光分析儀器分析儀器-熒光光譜儀主要內容1.1紫外－可見分光光度計（自學）1.2熒光光譜儀（8學時）1.3紅外光譜儀（自學）1.4激光拉曼光譜儀（2學時）

分析儀器-熒光光譜儀熒光光譜儀Spectrophotofluorimetry分析儀器-熒光光譜儀一、熒光的發現二、熒光與熒光光譜三、熒光光譜儀及主要譜參量四、熒光生色團的結構特點五、影響熒光測量的因素六、熒光技術在生物學、醫學研究中的應用主要內容分析儀器-熒光光譜儀一熒光的發現16世紀：在礦物和植物提取液中發現熒光；

1575年：紀西班牙的內科醫生和植物學家Monardes——植物愈創木切片黃色水溶液——天蘭色熒光；

1852年：Stokes闡明熒光發射機制(分光計觀測奎寧和葉綠素的熒光，發現波長稍長于入

射光的波長——認識到熒光為“重新發光”而不是漫射光；

1905年：Wood發現氣體分子的共振熒光；

1926年：Gaviola直接測定了熒光壽命；

1923年：熒光X射線光譜；

1964年：原子熒光光譜分析的建立；

1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應用。

分析儀器-熒光光譜儀（一）熒光的產生（二）熒光光譜與吸收光譜二熒光與熒光光譜分析儀器-熒光光譜儀（一）熒光的產生1分子的能量狀態在光學分析中涉及的分子能量有：

Eo=Ee+Ev+ErEe：價電子運動能,electronEv：原子在平衡位置附近的振動,vibrationEr：分子繞其重心的轉動能,rotation

其中，

Ee>

Ev>

Er分析儀器-熒光光譜儀基態：電子自旋配對，多重度=2s+1=1，為單重態，以S0表示。激發單重態：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，為單重態，稱為激發單重態，以S1，S2…表示激發三重態：分子吸收能量，電子自旋不再配對，為三重態，稱為激發三重態，以T1，T2….表示。三重態能級低于單重態（Hund規則）分析儀器-熒光光譜儀2.去活化過程（Deactivation）

處于激發態分子不穩定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態。這些過程包括：1）振動弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發態的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。2）內轉換（InternalConversion，IC）對于具有相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動耦合產生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。分析儀器-熒光光譜儀3）外轉換（ExternalConversion，EC）受激分子與溶劑或其它分子相互作用發生能量轉換而使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。4）系間跨躍（IntersystemConversion，ISC）系間跨躍是發生在兩個不同多重態之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當不同多重態的兩個電子能層有較大重疊時，處于這兩個能層上的受激電子的自旋方向發生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。分析儀器-熒光光譜儀

5）熒光發射分子電子從單重激發態（Kasha規則）的最低振動能級在很短時間（10-9-10-6s）躍遷到基態各振動能層時所產生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發能量低，或者說，熒光波長大于激發波長（Stokes效應）。6）磷光發射從單重態到三重態分子間發生系間跨躍躍遷后，再經振動弛豫回到三重態最低振動能層，最后，在10-4-10s內躍遷到基態的各振動能層所產生的輻射。分析儀器-熒光光譜儀（二）熒光光譜與吸收光譜分析儀器-熒光光譜儀熒光分光光度術：

又稱熒光光譜術，屬于光譜技術中的一種發射光譜術。其原理是電磁波和物質作用后，物質首先吸收電磁波的能量，然后再重新發射電磁波。激發波段在100-800nm之間，相當于紫外與可見光波段。分析儀器-熒光光譜儀（一）熒光光譜儀（二）熒光分光光度術中的參量三熒光光譜儀與主要參量分析儀器-熒光光譜儀（一）熒光光譜儀吸收光譜儀光路圖熒光光譜儀光路圖分析儀器-熒光光譜儀氫燈的能量分布氘燈的能量分布氙燈（紅線）和帶有玻璃外套的汞燈的能量分布1激發光源在紫外-可見光區，可供熒光激發用的光源很多包括：鎢燈，碘鎢燈，氫燈，氘燈，汞燈，氙燈等。主要根據光源穩定性和強度選擇光源。分析儀器-熒光光譜儀實踐中常不選用強光源：隨著光強的增加，會同時導致散射光和熱量的增多強光源照射，容易使樣品產生光化分解強光源需要的穩壓穩流裝置復雜而昂貴產生大量臭氧，損害健康分析儀器-熒光光譜儀對于光源要注意以下幾點:（1）正負極不要接錯。（2）拿燈時，不要碰窗口，以免手上的油污經紫外照射后，難以清除。應及時用無水乙醇擦干凈。（3）燈有壽命，要節約使用。（4）啟動間隔一般要大于半小時，待燈冷卻后，在重新啟動。啟動后要預熱半小時。（5）不要用眼睛直視燈。分析儀器-熒光光譜儀2樣品池在可見可用玻璃池，但紫外區一定要用石英池。（1）設置空白對照。

