循環(huán)腫瘤DNA的檢測(cè)方法（中篇）ctDNA僅占cfDNA的0.1%~5%，且不同癌種、不同病程的腫瘤患者ctDNA在血漿中含量差異較大。因此，需要超敏感方法來(lái)檢測(cè)ctDNA攜帶的特征信息（包括突變、重排、拷貝數(shù)異常、甲基化等）。中篇將介紹ctDNA的各種分析方法。5.ctDNA的分析方法循環(huán)cfDNA主要由源自正常細(xì)胞的種系DNA組成，存在于癌癥患者中的ctDNA相對(duì)較少且高度可變。因此，傳統(tǒng)DNA分析方法(如Sanger測(cè)序，焦磷酸測(cè)序)的靈敏度不足以檢測(cè)癌癥患者血漿ctDNA中的體細(xì)胞突變。目前ctDNA的分析方法主要有三種：以ARMS為代表的定量PCR技術(shù)；以ddPCR為代表的數(shù)字PCR技術(shù)；基于下一代測(cè)序(NGS)的高通量檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)也出現(xiàn)了核酸質(zhì)譜技術(shù)和EFIRM技術(shù)。5.1ARMS技術(shù)ARMS全稱(chēng)amplificationrefractorymutationsystem(擴(kuò)增受阻突變體系)，又稱(chēng)等位基因特異性擴(kuò)增法，是一種在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)用于檢測(cè)DNA中各種點(diǎn)突變的新方法。其基本原理是，如果引物的3′端堿基與模板堿基不互補(bǔ)，則用一般耐熱DNA聚合酶無(wú)法延伸。因此根據(jù)已知點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)引物，使3′端堿基分別與突變和正常的模板堿基互補(bǔ)，從而將有某種點(diǎn)突變的模板與正常模板區(qū)分開(kāi)來(lái)。ARMS技術(shù)結(jié)合電泳或熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，前者利用凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增帶，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)果分析，后者指ARMS技術(shù)結(jié)合探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，在熒光定量PCR平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品DNA中稀有突變的檢測(cè)。目前采用電泳分析仍是主流，結(jié)合定量PCR的還較少。四引物ARMS-PCR方法的示意圖（該方法基于具有兩組引物的PCR反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。一組內(nèi)部引物對(duì)于對(duì)突變和野生型等位基因是特異性的，并且它們彼此相對(duì)設(shè)計(jì)，另一組外部引物用于在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生對(duì)照條帶。兩個(gè)外部引物和內(nèi)部—外部引物可以相互反應(yīng)并產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物，它們可以在凝膠電泳中分離。）資料來(lái)源：IranJPublicHealth44(3):380-7,2015，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理ARMS技術(shù)具有成本低、簡(jiǎn)便快速、特異性好、技術(shù)普及度高等特點(diǎn)，非常適合醫(yī)院廣泛開(kāi)展。ARMS技術(shù)已成為目前歐盟及中國(guó)CFDA批準(zhǔn)用于臨床的血液檢測(cè)方法，同時(shí)獲得專(zhuān)家共識(shí)的推薦。然而ARMS技術(shù)檢測(cè)靈敏度有限（檢測(cè)限度為1%），單次只能檢測(cè)單個(gè)基因且只能用于檢測(cè)已知突變，在一定程度上限制其應(yīng)用。艾德生物基于ARMS技術(shù)開(kāi)發(fā)了升級(jí)版Super-ARMS，其保留了ARMS技術(shù)簡(jiǎn)便快速，特異性好，技術(shù)普及度高等特點(diǎn)，非常適合醫(yī)院廣泛開(kāi)展，同時(shí)進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度（0.01-0.2%），滿(mǎn)足血液ctDNA檢測(cè)的要求，更適合作為血液ctDNA檢測(cè)的臨床普及技術(shù)。