2GB/TXXXX.2—XXXX保健食品原料螺旋藻本文件規(guī)定了保健食品用原料螺旋藻的質(zhì)量要求，包括技術(shù)要求、試驗方法、檢驗規(guī)則和標(biāo)志、標(biāo)簽、包裝、運輸、貯存。本文件適用于以鈍頂螺旋藻（Arthrospiraplatensis）或極大螺旋藻（Arthrospiramaxima）經(jīng)人工培養(yǎng)、采收、清洗的藻泥，再經(jīng)干燥及殺菌獲得的干粉狀保健食品用原料螺旋藻的生產(chǎn)、檢驗和銷售。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲運圖示標(biāo)志GB/T601化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備GB/T602化學(xué)試劑雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備GB/T603化學(xué)試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備GB4789.2食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定GB4789.3食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)GB4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗GB4789.7食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗GB4789.10食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗金黃色葡萄球菌檢驗GB4789.15食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)GB5009.3食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定GB5009.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定GB5009.5食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定GB5009.11食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測定GB5009.12食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測定GB5009.15食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測定GB5009.17食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總汞及有機(jī)汞的測定GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB7718食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4技術(shù)要求GB/TXXXX.2—XXXX34.1鑒別取少量樣品于水中，充分震蕩攪拌使藻粉顆粒分散，顯微鏡視野中應(yīng)呈分散、綠色的S形、L形、C形或螺旋形的藻絲體，不得有明顯異物（螺旋藻顯微鑒別參考圖見附錄C圖C.1和圖C.2）。4.2感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1感官要求4.3理化指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標(biāo)4.4微生物指標(biāo)應(yīng)符合表3的規(guī)定。表3微生物指標(biāo)金黃色葡萄球菌≤4采樣a量為25gncmM514.5標(biāo)志性成分指標(biāo)應(yīng)符合表4的規(guī)定。表4標(biāo)志性成分指標(biāo)藻藍(lán)蛋白/%5試驗方法5.1感官要求取適量樣品，置于清潔、干燥的白瓷盤中，在自然光下觀察色澤和狀態(tài)。嗅其氣味，用溫開水漱口，品其滋味。5.2蛋白質(zhì)按GB5009.5規(guī)定的方法測定。5.3水分按GB5009.3中“第一法直接干燥法”測定。5.4總灰分按GB5009.4規(guī)定的方法測定。5.5鉛（以Pb計）按GB5009.12規(guī)定的方法測定。5.6砷（以As計）按GB5009.11規(guī)定的方法測定。5.7汞（以Hg計）按GB5009.17規(guī)定的方法測定。5.8鎘（以Cd計）按GB5009.15規(guī)定的方法測定。5.9菌落總數(shù)5按GB4789.2規(guī)定的方法測定。5.10霉菌和酵母按GB4789.15規(guī)定的方法測定。