食源性致病菌是引發(fā)公共衛(wèi)生安全事件的重要因素之一，其在食品的制造、銷售、處理和消費等過程中都有傳播的可能性[1]。在食源性致病菌中，大腸埃希氏菌是易導致出血性腹瀉和腸炎的致病菌，O157:H7則是典型的菌屬，該致病菌通常存在于未經(jīng)加工的蔬菜、肉制品中，若攝入被大腸桿菌O157:H7污染的食品，會對人體造成較大傷害[2]，因此需要建立一類適用于現(xiàn)場快速檢測的方法來對食品進行篩查，盡量減少致病菌帶來的危害。大腸桿菌O157:H7的檢測方法有傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、分子生物學檢測、免疫學方法[3]、生物傳感器法和核酸適配體法等。傳統(tǒng)的檢測方法的檢測周期長、對檢測人員經(jīng)驗要求高，免疫學和分子生物學檢測方法的操作復雜、無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求，因此如何在低成本、高效、快速的前提下進行檢測成為亟待解決的問題。本研究制備了一種基于適配體的快速檢測紙基傳感器，用于大腸桿菌O157:H7的檢測。該傳感器有較好的特異性和重復性，可在15min內(nèi)快速檢測出大腸桿菌O157:H7并應用于實際樣品檢測中。1材料與方法1.1材料與試劑硝酸鎵；99.99%六水合硝酸鋅；硝酸鉻；氨水（28wt%）；鹽酸；異丙醇；氫氧化鈉；超純水；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；N-羥基丁二酰亞胺（NHS）；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）；無水乙醇；羥基化聚乙二醇羧酸（HO-PEG12-COOH）；PBS緩沖液（0.01mol·L-1，pH=7.4）；Tris-HCl緩沖液（10mmol·L-1，pH=7.2）；功能化核酸適配體及其互補序列；whatman1號定性濾紙；吸水棉；底板；大腸埃希氏菌O157:H7（ATCC35150）；麥氏比濁管；瓊脂平板。1.2儀器設備CP-225D天平，德國賽多利斯；便攜式pH計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XPDHG-9246A數(shù)顯鼓風干燥箱，上海析譜儀器有限公司；馬弗爐，英國CARBOLITE；DF-101S集熱式磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；MilliqAcademic超純水機，美國密理博公司；KQ-50E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；水熱反應釜，力辰科技；TG-16離心機，上海屹譜；TalosF200透射電子顯微鏡，賽默飛；D8ADVANCEX射線衍射儀，布魯克AXS；RF-6000熒光分光光度計，日本島津公司；Zeta電位分析儀，PALS美國布魯克公司；WFH-204B手提式紫外分析儀，杭州齊威儀器有限公司。1.3實驗方法1.3.1材料合成本文采用一步水熱法[4]合成紅色長余輝納米材料ZnGa2O4:Cr3+，首先用超純水分別配制2mol·L-1硝酸鎵、1mol·L-1硝酸鋅、1mmol·L-1硝酸鉻溶液，再移取1mL硝酸鎵、2mL硝酸鋅、4mL硝酸鉻的水溶液于燒杯中混合均勻，加超純水定容至30mL，定容過程中用氨水調節(jié)溶液pH至9.0。隨后，將混合溶液于室溫攪拌0.5h使其預反應，預反應結束后將溶液轉移到聚四氟乙烯內(nèi)襯反應釜（內(nèi)襯體積50mL）中，封好后將反應釜放入220℃烘箱中（事先預熱），水熱反應約10h。反應結束后，待反應釜自然冷卻到室溫，將產(chǎn)物分散于0.01mol·L-1鹽酸中，充分混合后離心收集，加入過量異丙醇離心洗滌3次，最后用超純水洗滌1次，于真空干燥箱中干燥備用。1.3.2適配體選擇參考文獻[5]合成修飾過的大腸桿菌O157:H7適配體及DNA互補鏈，用以修飾長余輝材料的適配體的5'端均修飾了羧基，3'端修飾了生物素，其余適配體5'端均用生物素進行了修飾，所有適配體和DNA互補鏈均委托上海生工生物工程有限公司合成，所合成的DNA序列見表1。表1適配體或DNA序列表1.3.3適配體功能化材料（1）羥基化修飾。將200mg紅色長余輝納米材料放入5mmol·L-1氫氧化鈉溶液中并超聲分散，在室溫條件下攪拌24h，而后放入離心機中2700r·min-1離心分離5min，將離心產(chǎn)物依次用超純水（自制）洗滌3次，洗滌所得產(chǎn)物于真空干燥箱中，在10-2Pa、50℃條件下干燥6h，收集備用。（2）氨基化修飾。取羥基化的紅色長余輝材料100mg，超聲分散于40mLDMF中，邊磁力攪拌邊向溶液中加入APTES，加入量約為40μL；滴加結束后將其置于80℃下恒溫攪拌12h，2700r·min-1離心3min，分離收集底部沉淀；用DMF洗滌沉淀3次，無水乙醇洗滌2次，最終產(chǎn)物在室溫下真空干燥。（3）適配體功能化長余輝納米探針。通過酰胺縮合反應實現(xiàn)長余輝納米顆粒與核酸適配體的偶聯(lián)。具體方法是將5mg氨基功能化的長余輝納米材料與4nmol的5'端修飾了COOH和3'端修飾了生物素的大腸桿菌O157:H7的適配體1、8nmol的NHS、16nmol的EDC混合于0.01mol·L-1的PBS溶液（pH在7.4左右）中，室溫下避光攪拌。