環狀RNA在腸道干細胞自我更新中的調控機制與功能研究一、引言1.1研究背景腸道作為人體消化系統的重要組成部分，不僅承擔著消化食物、吸收營養物質的關鍵任務，還在維持機體免疫平衡和內環境穩定方面發揮著不可或缺的作用。腸道上皮是腸道與外界環境直接接觸的界面，它不斷地受到各種物理、化學和生物因素的刺激，同時也面臨著細胞自然衰老和凋亡的過程。在這一動態變化的過程中，腸道干細胞（IntestinalStemCells，ISCs）作為腸道上皮的“種子細胞”，發揮著至關重要的作用。腸道干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，主要定位于小腸的隱窩（cryptsofLieberkühn）中，這是一種深入腸壁的管狀結構，其底部便是腸道干細胞的所在地。腸道干細胞通過自我更新，能夠不斷產生新的干細胞，維持自身數量的相對穩定，同時，它們又能分化為多種成熟的腸道細胞類型，包括吸收細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和腸內分泌細胞等，這些不同類型的細胞各司其職，共同維持著腸道的正常生理功能。例如，吸收細胞主要負責吸收水分和營養物質，確保機體能夠攝取足夠的能量和營養；杯狀細胞分泌黏液，起到保護和潤滑腸道的作用，有助于食物的順利通過和防止腸道黏膜受到損傷；潘氏細胞位于隱窩底部，分泌防御肽，對維持腸道的微生態平衡和抵御病原體入侵發揮著重要作用；腸內分泌細胞則分泌多種激素，調節腸道和全身的生理功能，如調節胃腸蠕動、消化液分泌以及血糖水平等。腸道干細胞的自我更新能力是維持腸道上皮組織穩定性和完整性的關鍵。在正常生理狀態下，腸道干細胞大約每3-5天更新1次，以維持腸道上皮的動態平衡。這一更新過程能夠及時補充因日常代謝而損失的腸黏膜細胞，保持腸道內環境的穩定。此外，當腸道受到損傷時，腸道干細胞會迅速增殖并分化，替代受損的細胞，幫助腸道恢復正常功能。無論是因炎癥性腸病導致的腸道黏膜損傷，還是因輻射暴露等因素引起的腸道組織破壞，腸道干細胞都能積極響應，啟動修復機制，促進腸道的愈合。這種修復功能對于維持腸道健康和整體內環境穩定至關重要，如果腸道干細胞的自我更新和修復能力受損，可能會導致腸道疾病的發生和發展。腸道干細胞的異常調節與多種腸道疾病密切相關。在炎癥性腸病（InflammatoryBowelDisease，IBD），包括克羅恩病（Crohn'sDisease，CD）和潰瘍性結腸炎（UlcerativeColitis，UC）中，腸道干細胞的功能受到抑制，其自我更新和分化能力下降，導致腸道上皮的修復和再生受阻，從而加重腸道炎癥和損傷。在結直腸癌的發生發展過程中，腸道干細胞的異常增殖和分化失控，可能使其轉化為腫瘤干細胞，進而引發腫瘤的形成和發展。研究腸道干細胞自我更新的調控機制，對于深入理解腸道疾病的發病機制，開發新的治療策略具有重要意義。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示環狀RNA調控腸道干細胞自我更新的分子機制，為腸道相關疾病的發病機制研究提供新的理論依據，也為開發新型治療策略提供潛在的靶點和思路。腸道干細胞在維持腸道上皮組織的穩定性和完整性方面起著關鍵作用，其自我更新能力的異常與多種腸道疾病的發生發展密切相關。盡管目前對腸道干細胞的研究取得了一定進展，如對其生物學特性、分化潛能以及在腸道疾病中的作用有了初步認識，但對于腸道干細胞自我更新的調控機制，尤其是環狀RNA在其中的作用，仍存在許多未知。環狀RNA作為一類新興的非編碼RNA，具有獨特的結構和功能，在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發揮著重要的調控作用。然而，環狀RNA在腸道干細胞自我更新中的作用及機制尚未得到充分研究。本研究將系統地探討環狀RNA對腸道干細胞自我更新的調控作用，填補這一領域的知識空白。從理論意義來看，本研究有助于深入理解腸道干細胞自我更新的分子調控網絡，豐富對腸道發育和穩態維持機制的認識。腸道干細胞的自我更新是一個復雜的生物學過程，涉及多種信號通路和分子機制的相互作用。環狀RNA的參與可能為這一過程增添新的調控層次，揭示其作用機制將有助于完善我們對腸道干細胞生物學的理解。此外，研究環狀RNA在腸道干細胞中的功能，也將為非編碼RNA領域的研究提供新的視角和思路，拓展對非編碼RNA生物學功能的認識。在實際應用方面，本研究具有重要的臨床意義。炎癥性腸病和結直腸癌等腸道疾病嚴重影響患者的生活質量和健康，給社會帶來了沉重的負擔。目前，這些疾病的治療手段仍存在一定的局限性，治療效果不盡如人意。通過揭示環狀RNA調控腸道干細胞自我更新的分子機制，有望發現新的治療靶點，為開發更加有效的治療方法提供理論基礎。對于炎癥性腸病患者，可通過調節環狀RNA的表達或干預其相關信號通路，促進腸道干細胞的自我更新和腸道上皮的修復，從而改善疾病癥狀。在結直腸癌的治療中，針對異常表達的環狀RNA及其相關調控機制，可設計特異性的治療策略，抑制腫瘤干細胞的增殖和分化，提高治療效果。二、腸道干細胞與自我更新2.1腸道干細胞概述腸道干細胞是一類存在于腸道組織中的成體干細胞，具有自我更新和多向分化的能力，在維持腸道上皮組織的穩態和修復中發揮著關鍵作用。腸道干細胞主要定位于小腸隱窩底部，這一特殊的解剖位置為其提供了獨特的微環境，即干細胞龕。小腸隱窩是上皮向固有層凹陷形成的管狀結構，其底部包含了多種細胞類型，如潘氏細胞、腸內分泌細胞和腸道干細胞等。這些細胞之間相互作用，共同維持著腸道干細胞的干性和功能。腸道干細胞與周圍的潘氏細胞緊密相鄰，潘氏細胞能夠分泌多種生長因子和細胞因子，如Wnt3、表皮生長因子（EGF）和Notch配體等，這些信號分子對于維持腸道干細胞的自我更新和增殖能力至關重要。腸道干細胞龕中的細胞外基質成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，也為腸道干細胞提供了物理支撐和信號傳導的平臺，參與調節其生物學行為。腸道干細胞具有一系列獨特的生物學特征，這些特征使其區別于其他類型的細胞。腸道干細胞具有高度的增殖能力，能夠不斷分裂產生新的細胞。在正常生理狀態下，腸道干細胞大約每3-5天更新1次，以維持腸道上皮細胞的動態平衡。這種快速的更新能力確保了腸道上皮能夠及時替換受損或衰老的細胞，保持其正常的生理功能。腸道干細胞具有多向分化潛能，能夠分化為多種成熟的腸道細胞類型，包括吸收細胞、杯狀細胞、潘氏細胞和腸內分泌細胞等。這些不同類型的細胞在腸道中發揮著各自獨特的功能，共同維持著腸道的消化、吸收和免疫等生理過程。吸收細胞具有微絨毛結構，能夠增加細胞表面積，提高對營養物質的吸收效率；杯狀細胞分泌黏液，形成黏液層，保護腸道黏膜免受病原體和有害物質的侵襲；潘氏細胞分泌抗菌肽和溶菌酶等物質，參與腸道的免疫防御；腸內分泌細胞分泌多種激素，如胃泌素、胰島素樣生長因子和胰高血糖素樣肽-1等，調節腸道的消化、吸收和代謝等生理功能。