（2）清洗問題，關鍵是即時沖洗。自來水沖洗SDS浸泡雙蒸水沖洗濃硝酸處理雙蒸水沖洗分析儀器-熒光光譜儀（二）熒光分光光度術中的參量ex—Maximumexcitationwavelength

em,max—Maximumemissionwavelength分析儀器-熒光光譜儀激發光譜與發射光譜的關系i）波長比較與激發（或吸收）波長相比，熒光發射波長更長，即產生所謂Stokes位移。（振動弛豫失活所致）ii）形狀比較熒光光譜形狀與激發波長無關。盡管分子受激后可到達不同能層的激發態，但由于去活化（內轉換和振動弛豫）到第一電子激發態的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達第一激發態一樣。換句話說，不管激發波長如何，電子都是從第一電子激發態的最低振動能層躍遷到基態的各個振動能層。分析儀器-熒光光譜儀iii）鏡像對稱通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關系。分析儀器-熒光光譜儀解釋1：能層結構相似性熒光為第一電子激發單重態的最低振動能層躍遷到基態的各個振動能層而形成，即其形狀與基態振動能級分布有關。吸收光譜是由基態最低振動能層躍遷到第一電子激發單重態的各個振動能層而形成，即其形狀與第一電子激發單重態的振動能級分布有關。由于激發態和基態的振動能層分布具有相似性，因而呈鏡像對稱。S1S0分析儀器-熒光光譜儀解釋2：位能曲線（Frank-Condon原理）

由于電子吸收躍遷速率極快（10-15s），此時核的相對位置可視為不變（核較重）。當兩個能層間吸收躍遷的幾率越大，其相反躍遷的幾率也越大，即產生的光譜呈鏡像對稱。分析儀器-熒光光譜儀A熒光強度的定義：在一定激發波長(λex)作用下，發射的熒光強弱。

F=Ia

Ia=I0-I，I=I010-εcL

F=

I0(1-10-εcL){當C很低時F=

I0εcL，

{當C較大時F=I0

B

=發射光子數/吸收光子數

2熒光強度（fluorescenceintensity,F,I）與量子產率（quantumyield,

）（二）熒光分光光度術中的參量分析儀器-熒光光譜儀熒光強度與濃度的關系分析儀器-熒光光譜儀熒光偏振(fluorescencepolarization)（二）熒光分光光度術中的參量自然光部分偏振光偏振光分析儀器-熒光光譜儀I//-I

I//+I

P=I//-I

I//+2I

A=熒光偏振度Fluorescencepolarization--p

熒光各向異性Fluorescenceanisotropy--A分析儀器-熒光光譜儀(1)熒光偏振度的物理意義：A：I//=I

，P=0，自然光，熒光分子運動很快，取向隨機。（稀溶液）B：I//或I

為0，P=±1偏振光，熒光分子運動很慢，取向有序。C：I//

I

0，0<P<1，生物大分子的熒光屬于這種情況。分析儀器-熒光光譜儀(2)環境因素及分子運動對熒光偏振度的影響

A.溫度的影響：溶液粘度

A：溫度的影響溫度升高，P降低

B：溶液粘度粘度升高，P升高C：分子的運動—轉動旋轉弛豫時間rotationalrelaxationtime—

分析儀器-熒光光譜儀（二）熒光分光光度術中的參量4熒光壽命（Fluorescenceliftime--

）熒光衰減為原來激發時最大熒光強度的1/e所需要的時間I=I0e-kt,=1/k

分子所處的環境有無淬滅有無能量轉移有無分子間相互作用影響因素分析儀器-熒光光譜儀熒光壽命除去激發光源后熒光衰減為原來激發時最大熒光強度的1/e所需要的時間。熒光分子吸收能量后其基態電子被激發到單線激發態后由第一單線激發態（總自旋S=0,兩個電子自旋相反，M=2S+1=0)最低振動能級回到基態任一振動能級時發射的光。4.1、熒光壽命分析儀器-熒光光譜儀