接著將4μmol的HO-PEG12-COOH、8μmol的NHS、16μmol的EDC加入上述溶液中，于室溫下避光攪拌反應8h，3000r·min-1離心5min以分離除去未反應的適配體，將沉淀用10mmol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH=7.2）洗滌3次即可得到適配體功能化的長余輝納米顆粒，再將其置于緩沖溶液中分散存儲備用。（4）材料表征。將長余輝材料粉末置于X射線衍射儀中掃描獲取XRD圖譜，將長余輝材料極少量分散于水溶液中進行超聲，再放入熒光分光光度計測得激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，將固體粉末和水溶液分別放于紫外燈254nm條件下照射，可觀察到熒光現(xiàn)象。將功能化修飾前后的長余輝材料分散于純水中，然后置于Zeta電位分析儀中測得材料的電位變化。1.3.4紙基傳感器的制作將whatman1號定性濾紙裁剪成如圖1所示形狀，濾紙分成同等大小的3份并進行折疊（圖2），用3對圓形超強磁鐵將3層濾紙吸附住進行部分封閉，將折疊好的濾紙放入加熱融化的石蠟液中，浸沒后立刻取出，待冷卻后將濾紙放入烘箱低溫加熱使石蠟均勻滲透到濾紙間隙中。如圖1所示，圓形區(qū)域未被石蠟浸潤的為親水區(qū)，其余已被石蠟浸透的部分為疏水區(qū)。將3mg·mL-1適配體1功能化的長余輝探針固定在第一層的親水區(qū)，4nmol·L-1適配體2固定在第二層的親水區(qū)，7nmol·mL-1適配體1的DNA互補鏈固定在第三層的親水區(qū)，固定結束后將紙基置于37℃烘箱內(nèi)加熱8h，在最后一層底部粘合吸水墊和底板，最后密封干燥保存。檢測原理如下。當溶液中含有大腸桿菌O157:H7時，目標致病菌與功能化的長余輝探針結合進入第二層，第二層的適配體2又與目標致病菌相結合，未結合的長余輝探針則隨著毛細作用進入第三層與適配體1的DNA互補鏈相結合，待反應結束后在紫外燈254nm下照射激發(fā)紙基，則第二層與第三層均有紅色熒光；若溶液中不含目標致病菌，則長余輝探針直接與第三層的適配體1DNA互補相結合，紫外燈激發(fā)后第二層無熒光現(xiàn)象，第三層有紅色熒光。圖1濾紙展開形狀圖圖2濾紙折疊方式圖1.3.5致病菌檢測對購買的標準菌株大腸桿菌O157:H7進行活化，在培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h，用接種環(huán)取適量細菌于透明玻璃管中，搖勻后與麥氏比濁管進行比對，配制成109CFU·mL-1濃度的菌液，而后將菌液稀釋，搖勻后吸取1mL菌液置于培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～48h，用平板計數(shù)法來確定細菌的濃度。將不同濃度的菌液滴加進第一層親水區(qū)，向下滲透一段時間后，用紫外燈照射不同的檢測層以觀察熒光現(xiàn)象確定檢測結果，并將其與無菌水樣品檢測結果進行對照。2結果與分析2.1材料結構表征由圖3可知，將X射線衍射儀所得材料圖譜與標準圖譜JCPDS：86-0415對比可知，所有衍射峰均與標準圖譜相符合，這表明所制備的紅色長余輝納米材料具有典型的ZnGa2O4晶相結構。由圖4可知，納米粒子的平均粒徑為8.6nm，尺寸差別較小，顆粒呈不規(guī)則狀，近圓形，分散性較好。圖3ZnGa2O4:Cr3+長余輝材料的XRD圖譜圖4ZnGa2O4:Cr3+在透射電鏡下的形貌特征圖2.2光學特性表征由圖5可知，合成的紅色長余輝納米材料可在217～298nm的紫外光條件下激發(fā)；由圖6可知，該材料在發(fā)射峰684nm處，處于紅色光區(qū)域。由圖7可知，用手提式紫外分析儀在254nm條件下照射超聲后的長余輝納米粒子溶液，可見溶液呈現(xiàn)明顯的紅色。圖5ZnGa2O4:Cr3+的激發(fā)光譜圖圖6ZnGa2O4:Cr3+的發(fā)射光譜圖圖7紅色長余輝材料固體粉末和水溶液在紫外燈激發(fā)后的余輝現(xiàn)象圖2.3適配體功能化由圖8可知，對長余輝材料（PLNPs）、氨基化的長余輝材料（PLNPs-NH2）、與適配體連接的長余輝材料（PLNPs-適配體1）分別進行ζ電位的測定，氨基功能化后的長余輝材料ζ電位由+6.29mV增加到+10.86mV，而與適配體連接后的ζ電位則減少到-12.93mV，此時納米顆粒帶少量負電荷，證明納米材料適配體功能化成功。圖8長余輝材料功能化修飾前后ζ電位的變化圖2.4菌液驗證將7種不同濃度的菌液分別滴加到紙基傳感器，15min后用紫外燈照射觀察。菌液的濃度依次為7.5×106CFU·mL-1、7.5×105CFU·mL-1、7.5×104CFU·mL-1、7.5×103CFU·mL-1、7.5×102CFU·mL-1、7.5×101CFU·mL-1、0CFU·mL-1，當菌液濃度大于等于7.5×103CFU·mL-1時，傳感器第二層和第三層均能看到明顯的紅色熒光，當菌液濃度小于7.5×103CFU·mL-1時，傳感器第二層無熒光現(xiàn)象，第三層仍有明顯的紅色熒光。這表明此傳感器最小檢出濃度為7.5×103CFU·mL-1。用紙基傳感器對濃度為104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌菌液、7.5×103CFU·mL-1的大腸桿菌O157:H7和104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌的混合液分別進行檢測。由圖9可知，滴加金黃色葡萄球菌菌液的傳感器只有第三層有紅色熒光，而滴加混合菌液的傳感器第二