“升級版”雜交瘤篩選平臺任為抗體開發首席科學家北京義翹神州科技股份有限公司-如何加速抗體藥物發現01雜交瘤技術平臺及限制因素CONTENTS02主克隆提基因優勢和案例04公司介紹03雜交瘤測序問題分析和優化雜交瘤技術平臺及限制因素4YYYYYYYYYYYYYYYYYSplenocytesMyelomaHybridomacellsScreeningAmplification&purification雜交瘤抗體開發技術技術路線成熟，成本優勢；電融合技術大幅提升融合效率；上清介入多功能篩選，提高成功率；自主開發鼠單抗數量>26000種700+技術服務項目經驗5雜交瘤案例——IHC診斷原料抗體開發小腸（20×）十二指腸（20×）結腸（20×）陽性組織（部分數據展示）陰性組織（部分數據展示）平滑肌（20×）前列腺癌（20×）平滑肌瘤（20×）抗體經多種組織檢測合格操作流程：多肽免疫5只小鼠，免疫血清進行ELISA效價檢測和IHC篩選（2個陽性組織、1個陰性組織）挑選ELISA及IHC均合格的1只小鼠融合主克隆階段，ELISA&IHC（雙組織）>200株結合陽性，首批73株IHC檢測；挑選12株合格主克隆細胞進行亞克隆篩選。2~3次有限稀釋，ELISA&IHC（多組織）獲得11株ELISA與IHC合格抗體；挑選最優的6株克隆放大生產及抗體純化。抗體質控1株抗體IHC多組織驗證陽性，可作為診斷原料；3株抗體滿足科研試劑要求。6活性蛋白免疫抗體親和力達到E-10級別細胞活性等多功能介入篩選雜交瘤案例——IL15中和抗體開發13株亞克隆細胞穩定株102株主克隆ELISA競爭抑制陽性(抽檢20株，6株細胞活性陽性）重組蛋白（細胞生物活性檢測EC502~8ng/mL）15株亞克隆ELISA競爭陽性40株細胞2~3輪有限稀釋835孔主克隆ELISA結合陽性融合后細胞接種42塊96孔細胞培養板10只小鼠高效價，挑選1只進行融合Balb/c、C57BL/6小鼠各免疫5只7雜交瘤案例——IL15中和抗體開發13株抗體均可抑制細胞，其中11株優于對照抗體抗體親和E-10~E-11MKD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)8.78E-114.15E+053.64E-05KD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)2.29E-103.91E+058.94E-05KD(M)kon(1/Ms)kdis(1/s)2.47E-101.97E+054.88E-05Response(nm)Response(nm)MM03HMM11HMM12HResponse(nm)Positivecontrol8雜交瘤技術的限制因素雜交瘤融合ELISA篩選第一次有限稀釋ELISA篩選第二次有限稀釋ELISA篩選擴增生產10-14天陽性克隆7-10天陽性單克隆7-10天陽性單克隆2-3輪有限稀釋篩選及擴增生產階段：實驗周期長34~44天（有限稀釋20-30天，生產純化14天）克隆丟失風險——20~30%（有限稀釋轉陰率20%）通量限制——人工通量決定工作量大小對于有提基因需求的客戶，需要額外進行提基因表達驗證雜交瘤測序問題分析和優化10雜交瘤抗體基因測序服務流程交付周期：5天交付抗體序列多種選擇：多種屬（小鼠、大鼠、兔等）、多亞型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM等）、可變區或全長抗體測序準確性高：可排除假基因，成功率100%一站服務：可提供從抗原生產—抗體制備—雜交瘤細胞抗體基因測序—抗體表達驗證等一站式服務11—mAbs,2018,VOL.10,NO.4,539–546沒有目的條帶；可變區含有終止密碼子；得到多于一條輕鏈或重鏈序列，非特異擴增。導致的結果無表達；不結合，或產生非特異性結合；有效結合靶點的抗體數目比預計要少，造成抗體表觀結合較差；多種組合嘗試，工作量加大。雜交瘤抗體提基因異常結果12雜交瘤抗體提基因問題分析B細胞或骨髓瘤細胞的等位基因重排；染色體的丟失復制導致異倍體產生；額外mRNA轉錄本產生；—mAbs,2018,VOL.10,NO.4,539–546一個骨髓瘤細胞與多個脾細胞融合；污染；融合后重排和突變。13雜交瘤輕鏈雙帶實驗驗證重新有限稀釋無改善：排除多克隆影響雜交瘤MM02首輪生產雜交瘤MM02再次有限稀釋后生產重新生產無改善：排除生產及純化問題雜交瘤MM01首輪生產文獻參考：約28.6%雜交瘤含多條輕鏈—mAbs,2018,VOL.10,NO.4,539–546雜交瘤MM01二輪生產14雜交瘤提基因實驗優化細胞株方法1方法2方法3序列數ELISA序列數序列ELISAMM01不表達1L結合1同結合序列——MM02不結合2L結合1同結合序列——MM03不表達2L結合1同結合序列——MM04不表達4L結合1同結合序列——MM05不表達2L結合1同結合序列——MM06不表達5L結合1同結合序列——MM07不表達4L結合1同結合序列——MM08不表達6L結合1同結合序列——MM09不表達1L結合1同結合序列——MM10不表達5L結合1同結合序列——MM11提前終止6L結合1同結合序列——MM12提前終止2L結合1同結合序列——MM13提前終止3L結合1同結合序列——MM14提前終止1L結合1同結合序列——MM15提前終止1L結合1同結合序列——MM16提前終止3L結合1同結合序列——MM17不結合2L結合1同結合序列——MM18不結合1L結合1同結合序列——MM19(支原體污染)提取失敗3L不結合1新序列結合MM20(支原體污染)提取失敗2H不結合1新序列結合MM21(支原體污染)提取失敗4L不表達1新序列結合MM22提取失敗2L不結合1新序列結合MM23(培養不成功)提取失敗1L不表達1更換信號肽表達結合MM24提取失敗1L結合1同結合序列——MM25提取失敗1L不結合1新序列結合MM26提取失敗1L結合1同結合序列——MM27(生產困難)不結合——1新序列結合MM28提取失敗2L不結合1新序列結合MM29提取失敗1L結合1同結合序列——抗體不表達；抗體不結合；序列提前終止；支原體污染；產量低；培養不成功。主克隆提基因優勢和案例16雜交瘤融合&主克隆篩選陽性克隆有限稀釋提基因質控交付：細胞株、抗體、序列亞克隆篩選表達純化生產純化周期節省20-30天技術路線比較20-30天14天7天7天新路線傳統路線17兩種上清ELISA檢測對比主克隆上清和重組表達上清弱陽性和陽性趨勢基本完全一致，提出的基因均是正確序列ELISAOD（蛋白0.1ug/ml包被）ELISA樣品編號18主克隆流式結果純化抗體流式結果FACS檢測結果對比亞克隆流式轉陰，主克隆提基因與主克隆流式結果一致19成藥靶點主克隆提基因細胞結合競爭檢測純化抗體細胞結合和競爭檢測與主克隆上清檢測結果一致20周期更短直接交付序列通量更高成功率更高比原有雜交瘤周期節省20-30天提基因替代有限稀釋，一次提取上百個克隆省去雜交瘤篩選后再提基因步驟，避免基因傳代丟失、污染等風險挽救亞克隆轉陰或與主克隆結果不一致的細胞克隆雜交瘤主克隆提基因優勢更好面向工業客戶藥篩客戶公司介紹22堅持自主研發生產打造中國生命科學研究“一站式”試劑與服務支撐平臺人才與設施榮譽資質設施：

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