基于熒光壽命測量的熒光猝滅技術研究猝滅劑與熒光標記物靠近的難易，研究標記物所處的微環境。時間分辨熒光光譜用來研究激發態分子間相互作用，非輻射能量轉移及時間分辨熒光各向異性主要熒光技術都離不開熒光壽命的測定。分析儀器-熒光光譜儀1821，首次記錄了熒光現象。1852，Stokes，窐寧、葉綠素，熒光是吸收后的發射光不是漫反射，猝滅現象。1867，Goppelsorder首次熒光分析，鋁-桑色素配合物進行鋁的測定。19世紀末合成了一些有機染料，認識了熒光素、署紅、多環芳烴600多種熒光物質。4.2、熒光壽命的發展歷史分析儀器-熒光光譜儀光速的測定及磷光計的發明，測定時間間隔0.0001s,不能測定熒光。Kerrcell(克爾盒）和熒光壽命的測定。時間間隔0.00000001s(熒光壽命通常在納秒級）。電子快門，前后放置偏振濾光鏡，不加電壓光線不通過，加電壓后，分子有序允許光線通過。分析儀器-熒光光譜儀分析儀器-熒光光譜儀分析儀器-熒光光譜儀4.3、熒光壽命測定方法1、時域法用超短光脈沖(1-2ns)激發樣品，測量樣品在激發后熒光強度的衰減將規律，根據樣品中各點的熒光強度衰減曲線來擬合分析熒光壽命值。2、頻域法用強度按正弦規律調制的激光激發樣品，熒光強度按正弦調制，兩者頻率相同，通過激光相對與熒光的相位差及解調系數來測定熒光壽命。3、時間分辨熒光各向異性。4、多光子激發。分析儀器-熒光光譜儀5熒光探針具有環狀共軛雙鍵即π電子系統量子產率隨環境變化，而且變化很大(3)能產生穩定熒光的小分子藻膽蛋白phycobiliprotein

綠色熒光蛋白GreenFluorescentProtein(4)與研究對象的特定基團共價結合或與蛋白質非共價結合分析儀器-熒光光譜儀熒光成像在醫學上有很長的發展歷史。只有兩種熒光基團被美國食品和藥物管理局（FDA）認可，應用于醫學領域，分別是吲哚花青綠（IGG）和熒光素。熒光素已經有三十年的應用史，最初是應用于眼科；吲哚花青綠已經被用作眼科劑，并且作為肝功能劑有五十年的歷史。

熒光探針在醫學成像中的發展歷史分析儀器-熒光光譜儀第三種熒光基團是羅丹明B，1966年得到認可并應用，但是在1987年因為和小鼠癌癥有關而被禁止使用。這兩種藥物主要用于獲得視網膜血管造影。要求相當高劑量。（熒光素和吲哚花青綠的單人劑量分別為500和40毫克）雖然會發生過敏反應之類的副作用，但是特殊的器官毒性還沒有被報道。分析儀器-熒光光譜儀熒光探針用于醫學成像的一般要求用于醫學成像的分子探針有以下要求：波長亮度生物和光穩定性藥物動力學分析儀器-熒光光譜儀5.1波長熒光基團需要激發光才可以發射光。紫外區的激發光能引起組織損傷，近紅外區的激發光能給組織加熱。藍色和綠色激發光組織穿透性很差，使他們只能在表面組織或小的動物組織中成像。黃光或紅光區（大約600nm），這些波長會有過量的熒光出現，因為有自動生成的內源性熒光。分析儀器-熒光光譜儀5.1

波長較低波長的激發光不能穿透組織產生散射光，所以即使散射波長在理論成像上是合適的，激發光也不能穿透較深組織。激發光和散射光理想波長在650-900nm。在這個波程內，吸收和自發熒光都是最小的，所以光穿透是最大的