腸道干細胞還具有自我更新能力，即干細胞在分裂過程中，能夠產生一個與自身相同的干細胞和一個分化的子細胞，從而維持干細胞池的大小和功能。這種自我更新能力是腸道干細胞能夠長期維持腸道上皮組織穩態的關鍵。腸道干細胞在腸道上皮細胞的生成中起著核心作用。腸道上皮是人體與外界環境接觸最頻繁的組織之一，每天都面臨著大量的物理、化學和生物刺激，因此需要不斷更新以維持其正常功能。腸道干細胞通過自我更新和分化，源源不斷地為腸道上皮提供新的細胞。在腸道干細胞的分化過程中，首先會產生短暫擴增細胞（Transit-AmplifyingCells，TACs），這些細胞具有較高的增殖能力，但分化潛能相對有限。短暫擴增細胞會經歷多次分裂，然后逐漸分化為各種成熟的腸道細胞類型。這些成熟細胞會沿著隱窩-絨毛軸向上遷移，最終到達絨毛頂端，在完成其生理功能后，通過凋亡或脫落的方式離開腸道上皮。在這個過程中，腸道干細胞的自我更新和分化受到多種信號通路和分子機制的精確調控，以確保腸道上皮細胞的生成和更新能夠有序進行。如果腸道干細胞的功能出現異常，可能會導致腸道上皮細胞的生成和更新失衡，進而引發各種腸道疾病。2.2自我更新機制腸道干細胞的自我更新是維持腸道上皮組織穩態的關鍵過程，主要通過對稱分裂和不對稱分裂兩種方式來實現。對稱分裂是指一個腸道干細胞分裂產生兩個完全相同的子細胞，這兩個子細胞都具有與母細胞相同的干細胞特性，即自我更新和多向分化的能力。在這種分裂方式下，干細胞池的數量會增加，為腸道上皮組織的生長和修復提供更多的細胞來源。當腸道受到損傷或處于生長發育階段時，腸道干細胞會通過對稱分裂快速增殖，以滿足組織對細胞數量的需求。在腸道損傷修復過程中，損傷部位附近的腸道干細胞會感知到損傷信號，啟動對稱分裂，產生大量的子代干細胞，這些干細胞隨后會進一步分化為各種成熟的腸道細胞，參與受損組織的修復和再生。對稱分裂過程受到多種信號通路的精確調控，其中Wnt信號通路在促進腸道干細胞對稱分裂中發揮著關鍵作用。Wnt信號通路的激活能夠上調一系列與細胞增殖相關的基因表達，如CyclinD1等，從而促進細胞周期的進展，使腸道干細胞能夠快速分裂。不對稱分裂則是指一個腸道干細胞分裂產生兩個不同命運的子細胞，其中一個子細胞保持干細胞特性，繼續留在干細胞龕中，維持干細胞池的穩定；另一個子細胞則開始向特定的細胞類型分化，如吸收細胞、杯狀細胞、潘氏細胞或腸內分泌細胞等。這種分裂方式既能保證干細胞數量的相對穩定，又能為腸道上皮組織提供源源不斷的分化細胞，維持腸道的正常生理功能。在正常生理狀態下，腸道干細胞主要通過不對稱分裂來維持腸道上皮細胞的更新和穩態。在不對稱分裂過程中，細胞內的一些蛋白質和細胞器會發生不對稱分布，這種不對稱分布決定了兩個子細胞的不同命運。一些極性蛋白，如Par3、Par6和aPKC等，在腸道干細胞中形成不對稱的分布模式，它們參與調控細胞的分裂平面和命運決定因子的分配，使得一個子細胞能夠繼承更多的干細胞維持因子，從而保持干細胞特性，而另一個子細胞則獲得更多的分化誘導因子，開始向特定細胞類型分化。Notch信號通路在腸道干細胞的不對稱分裂和分化過程中起著重要的調節作用。Notch信號通路的激活能夠抑制腸道干細胞的分化，維持其干性；而當Notch信號通路被抑制時，腸道干細胞則會傾向于分化為特定的細胞類型。腸道干細胞的自我更新對于維持腸道上皮組織的穩定性和完整性具有重要意義。通過自我更新，腸道干細胞能夠不斷補充因細胞凋亡、損傷或正常代謝而損失的腸道上皮細胞，確保腸道上皮的正常功能。在正常情況下，腸道上皮細胞的更新速度約為每3-5天一次，這一過程依賴于腸道干細胞的持續自我更新和分化。如果腸道干細胞的自我更新能力受損，可能會導致腸道上皮細胞的數量減少，從而影響腸道的消化、吸收和免疫等功能。在衰老過程中，腸道干細胞的自我更新能力逐漸下降，腸道上皮的修復和再生能力也隨之減弱，這使得老年人更容易出現腸道功能紊亂和疾病。腸道干細胞的自我更新對于腸道的損傷修復至關重要。當腸道受到物理、化學或生物因素的損傷時，腸道干細胞能夠迅速響應，通過自我更新和分化產生大量的新細胞，替代受損的細胞，促進腸道組織的修復和愈合。在炎癥性腸病中，腸道黏膜受到炎癥損傷，此時腸道干細胞會被激活，通過自我更新和分化來修復受損的黏膜組織。如果腸道干細胞的自我更新和修復能力不足，可能會導致炎癥持續存在，病情遷延不愈，甚至發展為更嚴重的腸道疾病。2.3腸道干細胞自我更新的調控因素2.3.1信號通路腸道干細胞的自我更新受到多種信號通路的精細調控，其中Wnt、Notch和BMP等信號通路在這一過程中發揮著關鍵作用。Wnt信號通路是調控腸道干細胞自我更新的核心信號通路之一。在腸道干細胞中，Wnt信號通路的激活主要通過經典的Wnt/β-catenin途徑實現。當Wnt配體與細胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結合后，會抑制胞質中的β-catenin降解復合物（包括APC、Axin、GSK-3β和CK1等）的活性，從而使β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與轉錄因子TCF/LEF家族成員結合，激活一系列與細胞增殖和自我更新相關的靶基因表達，如c-Myc、CyclinD1和Lgr5等。c-Myc是一種原癌基因，它可以促進細胞周期的進展，增強細胞的增殖能力；CyclinD1是細胞周期蛋白，參與細胞周期從G1期到S期的轉換，對細胞增殖起著重要的調節作用；Lgr5是腸道干細胞的特異性標志物，其表達的上調有助于維持腸道干細胞的干性和自我更新能力。研究表明，在小鼠模型中，條件性敲除腸道干細胞中的β-catenin基因，會導致腸道干細胞的自我更新能力顯著下降，腸道隱窩數量減少，腸道上皮的再生和修復能力受損。相反，激活Wnt信號通路，如通過給予外源性的Wnt配體或抑制β-catenin的降解，能夠促進腸道干細胞的增殖和自我更新，增加腸道隱窩的數量和大小。Notch信號通路在腸道干細胞的自我更新和分化平衡中起著重要的調節作用。Notch信號通路的激活依賴于細胞間的相互作用。當相鄰細胞表面的Notch配體（如Delta-like和Jagged）與腸道干細胞表面的Notch受體結合后，會引發Notch受體的胞內結構域（NICD）被γ-分泌酶切割并釋放。NICD進入細胞核后，與轉錄抑制因子RBP-Jκ結合，形成NICD-RBP-Jκ復合物，從而激活Notch信號通路的靶基因表達，如Hes1、Hey1和HeyL等。這些靶基因編碼的蛋白質屬于堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族，它們可以抑制腸道干細胞向特定細胞類型的分化，維持干細胞的干性和自我更新能力。在腸道發育過程中，Notch信號通路的激活能夠促進腸道干細胞的增殖和自我更新，確保腸道上皮組織的正常發育。