5.2數(shù)字PCR技術(shù)qPCR通過(guò)熒光染料或熒光特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有熒光染料分子結(jié)合到雙鏈DNA上或有熒光分子從探針上釋放，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的累積。由于熒光積累與PCR產(chǎn)物形成完全同步，可通過(guò)軟件對(duì)熒光積累信息進(jìn)行分析和計(jì)算，獲得待測(cè)樣品模板的初始濃度。但是，qPCR只能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行相對(duì)定量，無(wú)法做到精準(zhǔn)絕對(duì)定量。qPCR示意圖（使用基因特異性引物，通過(guò)摻入雙鏈DNA特異性染料或通過(guò)聚合酶5'-3'外切核酸酶活性釋放TaqManFRET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）探針檢測(cè)靶標(biāo)的初始濃度。）資料來(lái)源：NatRevGenet.2016May17;17(6):333-51，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理20世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digitalPCR，dPCR)的概念，與qPCR不同的是，數(shù)字PCR可以不需要對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析。數(shù)字PCR一般包括兩部分內(nèi)容，即PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)分析。數(shù)字PCR通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)反應(yīng)單元類(lèi)型不同，數(shù)字PCR分為三類(lèi)：微反應(yīng)室/孔板、微流控芯片和微滴數(shù)字PCR系統(tǒng)。目前通過(guò)數(shù)字PCR方法進(jìn)行ctDNA分析的主要技術(shù)有ddPCR和BEAMing。5.2.1ddPCRddPCR全稱(chēng)dropletdigitalPCR(微滴數(shù)字PCR)。該技術(shù)屬于Bio-Rad公司，可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量和稀有等位基因的檢測(cè)，其工作原理為：首先將血漿中分離出的DNA分割成一個(gè)個(gè)的小微滴，置于不同的微孔中，便于形成多個(gè)獨(dú)立、平行的反應(yīng)；隨后對(duì)微孔中的DNA同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增時(shí)通過(guò)特定的化學(xué)試劑和染料探針標(biāo)記其中的陽(yáng)性分子，即ctDNA，檢測(cè)到ctDNA會(huì)有信號(hào)累積；最后對(duì)每個(gè)孔的信號(hào)累積情況進(jìn)行計(jì)算和定量分析，即可計(jì)算出原始樣品中ctDNA的含量。該技術(shù)靈敏度高達(dá)0.001%，能夠檢測(cè)到血液中痕量的ctDNA，可有效適用于腫瘤的早期篩查，但是不能檢測(cè)未知突變，且不能高通量。ddPCR檢測(cè)ctDNA示意圖資料來(lái)源：銀河證券，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理5.2.2BEAMing該方法基于小珠(Bead)、乳濁液(Emulsion)、擴(kuò)增(Amplification)、磁性(Magnetic)這四個(gè)主要組分來(lái)構(gòu)建，所以被稱(chēng)作為BEAMing。BEAMing結(jié)合了數(shù)字PCR以及流式技術(shù)，通過(guò)磁珠克隆DNA。利用特異性PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)突變區(qū)后，與磁珠（磁珠上固定有特異的PCR引物）混合進(jìn)行油包水單分子擴(kuò)增反應(yīng)。反乳化作用后，利用不同顏色的熒光探針結(jié)合磁珠上的PCR產(chǎn)物，發(fā)出紅色或綠色熒光。使用流式細(xì)胞儀分析磁珠顏色來(lái)確定突變情況。BEAMing技術(shù)具有較高的靈敏度（0.01%），但是這項(xiàng)技術(shù)只能檢測(cè)已知突變，且成本較高。同時(shí)，它的操作也較復(fù)雜，通量低。BEAMing技術(shù)（步驟1：鏈霉親和素包被的磁珠與生物素標(biāo)記的寡核苷酸結(jié)合。步驟2：含水混合物（包含PCR所需的所有成分、結(jié)合引物的磁珠和模板DNA）與油/洗滌劑混合物一起攪拌以產(chǎn)生微乳液；含水隔室（灰色油層中的白色圓圈）含有平均少于一個(gè)模板分子和少于一個(gè)珠子；紅色和綠色模板代表兩個(gè)模板分子，其序列相差一個(gè)或多個(gè)核苷酸。