5.11大腸菌群按GB4789.3中“MPN計數(shù)法”測定。5.12沙門氏菌按GB4789.4規(guī)定的方法測定。5.13金黃色葡萄球菌按GB4789.10規(guī)定的方法測定。5.14副溶血性弧菌按GB4789.7規(guī)定的方法測定。按附錄A中A.2規(guī)定的方法測定。5.16藻藍(lán)蛋白按附錄A中A.3規(guī)定的方法測定。6檢驗規(guī)則6.1組批同一批原料、相同生產(chǎn)工藝、連續(xù)生產(chǎn)或同一班次生產(chǎn)的同一規(guī)格的產(chǎn)品為一批。6.2抽樣6.2.1按表5的規(guī)定隨機(jī)抽取樣本。表5螺旋藻原料抽樣表<5024>10066.2.2將抽取的樣品平均分裝2份置于兩個潔凈、干燥的容器中，密封，注明產(chǎn)品名稱、批號、取樣時間及地點、取樣人姓名等，其中1份供檢測用，另1份封存后保存以備復(fù)查。6.3出廠檢驗6.3.1產(chǎn)品出廠前，應(yīng)按本文件規(guī)定逐批進(jìn)行檢驗。檢驗符合本文件要求后方可出廠。GB/TXXXX.2—XXXX66.3.2出廠檢驗項目為：感官、β-胡蘿卜素含量、藻藍(lán)蛋白含量、蛋白質(zhì)、水分、總灰分。6.4型式檢驗檢驗項目為本文件要求中規(guī)定的全部項目，一般情況下，型式檢驗半年進(jìn)行一次。有下列情況之一時，亦應(yīng)進(jìn)行型式檢驗：a)原輔材料有較大變化時；b)更改關(guān)鍵工藝或設(shè)備時；c)新試制的產(chǎn)品或正常生產(chǎn)的產(chǎn)品停產(chǎn)三個月后，重新恢復(fù)生產(chǎn)時；d)出廠檢驗與上次型式檢驗結(jié)果有較大差異時；e)生產(chǎn)場所發(fā)生變化時；f)國家行政主管機(jī)構(gòu)提出型式檢驗要求時。6.5判定規(guī)則6.5.1所檢驗項目全部合格，判定該批次產(chǎn)品合格。6.5.2檢驗結(jié)果中有任何指標(biāo)不符合本文件規(guī)定時，可自同批產(chǎn)品中重新加倍取樣進(jìn)行復(fù)檢。若復(fù)檢結(jié)果仍不符合本文件規(guī)定,則判定該批產(chǎn)品不合格。微生物指標(biāo)不應(yīng)復(fù)檢。7標(biāo)志、標(biāo)簽、包裝、運輸、貯存7.1標(biāo)志7.1.1標(biāo)簽或說明書中應(yīng)標(biāo)示產(chǎn)品分類。7.1.2包裝儲運圖示標(biāo)志應(yīng)符合GB/T191的要求。7.1標(biāo)簽7.1.1標(biāo)簽標(biāo)示內(nèi)容應(yīng)符合GB7718的要求。7.2包裝7.2.1包裝應(yīng)密封、牢固、防潮、不易破損。7.3運輸7.3.1運輸工具應(yīng)清潔。7.3.2不得與有毒、有害、有腐蝕性和含有異味的物品混裝、混運，應(yīng)避免受潮、受壓、曝曬。裝卸時，應(yīng)輕拿輕放，不得直接鉤扎包裝。7.4貯存7.4.1貯藏在遮蔭、干燥、通風(fēng)的庫房內(nèi)。7.4.2不得與有毒、有害、有腐蝕性和含有異味的物品混放。GB/TXXXX.2—XXXX1（規(guī)范性附錄）螺旋藻標(biāo)志性成分測定方法A.1一般規(guī)定本方法中所用的水，在未注明其他要求時，應(yīng)符合GB/T6682中水的規(guī)格，所用試劑，在未注明其他規(guī)格時，均指分析純。分析中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑及制品，在沒有注明其它要求時，均按GB/T601、GB/T602、GB/T603的規(guī)定制備。A.2.1原理試樣經(jīng)皂化使胡蘿卜素釋放為游離態(tài),用石油醚萃取二氯甲烷定容后,采用反相色譜法分離,外標(biāo)法定量。A.2.2試劑和材料A.2.2.1氫氧化鉀溶液：稱取固體氫氧化鉀500g，加入500mL水溶解，臨用前配制。A.2.2.2無水硫酸鈉（Na2SO4）。A.2.2.3抗壞血酸（C6H8O6）。A.2.2.4石油醚：沸程30℃~60℃。A.2.2.5甲醇（CH4O）：色譜純。A.2.2.6乙腈（C2H3N）：色譜純。A.2.2.7甲基叔丁基醚[CH3OC(CH3)3]：色譜純。A.2.2.8二氯甲烷（CH2Cl2）：色譜純。A.2.2.9無水乙醇（C2H6O）：優(yōu)級純。A.2.2.10碘溶液（I20.5mol/L。A.2.2.112,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（C15H24O，BHT）。A.2.2.12碘乙醇溶液（0.05mol/L）：吸取5mL碘溶液,用乙醇稀釋至50mL，混勻。A.2.2.13β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（C40H56，CAS號：7235-40-7）：純度≥95%。A.2.3儀器和設(shè)備A.2.3.