《水產品中13種鄰苯二甲酸酯單酯的液相色譜-質譜/質譜

檢測方法》編制說明

一、制定標準的必要性

鄰苯二甲酸酯主要是人工合成的增塑劑，由其構成的塑料產品被廣泛用于畜

禽、水產養殖行業，據報道近年來使用量呈現逐年上升趨勢，在水產養殖環境中

被頻繁檢出。鄰苯二甲酸酯性質差異較大，可對環境造成直接污染；此外，鄰苯

二甲酸酯還可通過食物鏈蓄積作用進入人體，對人體器官產生蓄積毒性，危害人

體健康，并且極易發生轉化降解產生初級代謝產物由此造成的二次污染也不容忽

視。因此對養殖生物中鄰苯二甲酸酯單酯進行控制非常重要。

近年來，增塑劑濫用造成的環境殘留與生態效應引起了國家政府機構和學者

的廣泛關注，尤其是增塑劑中鄰苯二甲酸酯與其代謝物長期存在對環境生態系統

和人體健康都構成極大威脅。控制養殖生物中鄰苯二甲酸酯單酯含量，首先要有

科學有效的檢測方法。針對養殖生物體中鄰苯二甲酸酯單酯的國家標準及行業標

準尚未出臺。為規范統一檢測方法，使檢測數據更具有比較和分析意義，建立一

套科學有效的檢測養殖生物中鄰苯二甲酸酯單酯含量的標準方法顯得尤為迫切。

通過本標準方法的建立，可以極大的壓縮檢測成本，縮短檢測時間，也更便于相

關部門對所轄區域內養殖生物體內鄰苯二甲酸酯單酯含量情況有客觀準確了解，

并在此基礎上，采取有效措施，合理監管，確保環境安全，生態健康。

二、標準編制原則及依據

1、按照GB/T20001.5-2017《標準編寫規范第5部分：規范標準》要求進行

編寫。

2、參照相關法律、法規和規定，在編制過程中著重考慮了科學性、適用性

和可操作性。

三、項目背景及工作情況

（一）任務來源

根據《中國國際科技促進會標準化工作委員會團體標準管理辦法》的有關規

定，經中國國際科技促進會標準化工作委員會及相關專家技術審核，批準《水產

-1-

品中13種鄰苯二甲酸酯單酯的液相色譜-質譜/質譜檢測方法》團體標準制定計

劃，計劃編號為：CI2023430.本標準由寧波大學提出，中國國際科技促進會歸口。

（二）標準起草單位

本標準的主要起草單位是寧波大學、浙江萬里學院、寧波市農業科學院、浙

江省農業科學院、南京農業大學等單位參與起草，負責標準中重要技術點的研究

和建議，并參與標準內容的討論。

（三）標準研制過程及相關工作計劃

1、前期準備工作

項目立項前，項目承擔單位寧波大學于2022年6月中旬成立標準編制小組。

編制組成員查閱、研讀相關國內外文獻，廣泛搜集用的相關的材料。同時，多次

開展與專業技術人員進行調研、交流，廣泛征求標準制定方面的意見和建議。

2、標準起草過程

2022年8月17日，由寧波大學在浙江省寧波市寧波大學寧大賓館多功能會

議廳線下組織了第一次起草會議，談論了標準的組織構架，確定了分工和編制工

作的各項任務完成時間節點。

2023年10月18日組織了第二次起草會議，確定下了標準內容的草案。

團體標準立項通知公示后，標準編制小組首先組織了標注制定工作會議，各

編寫人員根據工作計劃分工和編寫要求開展了相關工作。在標準起草期間，編制

小組主編單位及參編單位組織了數次內部研討會和專家咨詢會，經過多次修改，

于2024年3月完成了標準初稿及編制說明的撰寫?作。

3、征求意見情況

標準編制小組先后通過現場會議、電話、微信等多種形式征集?業專家相關

意見和建議。針對征集的意見，標準編制小組召開了研討會，將收集到的意見進

行匯總處理分析，在充分吸納合理意見的基礎上，先后修改和完成標準內容，于

2024年3月根據在各單位反饋意見基礎上，形成了標準征求意見稿并由中國國

際科技促進會提交全國標準信息平臺公示。

（四）主要試驗（或驗證）情況分析

1、方法原理

水產品中的鄰苯二甲酸單酯經固相萃取柱富集、凈化后，采用高效液相色譜

-2-

-串聯質譜法測定。根據化合物的保留時間和特征離子峰定性，內標法定量。

2、適用范圍

本文件規定了測定水產品中鄰苯二甲酸單酯的高效液相色譜-串聯質譜法。

本文件適用于水產品中鄰苯二甲酸單甲酯（MMP）、鄰苯二甲酸單乙酯

（MEP）、鄰苯二甲酸單異丁酯（MiBP）、鄰苯二甲酸單正丁酯（MnBP）、鄰苯

二甲酸單環己酯（MCHP）、鄰苯二甲酸單芐基酯（MBZP）、鄰苯二甲酸單辛酯

（MOP）、鄰苯二甲酸單異壬酯（MiNP）、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯、鄰

苯二甲酸單（3-羧基丙基）酯（MCPP）、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-酮基己基）酯

