃的恒溫箱中培養24h-48h。若無雜菌生長則認定為一種細菌。挑取純化后單個菌落，備用。表2常見菌眼觀特征及増菌用肉湯BHI肉湯BHI肉湯+5%血清化膿隱秘桿菌培養40h以上才能產生可見的灰白色、圓形、表面光滑隆BHI肉湯+5%血清生長旺盛,菌落為2mm-3mm，灰白色、半透明，光滑濕潤,不溶血，生長極旺盛,菌落為3mm，菌落呈灰白或土黃色,生長旺盛,不見單個菌落,菌苔灰色較薄,呈波浪形蔓延生9A.5.3PCR鑒定A.5.3.1病原菌DNA提取將A.5.2中純化的菌落分別接種于相應的肉湯中，再次増菌培養16h-18h達到對數生長期，取對數生長期的細菌增值菌液1.5mL，根據細菌DNA提取試劑盒說明書提取待檢細菌總DNA。A.5.3.2反應體系以A.5.3.1中提取的細菌總DNA為模板DNA，分別進行細菌基因PCR擴增。每個樣品的50μL反應體系，組成如下：A.5.3.3PCR擴增按照A.5.3.2加樣順序全部加完后，充分混勻，短暫離心，使液體都沉降到PCR管底。設置PCR儀反應程序:第一階段，95℃預變性5min；第二階段95℃30s，55℃30s，72℃