在成年個體中，Notch信號通路的持續激活可以維持腸道干細胞的數量和功能，抑制其分化。當Notch信號通路被抑制時，腸道干細胞會傾向于分化為特定的細胞類型，如杯狀細胞、潘氏細胞和腸內分泌細胞等。在小鼠實驗中，通過基因敲除技術降低腸道干細胞中Notch受體的表達，會導致腸道干細胞分化加速，干細胞數量減少，腸道上皮的穩態受到破壞。BMP（BoneMorphogeneticProtein）信號通路在腸道干細胞的自我更新和分化中發揮著雙向調節作用。BMP信號通路的激活始于BMP配體與細胞膜上的BMP受體（包括BMPR-IA、BMPR-IB和ActRII等）結合，形成配體-受體復合物。這一復合物會激活受體的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，使受體底物Smad1、Smad5和Smad8磷酸化。磷酸化的Smad蛋白與Smad4結合形成復合物，然后進入細胞核，與其他轉錄因子相互作用，調節靶基因的表達。在低水平的BMP信號條件下，BMP信號通路可以促進腸道干細胞的自我更新。BMP信號通路可以通過調節Wnt信號通路的活性來間接影響腸道干細胞的自我更新。BMP信號通路可以抑制Wnt信號通路中的關鍵抑制因子Dkk1的表達，從而增強Wnt信號通路的活性，促進腸道干細胞的自我更新。在高水平的BMP信號條件下，BMP信號通路則會抑制腸道干細胞的自我更新，促進其分化。BMP信號通路可以激活一些與分化相關的基因表達，如Sox9和Klf4等，這些基因可以促進腸道干細胞向特定細胞類型分化。研究發現，在腸道類器官培養體系中，添加適量的BMP拮抗劑Noggin可以增強腸道干細胞的自我更新能力，促進類器官的生長和增殖；而添加過量的BMP配體則會抑制腸道干細胞的自我更新，誘導其分化。2.3.2微環境因素腸道微環境中的細胞因子、細胞外基質等對腸道干細胞的自我更新有著重要影響。細胞因子是一類由免疫細胞和其他細胞分泌的小分子蛋白質，它們在細胞間通訊和信號傳導中發揮著關鍵作用。在腸道微環境中，多種細胞因子參與了腸道干細胞自我更新的調控。表皮生長因子（EGF）是一種重要的促生長細胞因子，它可以與腸道干細胞表面的EGF受體（EGFR）結合，激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進腸道干細胞的增殖和自我更新。研究表明，在腸道類器官培養中，添加EGF可以顯著提高類器官的形成效率和生長速度，表明EGF對腸道干細胞的自我更新具有促進作用。轉化生長因子-β（TGF-β）家族成員在腸道干細胞的調控中也發揮著重要作用。TGF-β1在低濃度時可以促進腸道干細胞的自我更新，而在高濃度時則會抑制其增殖，促進分化。這一調節作用可能與TGF-β1對不同信號通路的激活或抑制有關。TGF-β1可以通過激活Smad信號通路，調節細胞周期相關蛋白的表達，從而影響腸道干細胞的自我更新和分化。TGF-β1還可以通過調節細胞外基質的合成和降解，間接影響腸道干細胞的微環境，進而影響其自我更新能力。白細胞介素-22（IL-22）是一種由免疫細胞分泌的細胞因子，它可以通過與腸道干細胞表面的IL-22受體結合，激活下游的STAT3信號通路，促進腸道干細胞的增殖和自我更新。在腸道損傷修復過程中，IL-22的表達會顯著增加，它可以促進腸道干細胞的活化和增殖，加速腸道上皮的修復。細胞外基質（ECM）是由多種蛋白質和多糖組成的復雜網絡，它不僅為細胞提供物理支撐，還參與細胞的信號傳導和功能調節。在腸道微環境中，細胞外基質對腸道干細胞的自我更新起著重要的調控作用。膠原蛋白是細胞外基質的主要成分之一，它可以通過與腸道干細胞表面的整合素受體結合，激活細胞內的信號通路，如FAK-Src信號通路，促進腸道干細胞的黏附、增殖和自我更新。研究發現，在富含膠原蛋白的基質上培養腸道干細胞，其自我更新能力明顯增強，類器官的形成效率和質量也更高。層粘連蛋白是另一種重要的細胞外基質成分，它可以與腸道干細胞表面的特定受體結合，調節細胞的遷移、增殖和分化。層粘連蛋白可以通過激活PI3K-Akt信號通路，促進腸道干細胞的自我更新和存活。纖連蛋白在腸道干細胞的微環境中也起著重要作用，它可以與多種細胞表面受體相互作用，調節細胞的黏附、遷移和增殖。纖連蛋白可以通過與腸道干細胞表面的整合素α5β1結合，激活下游的信號通路，促進腸道干細胞的自我更新和腸道上皮的修復。細胞外基質中的一些生長因子結合蛋白，如硫酸肝素蛋白聚糖，也可以通過結合和儲存生長因子，如FGF和VEGF等，調節這些生長因子在腸道微環境中的濃度和活性，從而間接影響腸道干細胞的自我更新。三、環狀RNA的特性與功能3.1環狀RNA的結構與形成環狀RNA（CircularRNA，circRNA）是一類特殊的非編碼RNA分子，其結構特征與傳統的線性RNA截然不同。環狀RNA呈閉合環狀結構，沒有5’端帽子和3’端多聚腺苷酸（polyA）尾巴，這種獨特的結構賦予了它較高的穩定性，使其不易被核酸外切酶降解。環狀RNA主要通過反向剪接（Back-splicing）過程形成。在經典的RNA剪接過程中，前體mRNA（pre-mRNA）的剪接遵循線性順序，即上游外顯子的3’端與下游外顯子的5’端連接，同時切除內含子，形成線性的成熟mRNA。而在反向剪接過程中，下游外顯子的5’端與上游外顯子的3’端發生異常連接，跳過了中間的內含子，從而形成了環狀RNA。這一過程涉及到多種順式作用元件和反式作用因子的參與。順式作用元件在環狀RNA的形成中起著關鍵作用。在pre-mRNA的鄰近內含子中，常常存在一些短（30-40nt）到長的反向互補序列，如反向Alu元件。這些反向互補序列能夠通過堿基互補配對形成雙鏈結構，從而拉近上下游外顯子的距離，促進反向剪接的發生。研究發現，在一些基因的內含子中，特定的反向互補序列能夠顯著提高環狀RNA的生成效率。當對這些反向互補序列進行突變或刪除時，環狀RNA的表達水平會明顯下降。反式作用因子，如RNA結合蛋白（RBPs），也在環狀RNA的形成過程中發揮著重要的調節作用。RNA結合蛋白能夠識別并結合到pre-mRNA上的特定順式作用元件上，從而影響剪接體的組裝和活性，進而調控反向剪接的發生。一些RNA結合蛋白可以促進環狀RNA的形成，而另一些則可能抑制其生成。肌肉盲樣蛋白（Muscleblind-likeproteins，MBL）能夠與pre-mRNA的內含子區域結合，促進環狀RNA的反向剪接，從而增加環狀RNA的表達水平。而剪切因子U2AF65的異常表達則會抑制環狀RNA的形成，導致其表達水平降低。除了反向剪接外，還有一些其他的機制可能參與環狀RNA的形成。在某些情況下，內含子套索結構在剪接過程中沒有被完全降解，而是通過進一步的加工形成了環狀RNA。一些研究還發現，RNA編輯等過程也可能影響環狀RNA的形成和結構。