。分析儀器-熒光光譜儀5.2亮度

選擇熒光基團需考慮的第二個因素是亮度。越明亮的試劑，穿透能力越強。但是，亮度的增加通常會導致探針尺寸的增長。例如，用于基因編碼的綠色熒光蛋白基團在深層的可視化活體成像中是非常明亮的，但它非常大，有25-50kDa，難于連接，使得它對許多應用是不切實際的。量子點也是非常明亮的，但是由于較大的尺寸而難于接上目標。其組成部分，例如硒和鎘，都是重金屬，其潛在的毒性問題必須考慮。分析儀器-熒光光譜儀5.3

穩定性熒光基團的穩定性是又一個需要考慮的因素。雖然這些分子在體外通常是穩定的，但是在體內的穩定性，尤其是在細胞內的內化作用之后，穩定性通常是值得商榷的。一旦被內化到溶酶體內，大部分的熒光基團，除了羅丹明，包括熒光素，氟硼熒（BODIPY）和喹啉藍衍生物，都會在數天內失去熒光。在羅丹明衍生物的案例中，熒光能維持至少一個星期的時間。此外，大多數有機熒光基團被光漂白之后它們的熒光能力會受到威脅。因此，當連續性觀察是必須之時，有機熒光探針必須反復被注射。而且在體外成功可能無法預知在體內成功，因為試劑的生物半衰期可能太快，起不到作用。

分析儀器-熒光光譜儀5.3

穩定性從運動的角度來看，一定水平的降解是合理的，因為這樣產品就能夠排泄出來。例如量子點，代謝起來非常慢，用于臨床必須完全的排泄出來。穩定性不僅取決于熒光基團，而且也取決于其偶合物。一旦熒光基團通過一個連接器分子偶合到靶向配體，其穩定性可能會因為由分解代謝而產生的藥物動力學改變而受到損害。例如，一個熒光基團自身可能被迅速的排泄出去，但是當將其與一個大的載體分子連接時，將會在體內存在更長的時間，從而產生不可預見的可能對熒光有害的作用。分析儀器-熒光光譜儀5.4

藥物動力學

大部分小分子熒光基團都能改變與之共軛的靶標基團的藥物代謝動力學，如多肽和蛋白質，尤其是當一個以上的熒光基團連接到目標共軛配體上時。例如，當幾個熒光基團，如羅丹明X和Cy5.5被連接到一個單一的蛋白質分子時，熒光基團能夠徹底改變靶向探針的藥物動力學。當這些小熒光連接到糖或氨基酸時，這些熒光基團主導了藥物與人體之間的作用。量子點（Qdots）或其它的熒光納米微粒甚至比抗體更大，因此，與熒光顆粒如Qdots相連的特定目標分子的藥物動力學性質與最終形式的探針差別很大。48分析儀器-熒光光譜儀（5）熒光探針的應用分類測定細胞活性的熒光探針：活細胞探針和死細胞探針膜熒光探針：熒光基團標記的磷脂，陰離子膜探針，陽離子膜探針，其它非極性和雙親性膜探針。細胞器熒光探針：線粒體探針，溶酶體、酵母菌液泡和其它酸性細胞器的探針Ca2＋，

Mg2＋，Zn2＋，Na＋，

K＋，

Cl－等離子熒光探針pH熒光探針:近中性pH應用的探針，酸性，探針交聯物活性氧和一氧化氮探針信號轉導探針：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸結合蛋白探針入胞作用、受體和離子通道探針pH細胞形態和流體測量的熒光示蹤劑細胞骨架蛋白熒光探針分析儀器-熒光光譜儀四熒光生色團的結構特點1天然熒光生色團的結構特點（1）碳原子骨架：分子具有共軛雙鍵體系，大多含有芳香環或雜環任何有利于提高π電子共軛度的結構改變，都將提高

熒光效率。例如：對苯基化，間苯基化等。

分析儀器-熒光光譜儀（2）分子的幾何排布：

具有剛性平面結構

熒光素酚酞四熒光生色團的結構特點分析儀器-熒光光譜儀（4）取代基的位置：鄰位、對位—熒光增強，間位—熒光減弱（-CN基例外）(5)環境、溶劑、溫度及pH等均會影響分子結構，從而影響熒光四熒光生色團的結構特點（3）取代基的類型：（1）加強熒光的基團：給電子取代基，