步驟3：如常規(guī)PCR中那樣對(duì)微乳液進(jìn)行溫度循環(huán)；如果DNA模板和磁珠一起存在于單個(gè)水性隔室中，則磁珠結(jié)合的寡核苷酸作為擴(kuò)增的引物；連接到磁珠的紅色和綠色直線(xiàn)代表來(lái)自?xún)煞N不同模板的延伸產(chǎn)品。步驟4：破壞乳液，用磁鐵純化磁珠。步驟5：變性后，將磁珠與能區(qū)分不同種類(lèi)模板序列的寡核苷酸（雜交探針）一起溫育；然后使用熒光標(biāo)記的抗體標(biāo)記結(jié)合的雜交探針，這使得在適當(dāng)?shù)募す饧ぐl(fā)后含有PCR產(chǎn)物的磁珠為紅色或綠色。步驟6：流式細(xì)胞術(shù)用于計(jì)數(shù)紅色和綠色磁珠。）資料來(lái)源：PNASJuly22,2003100(15)，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理5.3NGS技術(shù)數(shù)字PCR技術(shù)，具有極高的敏感性，可絕對(duì)定量；但該方法操作復(fù)雜，一次僅能檢測(cè)少數(shù)突變位點(diǎn)，且不能檢測(cè)融合變異。為了提高檢測(cè)通量和效率，以NGS為核心的測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于ctDNA的下游分析，范圍從全基因組或全外顯子組測(cè)序到有限基因組的靶向測(cè)序。NGS可實(shí)現(xiàn)對(duì)多基因核酸片段進(jìn)行高通量平行深度測(cè)序，能夠同步檢測(cè)多個(gè)基因、不同形式（如突變、拷貝數(shù)改變和基因融合）及未知突變，在預(yù)后和療效判斷的時(shí)候，多基因的參與可能對(duì)預(yù)后效果產(chǎn)生非常大的影響。5.3.1NGS技術(shù)的原理NGS是最近十多年誕生的DNA測(cè)序技術(shù)，它能同時(shí)對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)個(gè)DNA分子進(jìn)行平行測(cè)定，與傳統(tǒng)的一代測(cè)序技術(shù)相比，具有高通量、高敏感性等優(yōu)勢(shì)，因此也稱(chēng)為高通量測(cè)序技術(shù)，是對(duì)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序革命性的改變。NGS的測(cè)序步驟主要有（1）文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建文庫(kù)時(shí)需要將DNA隨機(jī)片段化并在兩頭加上特定的接頭（adaptor）；（2）文庫(kù)分子大規(guī)模平行克隆擴(kuò)增，使用橋式擴(kuò)增或者乳液PCR方法，對(duì)文庫(kù)中的DNA片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增，以產(chǎn)生足夠拷貝數(shù)量的測(cè)序模板；（3）測(cè)序，目前NGS測(cè)序平臺(tái)主要包括Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem，其中Illumina公司的測(cè)序平臺(tái)占主導(dǎo)地位。Roche/454FLX平臺(tái)采用焦磷酸測(cè)序原理，在第二代中讀長(zhǎng)最高，但儀器昂貴，難于處理重復(fù)和同種堿基多聚物區(qū)域；SOLID平臺(tái)應(yīng)用連接法測(cè)序，測(cè)序通量和準(zhǔn)確性高，試劑成本低，但儀器昂貴，測(cè)序運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，讀長(zhǎng)短，數(shù)據(jù)分析困難。Solexa技術(shù)采用可逆鏈終止物和合成測(cè)序法，測(cè)序通量高，需要樣品量少其簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化，其但儀器高貴，用于數(shù)據(jù)刪節(jié)和分析的費(fèi)用很高。NGS技術(shù)的原理和流程資料來(lái)源：公開(kāi)資料，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理5.3.2非靶向測(cè)序非靶向測(cè)序根據(jù)檢測(cè)范圍分為全外顯子測(cè)序(WES)和全基因組測(cè)序(WGS)。目前已有技術(shù)平臺(tái)應(yīng)用全基因組測(cè)序方法來(lái)分析ctDNA，該方法能夠在不事先知道腫瘤中可能存在的畸變的情況下鑒定腫瘤特異性的改變。因此，可以利用這些方法從頭發(fā)現(xiàn)治療抗性的基因變化，并鑒定癌癥患者中新的可操作靶標(biāo)。但是全基因組測(cè)序檢測(cè)靈敏度較低（5-10%），而且成本高、檢測(cè)周期長(zhǎng)、數(shù)據(jù)分析難度較大，難以在臨床上應(yīng)用。