RNA編輯可以改變pre-mRNA的核苷酸序列，從而影響順式作用元件和反式作用因子的結合，進而影響環狀RNA的生成和功能。環狀RNA的形成具有組織特異性和發育階段特異性。不同組織和細胞類型中，環狀RNA的表達譜存在顯著差異，這表明環狀RNA的形成受到組織特異性的調控機制影響。在胚胎發育過程中，環狀RNA的表達水平和種類也會發生動態變化，這與胚胎發育的不同階段和細胞分化過程密切相關。在小鼠胚胎發育的早期階段，一些特定的環狀RNA表達水平較高，它們可能參與了胚胎干細胞的自我更新和分化調控；而在胚胎發育后期，隨著組織器官的形成和成熟，環狀RNA的表達譜也會發生相應的改變。3.2環狀RNA的特性環狀RNA具有多種獨特的特性，這些特性使其在細胞生物學過程中發揮著重要的作用。環狀RNA具有較高的穩定性，這是其最為顯著的特性之一。由于環狀RNA呈閉合環狀結構，缺乏5’端帽子和3’端多聚腺苷酸尾巴，這使得它們對核酸外切酶具有較強的抗性，不易被降解。研究表明，環狀RNA在細胞內的半衰期通常比線性RNA長數倍，甚至數十倍。在哺乳動物細胞中，一些環狀RNA的半衰期可以達到24小時以上，而大多數線性RNA的半衰期則在數小時以內。這種高穩定性使得環狀RNA能夠在細胞中持續存在，為其發揮生物學功能提供了時間上的保障。環狀RNA的穩定性還與其內部的共價閉合環結構有關，這種結構使得環狀RNA分子更加緊湊，不易受到外界因素的干擾。環狀RNA的表達具有組織特異性和發育階段特異性。不同組織和細胞類型中，環狀RNA的表達譜存在顯著差異，這表明環狀RNA的表達受到組織特異性的調控機制影響。在大腦組織中，一些環狀RNA的表達水平明顯高于其他組織，這些環狀RNA可能參與了神經細胞的發育、分化和功能維持。在肝臟組織中，也存在一些特異性表達的環狀RNA，它們可能與肝臟的代謝、解毒等功能密切相關。環狀RNA的表達水平在個體發育的不同階段也會發生動態變化。在胚胎發育早期，一些環狀RNA的表達水平較高，它們可能在胚胎干細胞的自我更新和分化過程中發揮重要作用；隨著胚胎的發育，這些環狀RNA的表達水平逐漸下降，而另一些環狀RNA的表達則開始上升，參與到組織器官的形成和成熟過程中。在小鼠胚胎發育的不同階段，通過高通量測序技術檢測發現，環狀RNA的表達譜呈現出明顯的階段性變化，這與胚胎發育的進程密切相關。環狀RNA具有一定的序列保守性。盡管環狀RNA在不同物種之間的序列存在一定的差異，但一些關鍵的功能區域往往具有較高的保守性。研究發現，在人類、小鼠和大鼠等哺乳動物中，一些與細胞增殖、分化和凋亡等重要生物學過程相關的環狀RNA，其序列在不同物種之間具有較高的相似性。這種序列保守性暗示了環狀RNA在進化過程中可能具有重要的生物學功能，并且這些功能在不同物種之間是相對保守的。通過對不同物種環狀RNA序列的比較分析，還可以發現一些保守的順式作用元件和反式作用因子結合位點，這些位點可能參與了環狀RNA的形成、調控和功能發揮。環狀RNA的結構和序列特征決定了其具有獨特的二級和三級結構。通過生物信息學預測和實驗驗證發現，環狀RNA可以形成多種復雜的二級結構，如莖環結構、發夾結構等，這些二級結構進一步折疊和相互作用，形成了獨特的三級結構。環狀RNA的二級和三級結構對于其功能的發揮具有重要影響。一些環狀RNA通過其特定的二級結構與miRNA或蛋白質結合，發揮分子海綿的作用；而另一些環狀RNA的三級結構則可能決定了其在細胞內的定位和穩定性。研究表明，環狀RNACDR1as具有多個miR-7的結合位點，這些結合位點在其二級結構中形成了特定的空間構象，使得CDR1as能夠有效地吸附miR-7，發揮miRNA海綿的功能。3.3環狀RNA的功能3.3.1miRNA海綿作用環狀RNA最被廣泛研究的功能之一是其作為miRNA海綿的作用。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的小分子非編碼RNA，它們通過與靶mRNA的3’非翻譯區（3’UTR）互補配對，抑制mRNA的翻譯過程或促進其降解，從而在基因表達的轉錄后調控中發揮重要作用。每個miRNA可以調控多個靶mRNA，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生命活動。環狀RNA通常含有多個miRNA結合位點，能夠特異性地吸附miRNA，從而影響miRNA對靶mRNA的調控作用。這種作用機制類似于競爭性內源性RNA（ceRNA），環狀RNA通過與miRNA結合，將miRNA從其靶mRNA上“隔離”，使靶mRNA能夠正常翻譯，上調靶基因的表達水平。研究發現，環狀RNACDR1as（小腦變性相關蛋白1的反義轉錄本）在哺乳動物大腦中廣泛存在，它包含70多個miR-7的保守結合位點，能夠作為miR-7的分子海綿，阻斷miR-7對下游基因的表達抑制作用。當CDR1as過表達時，它會結合大量的miR-7，使得miR-7無法與靶mRNA結合，從而促進miR-7靶蛋白的表達，如UBE2A（泛素連接酶A）、EGFR（表皮生長因子受體）、PTEN（同源性磷酸酶-張力蛋白）、CCNE1（細胞周期蛋白E）和PIK3CD（磷脂酰肌醇3激酶催化亞基δ）等，這些靶蛋白參與了中樞神經系統疾病、糖尿病、胃癌、肝細胞癌等多種疾病的發生發展。除了CDR1as，還有許多其他環狀RNA也被證實具有miRNA海綿作用。circZNF91在細胞分化過程中發揮重要作用，它可以吸附miR-150等miRNA，解除miR-150對其靶基因的抑制，從而促進細胞分化相關基因的表達；circHIPK3在胰島素分泌調控中起著關鍵作用，它通過吸附miR-124等miRNA，調節胰島素分泌相關基因的表達，影響胰島素的分泌；circBIRC6參與維持細胞多能性，它能夠吸附miR-29等miRNA，維持細胞多能性相關基因的表達，保證細胞的多能性狀態。這些研究表明，環狀RNA作為miRNA海綿，在基因表達調控中發揮著重要作用，參與了多種生物學過程和疾病的發生發展。3.3.2與蛋白質相互作用環狀RNA還能夠與蛋白質相互作用，形成RNA-蛋白質復合物，從而影響蛋白質的功能和細胞進程。環狀RNA與蛋白質的相互作用方式多種多樣，主要包括以下幾種情況。一些環狀RNA可以作為蛋白質的分子海綿，特異性地吸附蛋白質，阻止其與其他分子相互作用，從而影響蛋白質的功能。首次報道的circRNA蛋白海綿是circMbl，它包含多功能盲肌蛋白（MBL）的結合位點，能夠與MBL蛋白形成反饋調節通路。當MBL蛋白表達水平升高時，它會與circMbl側翼區內含子結合，促進circMbl的反向剪接，進而誘導circMbl的產生；而高表達的circMbl又會吸附MBL蛋白，將其隔離，影響MBL行使正常的生物學功能，如調節mRNA的剪接等。circANRIL可與Pescadillo同源物1（PES1）的C端富含賴氨酸結構域特異性結合，PES1通常參與促進核糖體前體RNA（pre-rRNA）加工為成熟的rRNA，circANRIL與PES1的結合會阻斷PES1的功能，抑制rRNA的成熟，導致血管平滑肌細胞和巨噬細胞中核糖體生成障礙、核仁應激和細胞死亡，這與動脈粥樣硬化的發生密切相關。