生藥活性成分的高通量篩選技術高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術是20世紀80年代后期發展起來的一種藥物篩選新技術。它集計算機控制、自動化操作、高靈敏度檢測、數據結果自動采集和處理于一體，實現了藥物篩選的快速、微量、靈敏和大規律，日篩選量達到數萬甚至數十萬樣品次，是新藥發現技術和方法的一大進步。

傳統的藥物篩選方法是采用藥理學的實驗方法，通過體內、體外的多種實驗方法，評價藥用樣品的藥理活性。但是，由于傳統的藥理實驗方法需要消耗大量樣品，使用大量實驗動物，參加實驗的技術人員具有較熟練的操作技能，而且篩選樣品量有限，勞動強度大，不能適應大量樣品的同時篩選。高通量藥物篩選是在傳統的篩選技術基礎上，應用先進的分子生物學、細胞生物學、計算機、自動化控制等高新技術，建立的一套更適合于藥物篩選的技術體系。

本文試對高通量篩選技術的基本原理及其在生藥活性成分篩選中的應用做一簡單論述。

1．基本原理

高通量藥物篩選技術是將多種技術方法有機結合而形成的新的技術體系，它以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統執行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數據，以計算機對實驗獲得的數據進行分析處理。它的正常開展需要有一個高容量的化合物庫、自動化的操作系統、高靈敏度的檢測系統、高效率的數據處理系統以及高特異性的藥物篩選模型。

1.1化合物樣品庫

高通量篩選是一種利用已有的化合物進行的體外隨機篩選。因此通過高通量藥物篩選發現先導化合物(leadingcompounds)的有效性取決于化合物樣品庫中化合物的數量及其質量。化合物樣品的數量是指不同樣品的數量。化合物樣品的質量主要由化合物結構的多樣性決定的。許多活性反應基團(reactivegroups)使初篩的假陽性大量增加，剔除這些化合物可以提高化合物樣品庫的質量。

化合物樣品主要有人工合成和從天然產物中分離純化兩個來源。

人工合成又可分為常規化學合成和組合化學合成兩種方法。采用常規化學合成的純化合物一直是國外制藥企業建立化合物樣品庫的主要來源。它們通過長年積累的化合物建立化合物樣品庫，通過購買和化合物交流使化合物樣品庫的數量和質量大幅度提高。

組合化學(combinatorialchemistry)的出現為大量增加化合物的數量提供另外一種來源。組合化學的基本原理是采用適當的化學方法，在特定的分子母核上加入不同的基團，在同樣條件下，產生大量的新化合物。這種方法在化合物的結構改造和優化方面已經表現出強大的優勢。但是，由于該方法是基于母核結構的改造，因此產生的大量化合物在結構多樣性方面尚有極大的不足。解決組合化學產物結構多樣性的問題，已經成為化學研究人員的研究課題。

從天然產物中分離出來的化合物，母核結構和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現出來的生物活性在藥物發現中具有人工合成化合物所不能比擬的優勢。因此，增加樣品庫中具結構多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫質量的一個重要途徑。跨國制藥企業為了增加高通量篩選的陽性率，已經或正在尋求助買我國的天然產物單體。

1.2自動操作系統

高通量藥物篩選每天要對數千化臺物樣品進行檢測，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯。自動化操作系統采用微孔板作為反應容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通過條形碼加以標記。自動化操作系統通過光電閱讀器對特定的微孔板上的特定位置進行操作，并將操作結果及相關數據存貯在計算機內，使篩選結果準確，實驗過程快速。

自動化操作系統利用計算機通過操作軟件控制整個實驗過程。操作軟件采用實物圖像代表實驗用具，簡潔明了的圖示代表機器的動作。編程過程簡潔明了，可操作性強。自動化操作系統的工作能力取決于系統的組成都分，根據需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設備以進行相應的工作。

除了實驗步驟的需要以外，自動化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。目前主要有單孔、8孔、96孔、384孔等幾種方式。單孔一般用于對照樣品以及復篩中零散樣品的轉移。96孔、384孔在酶活性檢測以及需同時開始、同時終止反應的篩選模型中是必需的。

自動化操作系統的一個重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應板以及對它們進行轉移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數量取決于堆棧的容量。

由此可見，高通量藥物篩選的自動化操作系統由計算機及其操作軟件、自動化加樣設備、溫孵離心等設備、堆棧4個部分組成。不同的單位可根據主要篩選模型類型、篩選規模選購不同的部分整合成為一個完整的操作系統。