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測器或性能相當(dāng)者。A.2.3.2氮吹儀。A.2.3.3恒溫振蕩水浴箱：控溫精度±1℃。GB/TXXXX.2—XXXX2A.2.3.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。A.2.3.5電子天平：感量1mg和0.1mg。A.2.4色譜參考條件色譜參考條件如下：a）色譜柱：C30柱（粒徑5.0μm，4.6mm×150mm），或等效色譜柱；b）流動相：A相為甲醇乙腈水溶液（甲醇：乙腈：水=73.5:24.5:2，體積比）；B相為甲基叔丁基醚；梯度洗脫程序：見表A.1；c）柱溫：30℃±1℃;d）流速：1.0mL/min；e）進(jìn)樣量：20μL；f）檢測波長：450nm。表A.1梯度洗脫程序000A.2.5標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備A.2.5.1β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500μg/mL準(zhǔn)確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（A.2.2.13）25mg（精確到0.1mg），加入0.125gBHT，用二氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至50mL棕色容量瓶中，加水定容并混勻。A.2.5.2β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間液（100μg/mL）：從β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（A.2.5.1）中準(zhǔn)確移取10.0mL溶液于50mL棕色容量瓶中，加二氯甲烷定容并混勻。A.2.5.3β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)工作液：從β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間液（A.2.5.2）中分別準(zhǔn)確移取0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、10.00mL溶液至6個100mL棕色容量瓶。用二氯甲烷定容至刻度，得到濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、10μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。A.2.5.4異構(gòu)化β-胡蘿卜素溶液：取10mLβ-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（A.2.5.1）于燒杯中，加入20μL碘乙醇溶液，搖勻后于日光下或距離40W日光燈30cm處照射15min，用二氯甲烷稀釋至50mL。搖勻后過0.45μm濾膜，待測。A.2.6試樣溶液的制備A.2.6.1預(yù)處理GB/TXXXX.2—XXXX3精確稱取1g~5g（精確至0.001g）螺旋藻粉，轉(zhuǎn)移至250mL錐形瓶中，加入1g抗壞血酸、75mL無水乙醇，于60℃±1℃水浴振蕩30min。A.2.6.2皂化加入25mL氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞。置于已預(yù)熱至53℃±2℃恒溫振蕩水浴箱中，皂化30min。取出，靜置，冷卻到室溫。A.2.6.3試樣萃取將皂化液轉(zhuǎn)入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，輕輕搖動，排氣，蓋好瓶塞，室溫下振蕩，10min后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入另一分液漏斗中按上述方法進(jìn)行第二次提取。合并有機(jī)相，用水洗至近中性。棄水相，有機(jī)相通過無水硫酸鈉過濾脫水。濾液收入500mL蒸發(fā)瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上40℃±2℃減壓濃縮，近干。用氮氣吹干，用移液管準(zhǔn)確加入5.0mL二氯甲烷，蓋上瓶塞，充分溶解提取物。經(jīng)0.45μm膜過濾后，棄出初始約1mL濾液后收集至進(jìn)樣瓶中，備用。A.2.7測定分別取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間液（100μg/mL）和異構(gòu)化β-胡蘿卜素溶液,按照色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分析。