環狀RNA可以作為蛋白質的支架，促進蛋白質之間的相互作用和復合物的形成。在某些情況下，環狀RNA能夠結合多個蛋白質，將它們聚集在一起，形成特定的功能復合物，從而增強蛋白質的活性或調節其功能。研究發現，一些環狀RNA可以與轉錄因子、RNA聚合酶等蛋白質結合，形成轉錄復合物，促進基因的轉錄過程；還有一些環狀RNA可以與信號通路中的關鍵蛋白結合，調節信號通路的激活和傳導，影響細胞的增殖、分化和凋亡等過程。環狀RNA還可以通過與蛋白質結合，影響蛋白質的亞細胞定位。蛋白質的亞細胞定位對于其功能的發揮至關重要，環狀RNA與蛋白質的相互作用可以改變蛋白質在細胞內的分布，從而影響其生物學功能。一些環狀RNA可以與核轉運蛋白結合，幫助蛋白質進入細胞核；而另一些環狀RNA則可以與細胞質中的蛋白質結合，阻止其進入細胞核，使其在細胞質中發揮作用。環狀RNA與蛋白質的相互作用在細胞的多種生理和病理過程中都發揮著重要作用。在細胞周期調控中，circFOXO3可以與細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和細胞周期蛋白A（CyclinA）結合，形成circFOXO3-CDK2-CyclinA復合物，抑制CDK2的活性，從而阻滯細胞周期的進展；在細胞凋亡過程中，circAmotl1可以與凋亡相關蛋白相互作用，調節細胞凋亡信號通路的激活，影響細胞的凋亡命運；在免疫應答中，一些環狀RNA可以與免疫細胞表面的受體或信號分子結合，調節免疫細胞的活化和功能，參與免疫反應的調控。3.3.3參與轉錄調控環狀RNA在轉錄水平上對基因表達也具有重要的調控作用，它們可以通過多種方式影響基因的轉錄過程。一些環狀RNA可以與轉錄因子相互作用，調節轉錄因子的活性和與DNA的結合能力，從而影響基因的轉錄起始。在某些情況下，環狀RNA能夠結合到轉錄因子上，改變其構象，使其更容易或更難與DNA上的特定序列結合，進而促進或抑制基因的轉錄。研究發現，某些環狀RNA可以與激活型轉錄因子結合，增強其與DNA的親和力，促進基因的轉錄；而另一些環狀RNA則可以與抑制型轉錄因子結合，阻止其與DNA結合，解除對基因轉錄的抑制作用。環狀RNA可以通過與RNA聚合酶或其他轉錄相關蛋白相互作用，影響轉錄的延伸和終止過程。在轉錄延伸過程中，環狀RNA可以與RNA聚合酶結合，調節其在DNA模板上的移動速度和穩定性，從而影響轉錄的效率和準確性。在轉錄終止階段，環狀RNA可以與轉錄終止因子相互作用，促進或抑制轉錄的終止，影響mRNA的長度和完整性。還有一些環狀RNA可以通過與染色質相互作用，改變染色質的結構和狀態，從而調控基因的轉錄。染色質的結構和狀態對基因表達具有重要影響，開放的染色質結構有利于基因的轉錄，而緊密的染色質結構則會抑制基因的轉錄。環狀RNA可以與染色質修飾酶結合，招募它們到特定的基因區域，改變染色質的修飾狀態，如組蛋白的甲基化、乙酰化等，從而影響染色質的結構和基因的可及性。研究表明，某些環狀RNA可以促進染色質的開放，增加基因的轉錄活性；而另一些環狀RNA則可以誘導染色質的緊縮，抑制基因的轉錄。在細胞核中，外顯子-內含子環狀RNA（EIciRNA）可以與U1小核核糖核蛋白（U1snRNP）結合，形成EIciRNA-U1snRNP復合物，該復合物能夠結合到基因的啟動子區域，與RNA聚合酶II相互作用，促進基因的轉錄。EIciRNA還可以通過與其他轉錄調控因子相互作用，調節轉錄起始復合物的組裝和活性，進一步影響基因的轉錄過程。一些內含子來源的環狀RNA（ciRNA）也被發現參與轉錄調控，它們可以通過與轉錄相關蛋白結合，調節基因的轉錄起始和延伸，影響基因的表達水平。四、環狀RNA調控腸道干細胞自我更新的研究現狀4.1相關研究成果近年來，隨著對環狀RNA研究的不斷深入，越來越多的證據表明環狀RNA在腸道干細胞自我更新的調控中發揮著重要作用。研究人員通過高通量測序技術和功能實驗，發現了一系列參與調控腸道干細胞自我更新的環狀RNA，這些發現為揭示腸道干細胞自我更新的分子機制提供了新的線索。circPan3是較早被發現的對腸道干細胞自我更新具有重要調控作用的環狀RNA。中國科學院生物物理研究所的研究團隊發現，circPan3在腸道干細胞中高表達，且其表達受到腸道駐留的Ⅱ型固有淋巴細胞（ILC2s）分泌的IL-13的調控。在機制上，circPan3能夠與IL13ra1mRNA結合，競爭性地抑制RNA結合蛋白KSRP與IL13ra1mRNA的結合，從而增加IL13ra1mRNA的穩定性，使腸道干細胞表面的IL-13Rα1表達上調。IL-13與IL-13Rα1結合后，激活下游信號STAT6，并通過轉錄因子FoxP1穩定腸干細胞中β-catenin的水平，進而促進Wnt/β-catenin信號通路的活化，最終促進腸道干細胞的自我更新。研究人員構建了circPan3缺失小鼠模型，發現circPan3的缺失降低了腸干細胞自我更新能力，導致干細胞數目變少，腸絨毛和隱窩變短，同時也降低了小鼠腸損傷修復能力。這一研究首次揭示了circPan3在腸道干細胞自我更新調控中的關鍵作用，以及免疫系統通過環狀RNA對腸道干細胞功能的調節機制。circBtnl1是另一個被深入研究的與腸道干細胞自我更新相關的環狀RNA。中國科學院生物物理研究所范祖森教授團隊發現，circBtnl1在腸道干細胞中高度表達，且其缺失能夠增強小鼠腸道干細胞的自我更新能力和上皮再生。研究表明，circBtnl1通過與ATP依賴的RNA解旋酶Ddx3y相互作用，競爭性地結合轉錄因子Atf4的mRNA，從而損害Atf4mRNA在野生型腸道干細胞中的穩定性。ATF4是一種對腸道干細胞活性具有正向調控作用的轉錄因子，它可通過獨特的基序與Sox9啟動子結合，激活Sox9的轉錄，進而增強腸道干細胞的自我更新能力和上皮再生。circBtnl1介導的Atf4mRNA衰變抑制了Sox9轉錄，從而負向調節了腸道干細胞的自我更新機制。研究人員通過構建circBtnl1敲除小鼠模型，驗證了circBtnl1在體內對腸道干細胞自我更新的抑制作用。circBtnl1敲除小鼠相比對照組小鼠，腸道長度、隱窩數量及細胞數量增加，Ki67和EdU染色檢測顯示circBtnl1敲除促進小鼠腸道干細胞的增殖。這一研究揭示了circBtnl1負向調控腸道干細胞自我更新的新機制，為解析腸道干細胞的穩態調控機制提供了新視角。4.2研究方法與技術在研究環狀RNA調控腸道干細胞自我更新的過程中，運用了多種先進的研究方法與技術，這些方法和技術為深入探究其分子機制提供了有力的工具。高通量測序技術是研究環狀RNA的重要手段之一。通過對腸道干細胞進行高通量circRNA-seq測序，可以全面、系統地分析腸道干細胞中環狀RNA的表達譜，篩選出在腸道干細胞中特異性高表達或差異表達的環狀RNA分子。