1.3檢測系統

快速、高靈敏度的檢測技術是高通量藥物篩選的關鍵技術之一。在高通量藥物篩選中，檢測系統一般采用液閃計數器、化學發光檢測計數器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。檢測儀器靈敏度的不斷提高，即使對微量樣品的檢測，也可以得到很好的檢測效果。

1.3.1液閃計數放射性同位素廣泛用于受體結合測定、細胞毒性、細胞增殖實驗、藥物代謝示蹤以及基因分析中。由于采用了雙光電倍增管及時間分辨偶合回路(time-resolvedcoincidencecircuit)技術，有效地降低了背景信號的干擾，使測定靈敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析檢測中，背景信號可控制在10cpm左右。

親和閃爍分析(scintil1ationproximityassay，SPA)是一種新的液閃分析法。該方法在細胞表面受體藥物篩選中應用較為普遍。在高通量篩選測定細胞表面受體親合結合作用時，放射配體標記濾過分析技術由于需要進行分離，現已被親合閃爍分析所取代。親合閃爍分析技術通過親合結合，將放射性配基結合到具有受體的閃爍球上，從而產生光子，減少了放射配體標記分析中的游離配基與結合配基的分離過程，使得放射配基分析可完全以自動化的方式進行，適于進行高通量篩選。產生低能量放射粒子的同位素可被用來進行放射性標記，而這種低能量放射粒子在短距離內可被重吸收，以確保只有結合到受體表面的配基才被檢測到。SPA技術被廣泛的應用到激酶、核酸處理酶分析以及受體配體的相互作用分析中。

1.3.2分光光度法為了適應高通量藥物篩選，許多公司都生產了具備計算機接口并能對多孔板進行同時檢測的分光光度計。以MolecularDevice公司的spectra190為例，它采用8條光導纖維同時對8孔進行測定。測定波長以2nm為間隔，可以在190nm一850nm間進行選擇。對未知物質，可在該范圍內進行掃描以確定其特征吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測數據以不同文件格式輸出，可用隨機軟件或通用數據處理軟件進行處理。方便、快速、準確、自動化程度高。分光光度法高靈敏儀器同自動化操作系統的連接，使得基于紫外、可見光譜的高通量藥物篩選模型成為主要模型種類。

1.3.3化學發光檢測化學發光指生色物質在酶促作用下，化學能以光子的形式釋放出來。化學發光根據發光的形式和種類分為輝光型和閃光型發光兩種。輝光型化學發光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等為基礎的發光反應。其發光時間較長且穩定。而以發光蛋白、ATP、熒光素酶等為底物的發光反應則是閃光型發光反應，其發光時間較短。由于時間分辨及偶合回路技術的使用，對于背景的去除更為有效，使得化學發光的檢測靈敏度達到0.1pg數量級。在單孔Erusalimsky等建立了新型細胞凋亡調節物的高通量篩選方法。細胞預先用3Ｈ胸苷標記，與凋亡誘導物孵育后，連續經過兩種玻璃濾器。一個是中性的，捕獲完整的染色質和高分子量ＤＮＡ。另一個裝有DEAE活性基團，捕獲低分子量DNA碎片。通過對濾器上放射性的測量，可以對DNA的破碎情況定量。

1.5.5.3抗腫瘤活性Lu等建立了用高通量“生物活性指紋”篩選抗肺癌藥物的方法，考察受試分子(類維生素Ａ及類維生素Ａ相關分子)對許多不同細胞系的效應特點。檢測指標包括：(1)肺癌細胞生長抑制檢測。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細胞，包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來源。細胞暴露于受試化合物5ｄ后，用標準比色法測定存活細胞百分率。20%生長抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制檢測，用以區分細胞生長抑制作用和細胞殺傷作用。6孔板上加NCI-H292非小細胞肺癌細胞，暴露于受試物一定時間。然后對細胞進行清洗，植于無受試物的培養介質共7d。用結晶紫對細胞染色，考察集落形成情況。(3)凋亡檢測，用ELISA方法測量細胞DNA破碎。(4)轉錄調控檢測，用以考察受試化合物是否有類維生素Ａ受體介導的轉錄抑制作用。方法是將HeLaTK-細胞用73Col-CAT報告基因連同受體的表達載體轉染，與受試物一起培養，用ELISA方法檢測CAT活性。

