ICS65.020

CCSB16

DB13

河北省地方標準

DB13/T5374—2021

禽煙曲霉菌病綜合診斷技術規程

2021-04-26發布2021-05-26實施

河北省市場監督管理局發布

DB13/T5374—2021

禽煙曲霉菌病綜合診斷技術規程

1范圍

本文件規定了禽煙曲霉病綜合診斷技術的臨床診斷、實驗室診斷和綜合判定。

本文件適用于雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等禽類煙曲霉菌病的診斷及其煙曲霉菌病原的檢測。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

GB19489-2008實驗室生物安全通用要求

3縮略語

下列縮略語適用于本文件。

GMA-Grocott：六胺銀染色；

PCR：聚合酶鏈式反應；

PDA：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基；

PAS：過碘酸雪夫氏染色；

SYBRGreenⅠ：DNA熒光染料；

TTC：紅四氮唑顯色培養基；

TSA：胰蛋白胨大豆瓊脂培養基；

YEPD：酵母浸出粉胨葡萄糖培養基。

4臨床診斷

當禽出現以下部分或全部情形時，可作為初步診斷的依據。

4.1臨床癥狀

各日齡禽均可感染，雛禽易感。病禽眼神呆滯、瞇眼、呼吸困難等癥狀。

4.2剖檢病變

肺臟發生不同程度壞死、氣囊增厚、出現黃色菌斑并偶而伴有肝臟出血斑或顏色暗紅。

5實驗室診斷

包括常規檢測和定量PCR檢測技術。參照GB19489-2008實驗室生物安全通用要求的相關條款。

1

DB13/T5374—2021

5.1常規檢測

5.1.1樣品的采集

取病禽肺、肝臟、腎等病料，放入無菌的平皿中；其他器官用無菌剪刀各取小塊組織兩份，用滅

菌水充分沖洗后，一份接種于YEPD平板上（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉），一份

放入40g/L甲醛固定液中待用。

5.1.2病原菌的分離純化與形態觀察

將接種病料的平板放入培養箱，28℃恒溫培養，每天觀察菌落生長情況；3d后用接種環挑取平板

上的疑似菌落，劃線接種于YEPD平板培養基繼續分離培養，3d后將疑似單菌落進行涂片、染色和鏡檢，

取疑似菌落菌體進一步接種于PDA試管斜面，28℃培養3d后保存備用。

對照煙曲霉菌典型菌落形態和菌體形態特征進行初步鑒別（參見附錄A）。

5.1.3組織切片檢查

將40g/L甲醛固定液中樣本固定24h后取出，經修塊、脫水、透明、浸蠟包埋、切片、HE染色、PAS、

GMA和CFW染色，顯微鏡觀察組織病理和病原生長情況（參見附錄A）。

以病料中檢查到菌絲或孢子為陽性結果，病料中連續兩次檢查不到菌絲和孢子為陰性。

5.1.4不同染色方法檢查

分離株（經形態學和分子生物學鑒定），進行雞體攻毒試驗。并對HE、PAS、GMS、CFW四種染色方

法進行了組織學對比觀察（參見附錄A）。

5.1.5CSP基因分型

分離株（經形態學和分子生物學鑒定），進行CSP基因分型，已確定感染煙曲霉菌的基因型（參見

附錄A）。

5.2定量PCR檢測

5.2.1樣品采集

選擇有典型癥狀的病禽，無菌采血或病變組織（肺），放入1.5mL滅菌EP管中，將EP管編號，記

錄樣本信息，-20℃保存備用。

5.2.2基因組DNA提取

取組織樣本0.2g放在研缽中，加入適量液氮，待液氮即將揮發殆盡時迅速研磨成粉末狀，收集樣