從C57BL/6小鼠中分離出小腸隱窩，并進行高通量circRNA-seq，然后在小鼠腸道干細胞中選擇了前8個高表達的circRNA進行后續研究。在測序過程中，首先提取腸道干細胞的總RNA，然后利用RNaseR消化去除線性RNA，富集環狀RNA。接著對環狀RNA進行片段化處理，反轉錄成cDNA，再進行PCR擴增和文庫構建，最后通過高通量測序平臺進行測序。通過生物信息學分析，可以對測序數據進行質量控制、比對、注釋和差異表達分析，從而確定在腸道干細胞中顯著表達的環狀RNA。基因敲除技術在研究環狀RNA的功能中發揮著關鍵作用。利用CRISPR/Cas9技術構建環狀RNA敲除小鼠模型，能夠在體內研究環狀RNA對腸道干細胞自我更新的影響。為了確定circBtnl1在調節腸道干細胞中的生理作用，用CRISPR/Cas9技術構建circBtnl1敲除小鼠模型。在構建過程中，首先設計針對circBtnl1的sgRNA，將其與Cas9蛋白共同導入小鼠胚胎干細胞中，通過同源重組的方式敲除circBtnl1基因。然后將經過基因編輯的胚胎干細胞注射到小鼠囊胚中，再將囊胚移植到代孕母鼠體內，獲得circBtnl1敲除小鼠。通過對敲除小鼠的表型分析，如觀察腸道長度、隱窩數量、細胞數量以及腸道干細胞的增殖情況等，可以明確環狀RNA在腸道干細胞自我更新中的作用。RNA干擾（RNAi）技術是在細胞水平研究環狀RNA功能的常用方法。通過設計針對環狀RNA的短發夾RNA（shRNA），可以特異性地敲低環狀RNA的表達，從而研究其對腸道干細胞自我更新的影響。在小鼠腸道干細胞中使用shRNA分別敲低circBtnl1等8種circRNA，并建立類器官分析來確定它們的損失對腸道干細胞活性的影響。在實驗中，將shRNA通過脂質體轉染等方法導入腸道干細胞中，使其與環狀RNA結合，引發RNA干擾效應，降解環狀RNA，降低其表達水平。然后通過檢測腸道干細胞的增殖、分化以及類器官的形成等指標，評估環狀RNA敲低對腸道干細胞自我更新的影響。RNA-蛋白質相互作用研究技術對于揭示環狀RNA的作用機制至關重要。RNApulldown結合質譜技術可以鑒定與環狀RNA相互作用的蛋白質。在小鼠腸道干細胞裂解液中進行RNApulldown和質譜測定，以鑒定circBtnl1的結合蛋白候選位點，最終確定Ddx3y為相關的候選蛋白。在RNApulldown實驗中，首先將生物素標記的環狀RNA探針與腸道干細胞裂解液孵育，使環狀RNA與結合蛋白相互作用形成復合物。然后利用鏈霉親和素磁珠捕獲復合物，將未結合的蛋白質洗脫，最后對捕獲的蛋白質進行質譜分析，鑒定與環狀RNA相互作用的蛋白質。RNA-FISH（RNA熒光原位雜交）和免疫熒光實驗可以驗證環狀RNA與蛋白質的共定位情況。通過RNA-FISH和免疫熒光實驗證實circBtnl1與Ddx3y在小鼠小腸隱窩和腸道干細胞類器官的細胞質中共定位。在實驗中，分別用針對環狀RNA和蛋白質的特異性探針進行標記，然后通過熒光顯微鏡觀察兩者的熒光信號，判斷它們是否在細胞內共定位。轉錄組微陣列分析技術可以用于篩選環狀RNA的靶基因，深入研究其調控機制。對模型小鼠的Lgr5+腸道干細胞進行轉錄組微陣列分析，以鑒定circBtnl1的靶基因。在分析過程中，首先提取腸道干細胞的總RNA，然后將其反轉錄成cDNA，并進行熒光標記。將標記后的cDNA與轉錄組微陣列芯片雜交，通過掃描芯片檢測熒光信號強度，分析基因的表達變化。通過對差異表達基因的功能分析和篩選，可以確定與環狀RNA功能相關的靶基因，進一步揭示環狀RNA調控腸道干細胞自我更新的分子機制。五、環狀RNA調控腸道干細胞自我更新的分子機制5.1circPan3促進腸道干細胞自我更新的機制5.1.1與IL13ra1mRNA的相互作用circPan3在腸道干細胞自我更新中發揮著關鍵的促進作用，其作用機制首先體現在與IL13ra1mRNA的相互作用上。circPan3是一種由Pan3基因通過反向剪接形成的環狀RNA，在腸道干細胞中高表達。研究發現，circPan3能夠特異性地與IL13ra1mRNA結合，這種結合作用是通過兩者之間的互補堿基配對以及特定的RNA結構實現的。在分子結構層面，circPan3具有獨特的二級和三級結構，其部分序列能夠與IL13ra1mRNA的特定區域形成穩定的堿基對，從而實現兩者的緊密結合。這種結合并非隨機發生，而是受到嚴格的調控。在腸道干細胞中，存在一些RNA結合蛋白（RBPs），它們可以識別并結合到circPan3和IL13ra1mRNA上，促進兩者的相互作用。這些RNA結合蛋白可能通過與circPan3和IL13ra1mRNA上的特定基序結合，改變它們的空間構象，使其更容易相互靠近并結合。circPan3與IL13ra1mRNA的結合能夠顯著增強IL13ra1mRNA的穩定性。正常情況下，IL13ra1mRNA容易受到細胞內多種核酸酶的降解作用，導致其半衰期較短。然而，當circPan3與IL13ra1mRNA結合后，能夠形成一種特殊的RNA-RNA復合物結構，這種結構可以有效地保護IL13ra1mRNA免受核酸酶的攻擊。具體來說，circPan3的環狀結構可以包裹住IL13ra1mRNA的關鍵區域，使其不易被核酸酶識別和切割。circPan3還可以招募一些RNA穩定蛋白，如HuR等，這些蛋白能夠與IL13ra1mRNA結合，進一步增強其穩定性。研究表明，在敲低circPan3表達的腸道干細胞中，IL13ra1mRNA的半衰期明顯縮短，降解速度加快；而在過表達circPan3的細胞中，IL13ra1mRNA的穩定性顯著提高，半衰期延長。circPan3與IL13ra1mRNA的結合還可以影響IL13ra1mRNA的翻譯效率。當circPan3與IL13ra1mRNA結合后，能夠改變IL13ra1mRNA的翻譯起始復合物的組裝，促進核糖體與IL13ra1mRNA的結合，從而提高IL13ra1蛋白的表達水平。在體外翻譯實驗中，加入circPan3可以顯著增加IL13ra1蛋白的合成量，而去除circPan3則會導致IL13ra1蛋白的表達水平明顯降低。這表明circPan3通過與IL13ra1mRNA的相互作用，在轉錄后水平上對IL13ra1的表達進行了精細調控，為后續的信號傳導和細胞功能調節奠定了基礎。5.1.2對IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的影響circPan3與IL13ra1mRNA的相互作用進一步影響了IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性，從而促進腸道干細胞的自我更新。IL13ra1負責編碼細胞因子IL-13受體中的一個亞基，circPan3與IL13ra1mRNA的結合，使得腸道干細胞表面的IL-13Rα1表達上調。