5.3.3靶向深度測(cè)序?yàn)榱嗽诒ＷC檢測(cè)準(zhǔn)確性和測(cè)序深度的基礎(chǔ)上降低價(jià)格，目前越來(lái)越多的新技術(shù)先對(duì)ctDNA目的片段進(jìn)行富集，再將富集后的目的序列進(jìn)行深度測(cè)序，這種方法稱(chēng)為靶向深度測(cè)序。與全基因組測(cè)序以及全外顯子測(cè)序相比，靶向測(cè)序能夠獲得更深的覆蓋度和更高的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，提高了對(duì)目的區(qū)域的檢測(cè)效率。同時(shí)縮短了檢測(cè)周期，降低了測(cè)序成本，適合對(duì)大量樣本進(jìn)行分析。靶向測(cè)序技術(shù)可通過(guò)PCR或雜交捕獲對(duì)目的片段進(jìn)行富集?；赑CR的靶向測(cè)序技術(shù)是針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)幾十對(duì)甚至上百對(duì)PCR引物，利用PCR擴(kuò)增富集?；陔s交捕獲的靶向測(cè)序技術(shù)是針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)探針，通過(guò)雜交捕獲的方法富集。由于NGS的實(shí)驗(yàn)流程技術(shù)較為復(fù)雜，在文庫(kù)構(gòu)建、目的片段富集及測(cè)序過(guò)程中不可避免的會(huì)引入一些擴(kuò)增和測(cè)序的錯(cuò)誤，這些錯(cuò)誤稱(chēng)為背景噪音，而ctDNA檢測(cè)往往突變頻率較低，受到背景噪音干擾較大，來(lái)自ctDNA樣本中的低頻突變往往淹沒(méi)在背景噪音之中，造成假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，這就限制了ctDNA檢測(cè)的靈敏度和特異性。因此，目前基于NGS的靶向測(cè)序技術(shù)都致力于降低背景噪音，提高ctDNA檢測(cè)的靈敏度和特異性，大多數(shù)技術(shù)通過(guò)分子條形碼(barcode)的策略。分子條形碼又稱(chēng)分子標(biāo)簽(UniqueMolecularindentifier,UMI)，它的原理就是給每一條原始DNA片段加上一段特有的標(biāo)簽序列，經(jīng)文庫(kù)構(gòu)建及PCR擴(kuò)增后一起進(jìn)行測(cè)序。這樣，根據(jù)不同的標(biāo)簽序列就可以區(qū)分不同來(lái)源的DNA模板，分辨哪些是PCR擴(kuò)增及測(cè)序過(guò)程中的隨機(jī)錯(cuò)誤造成的假陽(yáng)性突變，哪些是患者真正攜帶的突變，從而改善檢測(cè)的局限性，提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。最初使用的條形碼策略是追蹤單鏈DNA的單鏈標(biāo)簽，目前大多使用的策略是追蹤雙鏈DNA的雙鏈標(biāo)簽。盡管雙鏈標(biāo)簽比單鏈標(biāo)簽?zāi)軐?shí)現(xiàn)更好的錯(cuò)誤抑制，但是效率相對(duì)較低，因此對(duì)于臨床上數(shù)量有限的cfDNA不是最佳的。使用分子條形碼策略的NGS方法資料來(lái)源：NEnglJMed2018;379:1754-65，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理除了使用分子條形碼，一些錯(cuò)誤抑制算法和富集特定長(zhǎng)度的ctDNA片段（ctDNA片段通常比健康細(xì)胞釋放的cfDNA片段?。┮脖挥脕?lái)降低背景噪音，改善ctDNA檢測(cè)的敏感度。目前通過(guò)靶向深度測(cè)序方法進(jìn)行ctDNA檢測(cè)的主要技術(shù)有標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序(TAM-Seq)，安全測(cè)序系統(tǒng)(Safe-seqS)，癌癥個(gè)體化深度測(cè)序(CAPP-Seq)，集成數(shù)字錯(cuò)誤抑制方法(iDES)，靶向錯(cuò)誤矯正測(cè)序(TEC-Seq)等。TAM-Seq

基本原理是設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行循環(huán)預(yù)擴(kuò)增，產(chǎn)生大小200bp以下末端重疊覆蓋整個(gè)區(qū)域的擴(kuò)增子（預(yù)擴(kuò)增），接著通過(guò)單重PCR選擇性擴(kuò)增帶突變的擴(kuò)增子區(qū)（標(biāo)簽擴(kuò)增），從而排除非特異性產(chǎn)物，最后在回收的產(chǎn)物上加接頭和特異性條形碼(barcode)，進(jìn)一步通過(guò)單端測(cè)序得到最終結(jié)果。該方法主要特點(diǎn)是測(cè)序通量高、測(cè)序時(shí)間和成本顯著降低，但檢測(cè)敏感度有待提高（>2%）。TAM-Seq流程（紅星代表攜帶突變的DNA分子）資料來(lái)源：SciTranslMed4,136ra68(2012)，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理Safe-seqS