（MEOHP）、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-羥基己基）酯（MEHHP）、鄰苯二甲酸單

（2-乙基-5-羧基戊基）酯（MECCP）等13種鄰苯二甲酸單酯的測定。

3、樣品前處理方法

精確稱量2.50g（濕重，ww）水產品樣品，并轉移至50mLPTFE離心管中。

將2mL1M乙酸銨緩沖液（AA，pH6.5）、80μLβ-葡萄糖醛酸酶和內標（200.0

μg/L）加入管中，將混合物渦旋3min，在37℃和300r/min的黑暗條件下孵育

90min。此過程結束后立即加入10mLACN：甲醇（MeOH）（5:5，v/v），然后

超聲萃取20min，并在9.0×103g離心力的條件下離心4min，收集上清液，重復

上述步驟兩次，合并上清液。將其與5mLACN飽和正己烷混合，并將樣品管快

速搖晃，渦旋3min以除去上清液中的脂肪并再次以相同離心力離心6min。然

后吸取20mL下層溶液至試管中，并于45°C下，氮吹至近干，然后用5mL水：

（ACN:MeOH）（95:5，v/v）復溶。PolySeryMAXSPE小柱（500mg，6mL）

依次用10mLMeOH和5mL超純水活化，然后將5mL復溶液（pH，10.5）上

樣，通過加入氫氧化鈉（NaOH）（10M）來調節復溶液的pH，上樣完成后，再

用5mL超純水淋洗并用真空泵泵吸以除去水分。用10mLMeOH：乙酸乙酯（EA）

（2%FA，5:5，v/v）洗脫小柱，并于45°C下，使用氮氣濃縮至近干。最后用

1.0mLMeOH復溶，并用0.22μmPTFE膜過濾，轉移至棕色進樣小瓶中，儲存

在?20°C，待UHPLC-MS/MS分析。

在水產品前處理優化實驗中，主要考察水產品樣品中鄰苯二甲酸單酯去葡萄

糖醛酸化孵育條件、不同提取溶劑、不同提取用量、不同提取時間、不同的固相

萃取柱、固相萃取柱的活化、洗脫試劑以及定容試劑對回收率的影響。

-3-

PAEs在生物體中可迅速降解為相應的單酯，然后通過P450酶轉化為親水性

葡萄糖醛酸綴合物，這給MPAEs的直接提取帶來很大困難。通過加入β-葡萄糖

醛酸酶進行去葡萄糖醛酸化將MPAEs從親水性葡萄糖醛酸綴合物中分離出來，

可實現對該問題的有效解決。實驗過程中觀察到去葡萄糖醛酸化緩沖溶液的過程

的時間和pH對酶活性有一定影響。為了最大化去葡萄糖醛酸化效率，進一步對

時間和pH等相關參數進行優化。當乙酸銨緩沖液的pH為6.5且酶解時間為90

min時，所有目標物的回收率范圍在85%~104%（如圖2.1和2.2所示）。后續的

提取實驗基于這些優化參數進行。

圖2.1乙酸銨緩沖液的pH對去葡萄糖醛酸化效率的影響

圖2.2去葡萄糖醛酸化時間對提取效率的影響

目標物提取效率與目標物極性和提取溶劑密切相關。MPAEs的結構及其較

高的lgKOW性質決定了其易溶于極性有機溶劑。根據相似互溶性原理，采用極性

較高的ACN和MeOH作為萃取溶劑。通過比較提取后化合物的響應與外部標準

校準曲線中化合物的響應，評估表觀回收率（Rapp）以選擇最佳提取溶劑。結

-4-

果顯示大多數目標分析物可以用ACN提取，Rapp范圍為81%~101%，但MMP

和MEP的提取效率明顯較差，Rapp分別僅為20%和36%（圖2.3）。而使用極性

較小提取溶劑，如EA和二氯甲烷（DCM）對目標物提取效果明顯較差，同時

這也說明MPAEs極性相對偏高。為提高MMP和MEP的提取效率，本標準用

ACN和MeOH混合萃取以期取得較好的效果。因此，通過進一步優化兩種溶劑

的比例（3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，v/v），以找到最佳提取溶劑比例。如圖2.4所