-NH2,-NHR,-OH,-OR,-CN,-OCH3,-OC2H5

（2）減弱熒光的基團：得電子取代基，

-CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I

（3）影響不明顯的基團：-R,-SO3H,-NH3分析儀器-熒光光譜儀2蛋白質和核酸中的熒光生色團Tryptophan(W,Trp)Phenylalanine(F,Phe)Tyrosine(Y,Tyr)四熒光生色團的結構特點分析儀器-熒光光譜儀生色團條件exnmmax10-3emnm

F

Fns敏感度

max

F10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-baseYeast-RNAPhe3201.34600.076.30.91亞硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Pheex:460nm,em:570nmex:365nm,em:515nm四熒光生色團的結構特點分析儀器-熒光光譜儀

五影響熒光測量的因素1光化分解（photodissociation）光照后導致化學鍵斷裂——熒光減弱2淬滅(quenching)溫度淬滅：

溫度每升高10C，熒光減少的百分比，稱為溫度系數。在20-300C的范圍內，溫度系數大約為1.5。濃度淬滅：21

內濾光效應（innerfiltereffect)(3)雜質淬滅：3O2

1O2分析儀器-熒光光譜儀5.1.1動態猝滅熒光猝滅是指熒光物質分子與溶劑分子之間所發生的導致熒光強度變化或相關的激發峰位變化或熒光峰位變化的物理或化學作用過程。熒光的猝滅可以分為動態猝滅和靜態猝滅兩種。一般情況下,動態和靜態猝滅可根據不同溫度下的猝滅常數來判斷。動態猝滅又稱碰撞猝滅,它是熒光體之間相互碰撞導致的猝滅,而靜態猝滅是由于生成了復合物而引起的熒光猝滅。5.1.熒光猝滅理論分析儀器-熒光光譜儀

動態的碰撞猝滅理論可以用Stern–Volmer方程來描述:F0,F—分別是不存在和存在猝滅體時的熒光強度

kq—是生物大分子的猝滅常數

τ0—是不存在猝滅時熒光體的熒光壽命

[Q]—是猝滅體的濃度

kqτ0=Ksv稱為Stern-Volmer猝滅常數。根據方程,以猝滅據F0/F和猝滅體濃度作圖應得到一條直線,其中斜率為Stern-Volmer猝滅常數,

Ksv

隨著溫度的升高而升高。分析儀器-熒光光譜儀

靜態猝滅是熒光體和猝滅體之間形成了不產生熒光的復合物而引起的。靜態猝滅可以用Lineweave-Burk方程來描述:

式中K是熒光體和猝滅體之間的結合常數，可以通過方程得到的直線的斜率和截距求得。5.1.2靜態猝滅分析儀器-熒光光譜儀

由于靜態猝滅是由熒光體和猝滅體形成了復合物而引起的,溫度升高會降低復合物的穩定性,因此,靜態猝滅的猝滅常數會隨著溫度的升高而降低;動態猝滅是由于熒光體和猝滅體之間的碰撞引起的,所以,溫度升高會增加它們之間的有效碰撞,導致猝滅速率加快,猝滅常數也增大。分析儀器-熒光光譜儀

激基締合物(Excimer)是指兩個同種分子或原子的聚集體在激發態時兩分子或原子作用較強，產生新的能級，使發射光譜不同于單個物種,無精細結構,而在基態時作用較弱或無作用。

5.2激基締合物分析儀器-熒光光譜儀3溶液pH的影響利用一些物質在不同pH值溶液中熒光強度和顏色的改變，可以判別各種滴定的終點。指示劑顏色變化pH范圍萘酚無色變黃綠8.2-10.3熒光素淺綠變綠4.0-5.0丫啶橙淺黃綠變黃8.0-10.0分析儀器-熒光光譜儀4溶液極性的影響熒光物質在非極性溶液中的發射峰位比其在極性溶液中的峰位向短波方向（或高頻方向）移動，即藍移，同時熒光強度前者也高于后者。DPH水溶液中膜中發射波長：440nm發射波長：430nm分析儀器-熒光光譜儀5溶劑和化學試劑(1)溶劑選擇要適宜例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2)溶劑要純6熒光污染(1)涂活塞用的潤滑油以及橡皮塞和軟木塞(2)去污劑(3)微生物污染(4)濾紙分析儀器-熒光光譜儀六熒光分光光度術的應用(一）.物質的檢測