該方法包括兩個(gè)基本步驟：第一步為每個(gè)待分析的DNA模板分子分配獨(dú)特的標(biāo)示物（UID，或稱(chēng)條形碼）；第二步對(duì)每個(gè)UID標(biāo)記的模板進(jìn)行擴(kuò)增，從而產(chǎn)生具有相同序列的許多子分子（定義為UID家族）。如果用于擴(kuò)增的模板分子中預(yù)先存在突變，則該突變應(yīng)該存在于含有該UID的每個(gè)子代分子中（除非任何后續(xù)的復(fù)制或測(cè)序錯(cuò)誤）。至少95％的家庭成員具有相同突變的UID家族被稱(chēng)為“超級(jí)突變體”。原始模板中沒(méi)有發(fā)生的突變，例如復(fù)制或測(cè)序錯(cuò)誤，不會(huì)產(chǎn)生超級(jí)突變體。Safe-seqS改善了大規(guī)模平行測(cè)序的準(zhǔn)確性，能用于鑒定DNA模板中的稀有突變，發(fā)現(xiàn)PCR或測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤。UID標(biāo)記的模板的擴(kuò)增效率對(duì)該方法的成功至關(guān)重要，但臨床樣品含有降低該步驟效率的抑制劑，需要優(yōu)化以解決這一問(wèn)題。Safe-SeqS流程資料來(lái)源：PNAS.2011Jun7;108(23):9530–9535，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理CAPP-Seq

該方法的關(guān)鍵是聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和多階段生物信息學(xué)方法，來(lái)設(shè)計(jì)一個(gè)由生物素化的寡核苷酸組成的“篩選器”，靶向腫瘤的突變區(qū)域，直接應(yīng)用于待測(cè)的循環(huán)DNA，來(lái)識(shí)別腫瘤相關(guān)的基因突變，從而直接進(jìn)行ctDNA的定量測(cè)定。這個(gè)篩選器是從腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（COSMIC）等來(lái)源中，納入可能的驅(qū)動(dòng)基因中反復(fù)出現(xiàn)突變的外顯子，再對(duì)腫瘤基因圖譜庫(kù)（TCGA）的407名非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)，運(yùn)用迭代算法找到最大量的錯(cuò)義突變，而使篩選器長(zhǎng)度最小化。篩選器長(zhǎng)度約為125kb，包含了139個(gè)反復(fù)出現(xiàn)的突變基因中的521個(gè)外顯子及12個(gè)內(nèi)含子，平均能夠識(shí)別4個(gè)單核苷酸突變。CAPP-Seq有效的把測(cè)序區(qū)段濃縮到整個(gè)基因組大小的0.004%，使得后續(xù)超高深度測(cè)序得以實(shí)現(xiàn)，其對(duì)ctDNA檢測(cè)結(jié)果靈敏度高，特異性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)可行。CAPP-Seq流程資料來(lái)源：維基百科，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理iDES

CAPP-seq技術(shù)的檢測(cè)極限是0.02%，不過(guò)許多測(cè)序片段都有錯(cuò)誤。為了解決這些錯(cuò)誤，研究人員對(duì)CAPP-seq進(jìn)行了優(yōu)化，開(kāi)發(fā)了iDES。該方法使用分子條形碼和“背景拋光”兩種技術(shù)策略，能獲得有效的cfDNA，大大降低了本底噪音。這兩種方案能分別使CAPP-seq敏感性提升3倍，而結(jié)合后提升15倍。iDES使用的分子條形碼策略綜合了單鏈條形碼和雙鏈條形碼的各自?xún)?yōu)勢(shì)。原始DNA雙鏈分子的每條鏈?zhǔn)褂盟膫€(gè)條形碼標(biāo)記。單鏈條形碼為“索引讀取”的一部分進(jìn)行測(cè)序，因此稱(chēng)為“索引”條形碼。雙鏈條形碼作為插入DNA片段主要讀數(shù)的一部分進(jìn)行測(cè)序，因此稱(chēng)為“插入”條形碼。在測(cè)序之后，互補(bǔ)的插入條形碼可匹配，從而重新構(gòu)建出原始的雙鏈DNA分子。iDES分子條形碼的設(shè)計(jì)策略資料來(lái)源：Nat.Biotechnol.34,547–555(2016)，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理雜交捕獲過(guò)程中的氧化損傷會(huì)產(chǎn)生大量反復(fù)發(fā)生的背景錯(cuò)誤，最常見(jiàn)的是G→T的顛換，也有少量C→T和G→A的錯(cuò)誤。