根據(jù)β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間液的色譜圖確認(rèn)全反式β-胡蘿卜素的保留時間；對比β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)中間液和異構(gòu)化β-胡蘿卜素溶液色譜圖中各峰面積變化，以及與全反式β-胡蘿卜素的位置關(guān)系確認(rèn)順式β-胡蘿卜素異構(gòu)體的保留時間：全反式β-胡蘿卜素前較大的色譜峰為13-順式-β-胡蘿卜素，緊鄰全反式β-胡蘿卜素后較大的色譜峰為9-順式-β-胡蘿卜素，13-素，另外可能還有其他較小的順式結(jié)構(gòu)色譜峰，色譜圖見附錄B圖B.1。A.2.7.2全反式β-反胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜純度測定取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)工作液（3μg/mL按照色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)6次。計算全反式β-胡蘿卜素色譜峰的峰面積、全反式與A.2.7.1中各順式結(jié)構(gòu)的峰面積總和。將β-胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜儀中（色譜圖見圖B.1根據(jù)保留時間定性，測在相同色譜條件下，將待測液注入液相色譜儀中，以保留時間定性，根據(jù)峰面積采用外標(biāo)法定量。A.2.8結(jié)果計算標(biāo)準(zhǔn)溶液中全反式β-胡蘿卜素色譜純度（CP）按式（A.1）計算：CP=式中：CP——全反式β-胡蘿卜素色譜純度，單位為%；GB/TXXXX.2—XXXX4Iall-E——全反式阝-胡蘿卜素色譜峰峰面積平均值，單位為峰面積(AU)；Isum——全反式阝-胡蘿卜素及各順式結(jié)構(gòu)峰面積總和平均值，單位為峰面積(AU)。式中:RF——全反式阝-胡蘿卜素響應(yīng)因子，單位為峰面積毫升每微克(AU·mL/μg)；Iall-E——標(biāo)準(zhǔn)工作液中全反式阝-胡蘿卜素色譜峰峰面積平均值，單位為峰面積(AU)；ρ——阝-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)工作液標(biāo)定濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)；CP——同式（A.1）。式中:Xβ——試樣中阝-胡蘿卜素的含量，單位為微克每百克(μg/100g)；Aall-E——試樣待測液中全反式阝-胡蘿卜素峰面積，單位為峰面積(AU)；A9Z——試樣待測液中9-順式-阝-胡蘿卜素的峰面積，單位為峰面積(AU)；A13Z——試樣待測液中13-順式-阝-胡蘿卜素的峰面積，單位為峰面積(AU)；A15Z——試樣待測液中15-順式-阝-胡蘿卜素的峰面積，單位為峰面積(AU)；AxZ——試樣待測液中其他順式阝-胡蘿卜素的峰面積，單位為峰面積(AU)；V——試樣溶液定容體積，單位為毫升(mL)；RF——全反式阝-胡蘿卜素響應(yīng)因子，單位為峰面積毫升每微克(AU·mL/μg)；m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)；100——單位換算系數(shù)。GB/TXXXX.2—XXXX5計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值應(yīng)不超過其算術(shù)平均值的10%。A.3藻藍(lán)蛋白A.3.1原理樣品用磷酸鹽緩沖液溶解,置冰箱中冷凍、融解，使色素蛋白析出，分離后的提取液用分光光度法測定。A.3.2試劑和材料A.3.2.1磷酸鹽緩沖溶液：將0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液與0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液(45:55，體積比)混合，溶液pH值為7.0。A.3.2.2離心管（50mL）。A.3.3儀器和設(shè)備A.3.3.1分光光度計。A.3.3.2超聲波振蕩器。A.3.3.3離心機(jī)（3000r/min）。A.3.3.4低溫冰箱（-20℃)。A.3.3.5電子天平：感量0.1mg。A.3.4分析步驟A.3.4.1試樣溶液制備稱取試樣0.25g~0.5g（精確至0.1mg）。用磷酸鹽緩沖溶液溶解，超聲振蕩5min，定容至250mL，搖勻。將溶液轉(zhuǎn)入250mL廣口塑料瓶，置于-20℃冰箱內(nèi)冷凍12h（或放置過夜）。取出解凍，搖勻。A.3.4.2測定取部分溶液于離心管中，于3000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液，置于1cm比色皿，在分光光度計上分別測定620nm、652nm、562