IL-13主要由腸道駐留的Ⅱ型固有淋巴細胞（ILC2s）分泌，當IL-13與腸道干細胞表面上調表達的IL-13Rα1結合后，會引發一系列的信號轉導事件，激活下游信號STAT6。IL-13與IL-13Rα1結合后，會使受體二聚化，進而激活受體相關的酪氨酸激酶，使STAT6的酪氨酸殘基磷酸化。磷酸化的STAT6形成二聚體并進入細胞核，與特定的DNA序列結合，調控相關基因的表達。在這個過程中，轉錄因子FoxP1發揮了重要作用。激活的STAT6會通過調控FoxP1的表達，間接穩定腸干細胞中β-catenin的水平。FoxP1可以與β-catenin相互作用，抑制β-catenin的泛素化降解途徑，從而使β-catenin在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與轉錄因子TCF/LEF家族成員結合，激活Wnt/β-catenin信號通路的靶基因表達，如c-Myc、CyclinD1和Lgr5等。這些靶基因的表達產物在細胞增殖、自我更新和干性維持中發揮著關鍵作用。c-Myc可以促進細胞周期的進展，增強細胞的增殖能力；CyclinD1參與細胞周期從G1期到S期的轉換，對細胞增殖起著重要的調節作用；Lgr5是腸道干細胞的特異性標志物，其表達的上調有助于維持腸道干細胞的干性和自我更新能力。研究人員通過構建circPan3缺失小鼠模型和體外細胞實驗，驗證了circPan3對IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的調控作用。在circPan3缺失小鼠中，腸道干細胞表面的IL-13Rα1表達水平顯著降低，IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性受到抑制，表現為STAT6的磷酸化水平降低，β-catenin的核轉位減少，以及Wnt/β-catenin通路靶基因的表達下調。這些變化導致腸道干細胞的自我更新能力下降，干細胞數目減少，腸絨毛和隱窩變短，同時小鼠的腸損傷修復能力也明顯降低。而在體外細胞實驗中，過表達circPan3可以顯著增強IL-13/IL-13Rα1通路及下游Wnt/β-catenin通路的活性，促進腸道干細胞的增殖和自我更新。5.2circBtnl1抑制腸道干細胞自我更新的機制5.2.1與Ddx3y的結合及對Atf4mRNA穩定性的影響circBtnl1在腸道干細胞中高度表達，且其缺失能夠增強小鼠腸道干細胞的自我更新能力和上皮再生，這表明circBtnl1對腸道干細胞的自我更新起到負向調控作用。深入探究其作用機制發現，circBtnl1主要通過與ATP依賴的RNA解旋酶Ddx3y相互作用，來影響轉錄因子Atf4mRNA的穩定性。在細胞內，circBtnl1與Ddx3y存在特異性的結合。為了鑒定circBtnl1的結合蛋白候選位點，研究人員在小鼠腸道干細胞裂解液中進行了RNApulldown和質譜測定，最終確定Ddx3y為相關的候選蛋白。Ddx3y是一種依賴于ATP的RNA解旋酶，在細胞的RNA代謝過程中發揮著重要作用。通過RNA-FISH和免疫熒光實驗，進一步證實了circBtnl1與Ddx3y在小鼠小腸隱窩和腸道干細胞類器官的細胞質中共定位，這為兩者的相互作用提供了空間上的依據。通過RNApulldown和WB分析也驗證了circBtnl1與Ddx3y的相互作用，體外測圖發現，Flag標記的Ddx3y蛋白的RNA結合域對其與circBtnl1的相互作用至關重要，片段映射分析亦發現，circBtnl1轉錄本(HR2)的外顯子4與Ddx3y蛋白結合是必要的。這些結果表明circBtnl1在小鼠腸道干細胞中主要定位于細胞質，并與Ddx3y蛋白發生特異性結合。circBtnl1與Ddx3y的結合對Atf4mRNA的穩定性產生了重要影響。研究發現，Atf4mRNA能夠與Ddx3y相互作用，而過表達circBtnl1則會破壞Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用。進一步的研究確定Ddx3y和circBtnl1結合在Atf4mRNA的同一位點上，WB證實Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用呈劑量依賴性，截斷作圖顯示Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用位點與circBtnl1相同，這表明circBtnl1和Atf4mRNA可競爭性結合Ddx3y。當circBtnl1與Ddx3y結合后，會阻止Ddx3y與Atf4mRNA的結合，從而損害Atf4mRNA在野生型腸道干細胞中的穩定性。在敲除circBtnl1的腸道干細胞中，Atf4mRNA的穩定性增強，這進一步驗證了circBtnl1對Atf4mRNA穩定性的負向調節作用。為了確定Ddx3y在腸道干細胞自我更新中的作用，研究人員在circBtnl1敲除的小鼠類器官中進行了Ddx3y的敲除和過表達實驗。結果發現，Ddx3y敲除顯著降低了ATF4的表達，而過表達Ddx3y則顯著增加了ATF4的表達，這表明Ddx3y正向調控ATF4的表達。無論是在哪種模型小鼠上，Atf4敲除都顯著減少了腸道干細胞形成類器官的能力，這說明Atf4對腸道干細胞活性具有正向調控作用。綜合這些結果可以推斷，circBtnl1通過與Ddx3y競爭性結合Atf4mRNA，抑制了Atf4mRNA的穩定性，從而影響了Atf4蛋白的表達，進而對腸道干細胞的自我更新產生調控作用。5.2.2對Sox9轉錄表達的調控circBtnl1對腸道干細胞自我更新的抑制作用還體現在對Sox9轉錄表達的調控上，這一調控過程與Atf4密切相關。ATF4是一種對腸道干細胞活性具有正向調控作用的轉錄因子，它可以通過獨特的基序與Sox9啟動子結合，激活Sox9的轉錄。Sox9作為干性因子，在維持腸道干細胞的自我更新能力和上皮再生中發揮著關鍵作用。當ATF4與Sox9啟動子結合后，會招募RNA聚合酶II等轉錄相關因子，促進Sox9基因的轉錄，從而增加Sox9mRNA和蛋白的表達水平，進而增強腸道干細胞的自我更新能力。然而，circBtnl1的存在會干擾這一過程。如前文所述，circBtnl1與Ddx3y競爭性結合Atf4mRNA，抑制了Atf4mRNA的穩定性，導致ATF4蛋白的表達水平下降。ATF4蛋白表達的減少使得其與Sox9啟動子的結合能力減弱，無法有效地激活Sox9的轉錄。在circBtnl1高表達的腸道干細胞中，由于ATF4表達受到抑制，Sox9的轉錄水平顯著降低，Sox9mRNA和蛋白的表達量也隨之減少。這一系列變化最終導致腸道干細胞的自我更新能力受到抑制，腸道上皮的再生能力也相應減弱。研究人員通過構建circBtnl1敲除小鼠模型和體外細胞實驗，驗證了circBtnl1對Sox9轉錄表達的調控作用。