T/CAS952—2024Qualitycontrolspecificationsforimmdetectionbasedonfluorescentlylabel 2 3 3 3 3 4 4 4 5 5 6 7 7 7 7 7 7 9請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件起草單位：安徽醫科大學第一附屬醫院、遵義醫科大學附屬醫院、中國醫學科學院北京協和醫院、南京大學醫學院附屬鼓樓醫院、浙江大學醫學院附屬第一醫院、空軍軍醫大學基礎醫學京）有限公司、北京大學第一醫院/北京大學泌整合醫學學會/北京檢驗醫學學會、北京中檢體盧佳斌、孫世珺、焦磊、王愛香、李娜、穆紅、馬慧寧、李曉霞、趙林勝、孫琦、戴其全基于熒光標記二抗的免疫組織化學檢測質量控制規范本文件規定了基于熒光標記二抗的免疫組織化學檢測的實驗基本要求、操作程序和質量控制的本文件適用于病理實驗室規范開展熒光標記二抗免疫組織化下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用GB39707醫療廢物處理處置污染CNAS-CL02:2023醫學實驗室質量和利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記在抗體上的顯色物質（熒光素、酶、金屬離子、同位素、色原體）顯色來檢測組織細胞抗原，對其進行定位、定性及半定量的檢測的技2將組織浸入適宜的固定劑，使細胞和組織內的物質盡可能保持在其生活狀態時的形態、結構和將組織蛋白內或蛋白之間因甲醛固定形成的交聯打開，使之恢復到原有空間狀態的過程。常用熒光標記二抗fluorescencelabeledsecondarEDTA-Tris：三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液（EthylenediamineTetraaceticAcid-trishydroxymethylaminomethanFITC：熒光素5-異硫氰酸酯（FluoresceinI空間設置應考慮免疫組織化學染色機、純水儀、電磁爐、蒸汽壓力鍋、恒溫箱、生物顯微鏡等設備安全風險評估，針對生物、化學、放射及物理等危害制定防護性措施及合適化學實驗室的空間和布局應與實驗室活動相匹配，宜設立單獨的免疫組織化學染色區b)機器清潔系統：染色切片達到一定數量時，機器提示系統清潔；d)條碼掃描系統：全自動識別試劑與玻片上的條碼、試劑位，可讀取打印的標簽；g)染色系統：預置染色標準程序，具備a)試劑安全：有毒廢液與無毒廢液區分排放，方4純水儀的制水量和效率應滿足實驗室最大檢測量的需求。純水儀制備的純水在性狀、電導率、實驗室所用熒光生物顯微鏡應符合JB/T5479的要求。d)固定時間根據組織大小，在6h～48h之間，直徑小于2mm的活檢組織固定b)脫水過程應緩慢進行，每種梯度乙醇的作用時間宜設定為60min～120min；d)脫水劑應定期或根據組織數量進行更換，確認達到脫水效果。a)透明程序宜使用二道透明劑，宜根據組織的類型和大小及脫水機的效率5a)透明后的組織應經過2次～3次浸蠟程序，每次時間為30min～90min；b)建議使用熔點為56℃~58℃或58℃~60℃的優質切片石蠟，浸蠟溫度控制在60℃~b)在包埋組織時，應根據所處理組織的類型決定組織的包埋方向；c)應根據烤片溫度確定烤片時間，例如60℃~65℃烤片時間應控制在60min～120min，70℃~80℃烤片時間應控制在30min～60min，不應高溫長時間烤片。b)新鮮組織樣本冷凍切片后應及時固定。固定液應根據實驗具體要求選擇含有丙酮（10min~c)細胞樣本應及時離心后涂片。涂片后及時放入含有丙酮（5min～10min）、甲醛（10min~d)細胞樣本如需要制備成細胞蠟塊，則離心沉淀后用濾紙或滲透性好的紙張包裹，放入10%b)抗原修復（可選擇熱修復方式或酶修復方式）；6h)滴加適量二抗試劑（根據需求選取合適的熒光標記的二抗），37℃避光孵育20min（具）；j)滴加適量DAPI染細胞核，室溫避光孵育（濃度和時間根據DAPI試劑說明書使用），細），染色后切片可在2℃~8℃短期保存一周。如需長期保存，可在-20℃保存12個月，保存期間在使用熒光試劑選擇時，應根據實驗目的和樣品類型選擇合適的熒光試劑。遵循熒光試劑解、濃度選擇、染色時間和觀察分析等使用步驟。注意熒光試劑的保存條件，避免陽光直射和高溫b)抗原表達應在特定部位，且定位清晰準確，而無背景染色；c)組織的前處理不佳導致的抗原異位，此時d)抗體的不同克隆號在不同組織中的定位不同，此時應標注陽性部位某些抗體在不同腫瘤類a)陰性結果的判讀應區分真陰性和假陰性，由于檢測方法靈敏度有高低之注：熒光信號強度與待測標記物蛋白含量有關。建議參考內參細胞的蛋白表達熒光強度達到中b)應區分在出血、壞死、刀痕和邊緣細胞區域出現的非特異性的陽性信號，應結合形態學特c)定性判讀：免疫熒光染色結果判讀過程中，多數染色結果的判讀為定性。染色結果可信的前提下，信號出現在預期部位（分為細胞膜型、細胞質型、細胞核合型四種陽性細胞類型強度可以被觀察到，反之則為陰性；d)半定量判讀：參考組織化學評分（histochemistry），77.1.4應定期對基于熒光標記二抗的IHC檢測中資源要素和b)臨床樣本的檢測應選擇具有注冊證的體外診斷設備，并定d)二抗的選擇應考慮與一抗的種屬匹配，同時二抗標記的熒光基團應與實驗室的熒光生物顯微鏡相匹配；同時標記多個抗原時，既應考慮一抗與二抗的種屬匹配，也應選擇合適e)選擇的熒光標記二抗應與組織無交叉反應，以便最大f)實驗室應按照試劑制造商說明儲存和分裝相關試劑和耗材，并監測相關的環境條件；g)新進抗體應進行抗體性能驗證并填寫抗體驗證質控表，確定抗體效價、組織定位；不同批h)熒光標記的選擇：熒光標記的波長應盡量在肉眼可見范圍內，避免無法過拍照軟件曝光后拍照觀察）造成的判讀失誤。封片時應選用專用的具有防淬滅功i)新進或維修后再次投入臨床使用的設備，以及新貨號或新批次試劑在實施常規臨床檢測之抗原修復的原則：選擇合適的修復液，采用恰當的修復時間和修復溫度，最大程度地暴露抗原8影響熱修復的因素包括修復液的pH值、修復時間和修復溫度，抗原修復應滿足以b)修復液pH值的選擇：常用的修復液包括檸檬酸鹽（CitratepH6.0）、EDTA（pH8.0）、EDTA（pH9.0）和EDTA-Tric)抗原修復時間和修復溫度的設定：應根據試劑說明書選擇合適的抗原修d)酶消化過程與酶的濃度、活性、反應溫度及pH密切相關，實驗室應參考試劑說明書，根據陰性對照和陽性對照確認酶的濃度及活性，探究最佳孵育時間和溫a)對于石蠟包埋樣本，對照組織應與待檢組織采取相同的程序進行固定、b)對照組織應與待檢組織采用相同的檢測流程，如對照組織檢測失敗，那么本次檢測流程視a)基于熒光標記二抗的IHC檢測實驗室應參考國家衛健委病年版）設立免疫熒光染色室間質評合格率（指參加省級及以上病理