僅使用分子條形碼策略，這些背景錯(cuò)誤的發(fā)生率仍較高。為了減少基于雜交捕獲的測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的背景錯(cuò)誤，研究人員設(shè)計(jì)一種稱(chēng)為“背景拋光”的計(jì)算方法。iDES將這種計(jì)算方法與分子條形碼策略結(jié)合起來(lái)，使錯(cuò)誤率減少了15倍。iDES能夠檢測(cè)到頻率低至0.004%的突變，敏感性和特異性較其他方法得到了改善。在熱點(diǎn)等位基因上實(shí)現(xiàn)了與數(shù)字PCR或基于PCR的測(cè)序方法類(lèi)似的靈敏度，但可以同時(shí)詢(xún)問(wèn)數(shù)百到數(shù)千個(gè)額外的基因組位置，而不會(huì)影響靈敏度或特異性。TEC-seq

該方法基于對(duì)基因組的多個(gè)區(qū)域的靶向捕獲和DNA片段的深度測(cè)序(~30,000X)。除了深度測(cè)序以外，該方法還對(duì)測(cè)序流程做出了一系列改進(jìn)來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度。其中包括：優(yōu)化測(cè)序庫(kù)的生成和靶向片段的捕獲，通過(guò)加入少量外源條形碼最大化獨(dú)特ctDNA在測(cè)序庫(kù)中的呈現(xiàn)可能，以及在后期分析時(shí)過(guò)濾掉測(cè)序錯(cuò)誤和其它原因?qū)е碌幕蜃儺悺EC-seq檢測(cè)有望用于無(wú)癥狀的患者進(jìn)行癌癥早期篩查，但鑒于可能潛在檢測(cè)到的不同腫瘤，需要成像和其他診斷手段來(lái)完成任何陽(yáng)性ctDNA分析，以適當(dāng)鑒別起源腫瘤。TEC-seq流程（從血液中提取cfDNA，并通過(guò)連接含有少量雙索引條形碼適配子的池轉(zhuǎn)化為基因組文庫(kù)。捕獲所得到的cfDNA文庫(kù)并進(jìn)行冗余測(cè)序以產(chǎn)生每個(gè)DNA片段的多重拷貝。重復(fù)片段之間的序列調(diào)節(jié)鑒定出具有相同起始和終止位置以及外源條形碼的相同DNA分子中存在的改變。使用包含相同冗余變化的多個(gè)不同分子的參照基因組進(jìn)行比對(duì)以鑒別真正的改變）資料來(lái)源：SciTranslMed4,136ra68(2012)，寬華投研團(tuán)隊(duì)整理5.4核酸質(zhì)譜技術(shù)20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)打破了以往質(zhì)譜僅可進(jìn)行小分子物質(zhì)分析的傳統(tǒng)，使得核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子也可應(yīng)用質(zhì)譜進(jìn)行研究。由此其奠基人田中耕一和約翰貝內(nèi)特芬恩于2002年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，F(xiàn)DA于2014年批準(zhǔn)MALDI-TOFMS可用于臨床核酸檢測(cè)。MALDITOF質(zhì)譜通過(guò)將待測(cè)樣本轉(zhuǎn)換成高速運(yùn)動(dòng)的離子，根據(jù)不同離子擁有不同的質(zhì)荷比(m/z)，來(lái)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行分離和檢測(cè)，可用于ctDNA的SNP、突變、甲基化及拷貝數(shù)差異等多項(xiàng)檢測(cè)與分析。Agena是采用飛行質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行核酸檢測(cè)最知名的公司，目前已經(jīng)與多家公司合作，對(duì)公司的MassARRAY?系統(tǒng)、DNA檢測(cè)應(yīng)用和產(chǎn)品進(jìn)行大力推廣。MassARRAY?系統(tǒng)將飛行質(zhì)譜的特性和多重基因檢測(cè)完美的組合在一起，一次檢測(cè)多達(dá)40~50個(gè)基因位點(diǎn)，單位成本低廉，這是其在臨床應(yīng)用的核心競(jìng)爭(zhēng)力。飛行質(zhì)譜檢測(cè)核酸突變的原理（首先通過(guò)多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)待測(cè)基因突變和野生的目的片段，然后通過(guò)單堿基延伸反應(yīng)獲得突變片段的延伸產(chǎn)物，延伸產(chǎn)物和非延伸引物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，用激光照射后產(chǎn)物離