1.5.5.4G2Roberge等建立了G2期檢查點抑制劑的高通量篩選方法。將MCF-7mp53細胞培養，種在96孔聚苯乙烯組織培養板上。照射使細胞進入G2靜止期，加入受試化合物用ELISA方法檢測核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，從而得到從G2期釋放進入Ｍ期的細胞數量，即抑制G2檢查點程度。

1.5.5.5信號轉導通路Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量篩選方法。構建融合報告基因，轉染細胞，選擇蟲熒光素酶表達能被TGFβ高誘導的克隆。將細胞植于96孔板，與受試化合物孵育后，稀釋并加入Steady-Glo底物測蟲熒光素酶活力，與對照比較，計算相對酶活性增加值。

1.5.5.6細菌蛋白分泌Alksne等建立了以抑制細菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基于SecA-lacZ融合報告基因。SecA是一種自我調控翻譯的蛋白，當細菌蛋白分泌被干擾時，該報告基因被誘導。

1.5.5.7細菌生長Chung等建立了抑制分枝桿菌生長化合物的高通量篩選方法。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結核分枝桿菌，因其具有生長迅速以及非感染性的特點。通過測定細胞攝入放射性標記的尿嘧啶，考察受試化合物對分枝桿菌活力的作用。用96孔板的形式，1d內可以測試數千個樣品。

2．生藥活性成分的高通量篩選

樣品是高通量藥物篩選的物質基礎，樣品庫來源的化學多樣性是決定高通量篩選技術能否成功的關鍵因素之一。前面我們談到，化合物樣品主要有常規化學合成、組合化學合成和從天然產物中分離純化幾個來源。而從天然產物中分離出來的化合物，由于其母核結構和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現出來的生物活性在藥物發現中具有人工合成化合物所不能比擬的優勢。

我國擁有非常豐富的藥材資源，幾十年來，我們應用藥理學手段，對我國的傳統藥物進行了大規模的研究和篩選，取得了巨大成就。但是，僅僅依靠傳統的藥理實驗方法，既耗時，勞動強度又大，還需要使用大量實驗動物，顯然不能適應大量樣品的同時篩選。雖然經過努力，已從生藥中分離、提取、純化出大量化合物，但由于研究手段的落后，使大量分離出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物資源的極大浪費。

因此，將高通量篩選技術應用于生藥的活性成分研究，既是對高通量篩選技術的不斷完善，又是將這一技術應用于中藥現代化研究的有益嘗試。

如何對生藥的活性成分進行高通量篩選呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致，區別主要在于篩選前需要從生藥中將化合物提取出來并進行適當的分離和化學多樣性的評價。相同的就不再贅述，這里主要談一下提取、分離和多樣性評價的問題。

2.1提取由于高通量篩選需要大量的樣品來源，所以常規的提取方法顯然不能滿足這一要求。尋找一個快速、高效、連續、自動化的提取方法顯得迫在眉睫。加速溶劑提取技術是近年來發展起來的一個新的提取技術，在準備好樣品和對提取方法（或程序）進行設定后，自動進樣和自動收集裝置就可以連續對最多24個不同樣品自動完成樣品的提取和提取液的收集，簡單方便。應用這一技術，可以得到大量的生藥的提取物。

2.2分離及化學多樣性評價我們都知道，生藥的化學成分相當復雜，通過提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物，所以篩選前需要對生藥的提取物進行適當的分離。在眾多的分離手段中，制備型HPLC應該是最為理想的，它具有快速、高效、自動化等諸多優點。

分離完成后還需要對分離的物質進行化學多樣性的評價，以提高高通量篩選的效率。以前，這種評價多是基于物種的地理分布、生物學分類、化學分類以及基源等關系，近年來，隨著科技的進步，多種現代化手段開始應用于化學多樣性的評價。其中，色譜-電噴霧質譜聯用（HPLC-ESI-MS）技術在這方面做出了有力的嘗試。首先，它做出成分的離子信號（m/z）對保留時間的平面圖，然后對這些數據進行統計學的相似度評估從而對樣品的多樣性進行定量的評價。接著，三維的HPLC數據被轉換為CDF文件格式并傳輸到UNIX工作站。數據文件中的每一個離子（包括保留時間、質量、離子強度等數據）被定位在一個二維圖譜中，保留時間和質量分占一個軸，離子強度數據儲存在位點中。濾除噪聲以后，離