本0.05g～0.1g于1.5mLEP管中，加入500μL裂解液（400mMTris-HCl[pH8.0]，60mMEDTA[pH8.0]，

150mMNaCl，1%sodiumdodecylsulfate），室溫放置10min；加150μL乙酸鉀(pH4.8)，漩渦震蕩，

離心12000g，1min，取上清液放入新試管，加入等體積異丙醇；DNA團塊用70%乙醇清洗，干燥后，溶

解在50μLTE（10mMTris，1mMEDTA）中保存。

5.2.3引物合成

參照GenBank中煙曲霉benAfum基因間轉錄間隔區序列（AFUA_1G10910），使用PrimerExpress5.0

軟件設計特異性引物（預期擴增片段大小152bp）：

上游引物F：5?-TAATAGCTACAATGGCTCCT-3?

2

DB13/T5374—2021

下游引物R：5?-ACGAGGAACATATTTGTCA-3?

5.2.4定量PCR反應體系和反應程序

采用25μL的反應體系：SYBRPremixExTaq（2×）12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模

板1.0μL，用雙蒸水補足至25μL。反應程序為：94℃預變性3min；94℃30s，60℃30s，72℃

30s，進行35個循環，72℃延伸10min，于4℃終止反應。

5.2.5標準曲線和熔解曲線

從煙曲霉菌106-100copies/μL一系列模板特異性克隆的SYBRGreenⅠqPCR反應熒光曲線可見，

在106-101copies/μL濃度范圍內熒光曲線呈“S”形。以線性范圍內6個濃度（106-101copies/μL）的特異

性克隆為模板在同樣條件下進行SYBRGreenqPCR反應，得到標準曲線和熔解曲線。

5.2.6結果判斷

當待測樣品實時熒光定量PCR檢測結果有“S”型擴增曲線，Ct值≤36.5，且Tm值為85℃時，判定待測

樣品中含有煙曲霉菌，而且可通過Ct值大小判斷感染的程度（參見附錄A）。未出現“S”型擴增曲線

和Tm值，則判斷樣品中不含煙曲霉菌。

6綜合判定

結合臨床診斷、實驗室檢測結果，可確診禽煙曲霉菌病。

3

DB13/T5374—2021

AA

附錄A

（資料性）

菌落形態和菌絲及孢子形態特征

A.1鏡檢

將每個取樣EP管封蓋，瞬時振蕩，用無菌棉簽沾取懸液于YEPD慶大霉素培養基平板涂劃接種，于

28℃恒溫培養36h～48h；將疑似單菌落取菌體經革蘭氏染色和棉藍染色鏡檢，將霉菌樣細胞的相應

菌落取菌體分別接種于沙保弱培養基平板，于28℃恒溫、保濕培養3d～4d，觀察平板菌落特征并直

接鏡檢載片培養物形態特征。

A.2判斷

沙保弱培養基平板上可見中央為藍綠色，周圍為白色的菌落，但藍綠色占比多于周圍白色面積，

菌落背面，周邊為黃綠色，中央為藍綠色。第四天菌落正面分為三種顏色，由內向外分別為墨綠、藍

綠、白色，而菌落周邊仍為白色。顯微鏡下觀察發現菌絲呈棉花樣，分生孢子頭的頂囊為倒立燒瓶狀。

孢子梗為單層小梗，小梗排列成木柵狀，小梗覆蓋頂囊表面的3/4。小梗的頂端分散著鏈狀的分生孢子，

分生孢子呈球形，成綠色或深綠色。

A.3不同染色方法檢查

HE染色：血管充血，呼吸毛細管消失，肺房間隔增寬甚至消失，被結締組織所取代，并有炎性細

胞浸潤。嚴重者，可看到孢子染成紅色，菌絲染成藍紫色，周圍組成為紅色，反差明顯；PAS染色：組

織結構不清楚，菌絲染成紫色，孢子染成紅色，而背景為藍紫色，真菌與周圍組織反差明顯。菌絲短

而細，且分支分隔，呈紅紫色，孢子為圓形，紅粉色。GMS染色：菌絲被染成黑褐色，背景為紅褐色，

反差明顯易辨認。菌絲