1測量原理：稀溶液，F=

I0εcL

2結構特點：含有“芳香環”結構

3靈敏度：10-7~10-8g/ml分析儀器-熒光光譜儀檢測物質激發波長nm發射波長nm維生素A345490維生素B2，pH7370565維生素B12，pH7275305維生素C4905303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羥色胺，中性或弱酸性2953305羥色胺，鹽酸295550，330分析儀器-熒光光譜儀研究生物大分子構象

（二）蛋白質的熒光分析1蛋白質的內源熒光分析儀器-熒光光譜儀2蛋白質的外源熒光分析儀器-熒光光譜儀（三）核酸的熒光分析１嘌呤及衍生物室溫，用紫外和可見光照射，中性水溶液中，均無熒光。酸性介質中，腺嘌呤和鳥嘌呤有熒光。堿性介質中，鳥嘌呤有熒光２嘧啶及衍生物游離的胸腺嘧啶有自發熒光，但量子產率極低Φ＝0.00153核酸的熒光標記分析儀器-熒光光譜儀ProbesexemNoteEthidiumBromide545610非透膜，RNA,DNAPropidiumIodine530615PO-PRO-1iodine435455AcridineOrange490590透膜，RNA,DNAPyroninY545580Bisbenzimide345460透膜，DNA分析儀器-熒光光譜儀（四）利用熒光技術檢測分子間結合程度1用熒光偏振變化檢測結合程度當一些小分子，如輔酶、輔基、半抗原等與特異蛋白質反應時，改變其熒光特性（強度與偏振），通過這些參數的變化，可以了解他們結合時的信息。結合后的大分子馳豫時間長，熒光偏振就大。分析儀器-熒光光譜儀用殺鼠靈滴定HSAScatchard圖r

=[L]

Ka(n-r)

[L]=[L0]–[LP]=[L0]–r[P0]λex=320nmλem=400nm2用熒光強度變化檢測結合程度分析儀器-熒光光譜儀（五）大分子內基團間或分子間距離的測定熒光共振能量轉移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)分析儀器-熒光光譜儀熒光共振能量轉移的三個條件：供體和受體都能發光供體的發射譜和受體的激發譜必須有部分重疊供體和受體的距離必須小于100?分析儀器-熒光光譜儀Forster公式E=R06/(R6+R06)R0:臨界距離，E：轉移效率，R：基團間距離E=1-IDA/ID

IDA:受體存在時的熒光強度，ID：受體不存在時的熒光強度

大分子內基團間或分子間距離的測定分析儀器-熒光光譜儀分析儀器-熒光光譜儀

寡核苷酸用作分子探針和生物傳感器(通過連接許多熒光團到寡核苷酸鏈上)

1.雜交型探針：靶標分子與探針互補匹配。

2.適配子探針：（傳感器）三維空間生物識別

分析儀器-熒光光譜儀熒光團猝滅劑凝血酶寡核苷酸發夾結構同理，若將猝滅劑改為另一種熒光團，利用FRET原理也可用于檢測凝血酶的活性。寡核苷酸的適配子探針分析儀器-熒光光譜儀

雙重芘標記的DNA探針，芘部分被發夾結構牢牢的拴在一起，形成激態聚合體，在485nm發射熒光。當與RNA結合時，發夾結構被打開，芘分成兩部分，熒光發射藍移到378nm和397nm（單體）形成DNA-RNA的雜交體。加入RNaseH后，RNA鏈被分裂下來，DNA又恢復為原來的發夾結構，芘部分重新結合形成激態聚合體，發射波長為485nm，熒光增強。整個過程可用于檢測RNaseH的活性。分析儀器-熒光光譜儀1膜流動性

DPH：P值小，流動性高

2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高2膜滲漏性羧基熒光素(selfquenching)3膜電位的測量Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+)

KO+：細胞外濃度，KI+：細胞內濃度熒光探劑：花菁（cyanine)

K+載體：纈氨霉素：

（六）膜生物物理研究分析儀器-熒光光譜儀4膜融