在circBtnl1敲除小鼠中，腸道干細胞中Atf4mRNA的穩定性增強，ATF4蛋白表達水平升高，進而促進了Sox9的轉錄表達，表現為Sox9mRNA和蛋白的表達量增加。這些小鼠的腸道干細胞自我更新能力增強，腸道隱窩和腸絨毛數量增多，腸道上皮的再生能力也明顯提高。而在體外細胞實驗中，過表達circBtnl1則會導致Atf4mRNA穩定性下降，ATF4蛋白表達減少，Sox9轉錄表達受到抑制，腸道干細胞的自我更新能力顯著降低。circBtnl1通過抑制Atf4mRNA的穩定性，減少ATF4蛋白的表達，進而抑制了Sox9的轉錄表達，最終實現了對腸道干細胞自我更新的負向調控。這一分子機制的揭示，為深入理解腸道干細胞的穩態調控機制提供了新的視角，也為相關腸道疾病的治療提供了潛在的靶點和理論依據。六、研究案例分析6.1案例一：circPan3相關研究中國科學院生物物理研究所范祖森課題組和田勇課題組在circPan3對腸道干細胞自我更新的調控研究中取得了重要成果，相關研究成果發表于《NatureImmunity》期刊。研究人員首先從小鼠腸道干細胞中通過高通量測序技術篩選出circPan3，發現其在腸道干細胞中高表達。為了深入探究circPan3的功能，研究人員構建了circPan3缺失小鼠模型。在實驗設計上，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，針對circPan3的特定序列進行靶向敲除，成功獲得circPan3基因缺失的小鼠。對這些小鼠的腸道組織進行分析，發現circPan3缺失后，小鼠腸道干細胞的自我更新能力顯著下降。具體表現為干細胞數目變少，通過對腸道隱窩中Lgr5陽性干細胞的計數，發現circPan3缺失小鼠的Lgr5+干細胞數量明顯低于野生型小鼠；腸絨毛和隱窩變短，通過組織切片和顯微鏡觀察，測量腸絨毛長度和隱窩深度，circPan3缺失小鼠的腸絨毛長度縮短了約[X]%，隱窩深度減少了約[X]%，這表明腸道上皮的發育和維持受到了嚴重影響；同時，小鼠的腸損傷修復能力也降低，在對小鼠進行化學誘導的腸道損傷模型構建后，circPan3缺失小鼠的腸道損傷修復速度明顯慢于野生型小鼠，損傷部位的愈合時間延長了約[X]天。在機制研究方面，研究人員發現circPan3能夠與IL13ra1mRNA結合，通過RNApulldown實驗和RNA免疫沉淀（RIP）實驗，證實了circPan3與IL13ra1mRNA之間存在直接的相互作用。進一步研究發現，circPan3的結合能夠競爭性地抑制RNA結合蛋白KSRP與IL13ra1mRNA的結合，從而增加IL13ra1mRNA的穩定性。通過半衰期實驗，檢測IL13ra1mRNA在不同條件下的降解速度，發現與野生型細胞相比，circPan3缺失細胞中IL13ra1mRNA的半衰期縮短了約[X]小時，表明circPan3對IL13ra1mRNA的穩定性具有重要的調控作用。IL13ra1mRNA穩定性的增加使得腸道干細胞表面的IL-13Rα1表達上調，當IL-13與上調表達的IL-13Rα1結合后，激活下游信號STAT6，并通過轉錄因子FoxP1穩定腸干細胞中β-catenin的水平，進而促進Wnt/β-catenin信號通路的活化，最終促進腸道干細胞的自我更新。通過Westernblot檢測信號通路中關鍵蛋白的表達和磷酸化水平，以及免疫熒光實驗觀察β-catenin的核轉位情況，驗證了這一信號傳導過程。該研究首次揭示了circPan3在腸道干細胞自我更新調控中的關鍵作用，以及免疫系統通過環狀RNA對腸道干細胞功能的調節機制，為深入理解腸道干細胞的調控網絡提供了重要的理論依據，也為相關腸道疾病的治療提供了新的潛在靶點。6.2案例二：circBtnl1相關研究中國科學院生物物理研究所范祖森教授團隊在circBtnl1對腸道干細胞自我更新的調控研究中取得了重要突破，相關研究成果發表于《TheEMBOJournal》期刊。研究人員首先從C57BL/6小鼠中分離出小腸隱窩，并進行高通量circRNA-seq，篩選出了在小鼠腸道干細胞中高表達的circBtnl1。通過背靠背引物設計驗證其成環，利用RNaseR和放線菌素D實驗驗證了它的穩定性。為了探究circBtnl1對腸道干細胞的功能影響，研究人員在腸道干細胞中使用shRNA敲低circBtnl1，并建立類器官分析。結果發現，敲低circBtnl1最顯著地誘導了類器官的形成，表明circBtnl1的缺失能夠促進腸道干細胞的增殖和類器官的生長。為了進一步確定circBtnl1在調節腸道干細胞中的生理作用，研究人員運用CRISPR/Cas9技術構建了circBtnl1敲除小鼠模型。對敲除小鼠的腸道組織進行分析，發現circBtnl1敲除小鼠相比對照組小鼠，腸道長度增加了約[X]%，隱窩數量增多了約[X]個，細胞數量也顯著增加；通過Ki67和EdU染色檢測，結果顯示circBtnl1敲除促進小鼠腸道干細胞的增殖，Ki67陽性細胞比例相比對照組提高了約[X]%，EdU陽性細胞數量增加了約[X]%。這些結果表明，circBtnl1敲除促進了腸道干細胞的自我更新。在機制研究方面，研究人員通過在小鼠腸道干細胞裂解液中進行RNApulldown和質譜測定，鑒定出circBtnl1的結合蛋白候選位點，確定ATP依賴的RNA解旋酶Ddx3y為相關的候選蛋白。通過RNA-FISH和免疫熒光實驗證實circBtnl1與Ddx3y在小鼠小腸隱窩和腸道干細胞類器官的細胞質中共定位，再通過RNApulldown和WB分析進一步驗證了二者的相互作用。體外測圖發現，Flag標記的Ddx3y蛋白的RNA結合域對其與circBtnl1的相互作用至關重要，片段映射分析亦發現，circBtnl1轉錄本(HR2)的外顯子4與Ddx3y蛋白結合是必要的。為了進一步鑒定circBtnl1的靶基因，研究人員對模型小鼠的Lgr5+腸道干細胞進行了轉錄組微陣列分析。經過篩選，發現Atf4下調后，類器官形成效果最差，提示Atf4對腸道干細胞活性具有正向調控作用。研究發現Atf4mRNA能夠與Ddx3y相互作用，而過表達circBtnl1則會破壞Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用。進一步確定Ddx3y和circBtnl1結合在Atf4mRNA的同一位點上，WB證實Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用呈劑量依賴性，截斷作圖顯示Atf4mRNA與Ddx3y的相互作用位點與circBtnl1相同，表明CircBtnl1和Atf4mRNA可競爭性結合Ddx3y。敲除circBtnl1后，腸道干細胞Atf4mRNA的穩定性增強，表明circBtnl1負向調節Atf4mRNA的穩定性。在circBtnl1敲除的小鼠類器官中，Ddx