進出口化妝品中病原菌檢測方法 微滴式數字PCR法 第3部分：銅綠假單胞菌_第1頁
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進出口化妝品中病原菌檢測方法微滴式數字PCR法第3部分：銅綠假單胞菌本文件描述了進出口化妝品中銅綠假單胞菌的微滴式數字PCR檢測方法。本文件適用于進出口化妝品中銅綠假單胞菌的快速檢測。本文件所能達到的檢出限(LODm)為0.50CFU/g(mL)-1.37CFU/g(mL)。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，共最瀝版本(包括所有的修改單)適用于本文件。分析實驗室用水規格和試驗方法實驗室生物安全通用要求實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測化妝品微生物檢驗制樣規范化妝品安全技術規范3術語和定義本文件沒有需要等定的術語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcd)dAPCR:微滴式數字PCR(dropletdigitalPdyineraseChainReaction)PCR:聚合酶鏈式反應(PolymenseChainReaction)16SrRNA:168核糖體RNA(16SribosomalRNA)5方法原理針對銅綠假單胞菌16SrRNA編碼基因的保守序列設計引物、探針。將一定濃度的引物、探針與模板DNA及數字PCR反應預混液混合，配成PCR反應體系。將該數字PCR體系分布到12000個-20000個微滴中。使大部分微滴中模板DNA分子的數量為1或0,然后進行PCR擴增。16SrRNA探針5'端標記VIC熒光基團，3'端標記BHQ1。利用數字PCR系統的檢測通道。可對每個微滴的熒光信號進行采集分析。含有模板DNA的微滴出現熒光信號的增強，形成陽性微滴簇。最終根據陽26.2冰箱：2℃-8℃、-20℃。吸取10mL1:10樣品稀釋液接種到90mLSCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培養箱培養用生理鹽水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理鹽水混懸沉淀，于10000g-12000g離圣4p—DNA濃度，單位為納克每微升(ng/L);A—260nm處的吸光值；N—核酸稀釋倍數。A/4m在1.8~2.0之間，DNA濃度為0.01ng/μL~10ng/pL時，適用ddPCR檢測。9.5.1對照和平行檢測過程中分別設置陽性對照、陰性對照和空白對照。以銅綠假單胞菌標準菌株DNA或含目的片段的DNA作為陽性對照，以非銅綠假單胞菌標準菌株DNA作為陰性對照。用等體積的一級水代替模板DNA作為空白對照。每個待檢樣品提取的DNA溶液進行3個平行ddPCR檢測。9.52反應體系按照表1配制dIPCR反應體系。"一一水一一一9.5.3微滴生成將配制好的ddPCR反應混合液，加人微滴生成裝置加樣孔中，按儀器操作說明生成微滴。將生成的微滴八連管加蓋后，緩慢轉移至PCR儀上。按以下參數進行FCR擴增：95℃30s;94℃10s,57℃30s,40個循環；12℃10min。升降

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