示，乙腈：甲醇（5:5，v/v）顯著提高了萃取效率。MMP和MEP的Rapp分別

達到95%和90%。因此，ACN:MeOH（5:5，v/v）被選為最優提取溶劑。同時

ACN不僅可以去除生物樣品中的蛋白質，還可在質譜檢測時減少部分電離抑制。

圖2.3提取溶液種類的優化

圖2.4ACN和MeOH混合提取溶液的比例優化

此外，為進一步提高該方法的提取效率和重現性，本實驗還對混合提取液體

積和超聲提取時間進行了優化。結果顯示，當混合提取溶劑的體積達到10mL

時，整體目標物的提取效率相對較高，Rapp為72.6%~99.6%；且相對大體積溶

-5-

劑，10mL時，既滿足了提取效率要求，又避免了試劑浪費（如圖2.5所示）。

同理，以10、15、20、30和60min梯度對超聲提取時間進行優化（如圖2.6所

示）。結果表明，對于大多數化合物，萃取效率在10~20min內顯著提高，萃取

平衡在20min內達到。重復上述步驟兩次，Rapp達到88.3%~101%。將平衡時

間進一步延長至60min未能提高萃取效率，甚至一些化合物Rapp略有下降，這

可能導致溶劑損失增加。考慮到更多溶劑損失和耗時的影響，分別選擇10mL

和20min作為最佳生物樣品的提取溶劑體積和提取時間。

圖2.5提取溶液體積對提取效率的影響

圖2.6提取時間對提取效率的影響

由于基質的異質性，生物樣品的分析極為復雜，包括色素、維生素、有機酸、

脂肪和蛋白質等多種干擾成分。海水樣品中含有鹽分、重金屬和其他可能干擾分

析實驗靈敏度和準確性的物質。實驗過程中，生物樣品前處理過程中觀察到濃縮

提取物呈淡黃色，這可能是由共存的色素、脂肪和蛋白質導致的。因此有必要對

生物和海水樣品進行凈化，以確保有效消除干擾物質，并確保盡可能保留待測試

-6-

的目標成分。SPE是一種簡單、快速、高效的純化方法，適用于多種樣品的預處

理。由于其具有回收率高、重現性好、操作靈活、富集系數高、提取干凈、選擇

性去除干擾和基質成分等優點，被廣泛應用于不同基質中痕量污染物的提取凈化。

MAXSPE柱是一種混合強陰離子交換柱，有利于弱酸性化合物的富集和樣品中

干擾雜質的去除。相比之下，HLBSPE柱是一種通用的吸附柱，可廣泛去除雜

質，已用于復雜樣品中早期的雜質去除。本實驗針對生物和海水樣品測試不同的

SPE柱，結果表明，PolySeryMAXSPE柱和Oasis?PRiMEHLBSPE柱可分別

適用于生物樣品和海水樣品中MPAEs目標化合物的富集和純化。PolySeryMAX

SPE柱需要將目標化合物溶解在強極性溶劑中，并將該復溶液的pH調節至高于

目標物的pKa，以使目標化合物完全電離，然后將其加載至Poly-SeryMAXSPE

柱。本實驗通過加標實驗優化了生物樣品復溶液的pH。結果表明，復溶液pH

為9時，目標物可從隨PolySeryMAXSPE柱流出液中流出，但當復溶液的pH

值達到10.5時（圖2.7），流出液中未檢測到目標物，這意味著此時所有目標物

可能已完全電離，并且目標物與離子交換吸附劑化學結合。

圖2.7復溶溶液pH對提取效率的影響

為進一步提高SPE小柱的萃取性能，本研究對不同洗脫劑（如2%FAACN、

2%FAMeOH和2%FAMeOH:EA（5:5,v/v））的洗脫效果進行實驗優化（圖2.8）。

-7-

圖2.8洗脫溶劑對提取效率的影響

圖2.9洗脫液的酸度對提取效率的影響

結果顯示，當使用5mL2%FAACN和2%FAMeOH作為洗脫劑時，MBZP、

MEHP、MOP和MiNP的效果不理想。這可能是由于MPAEs的極性差異或洗脫

液的量不足引起的。因此，進一步采用2%FAMeOH:EA（5:5,v/v）作為洗脫劑，

并對洗脫劑的體積進行了優化。當使用10mL2%FAMeOH:EA（5:5,v/v）時，

13MPAEs和IS的回收率良好（圖2.9）。因此，它被選為Poly-SeryMAXSPE小

柱的洗脫劑。當MAXSPE小柱洗脫體積分別達10mL時，目標化合物的Rapp

最高。因此選擇10mL作為最終的洗脫體積。

4、色譜條件

流動相：流動相A為0.1%甲酸，流動相B為0.1%甲酸乙腈。

柱溫：40℃。

流速：0.35mL/min。

進樣體積：10μL。

-8-

色譜柱：WatersACQUITYUPLC?BEHPhenyl（2.1id×100mm，1.7μm）。

在優化色譜條件時，主要考察流動相配比、不同改性劑的含量、流動相梯度

洗脫程序、流速以及不同色譜柱，獲得最佳的色譜分離條件。

色譜分離過程中，流動相和流動相改性劑的選擇對目標化合物的分離、保留

時間和靈敏度至關重要。本標準考察了流動相的組成，以選擇最佳條件。測試了

不同的溶劑和添加劑，測試結果表明，H2O+0.1%FA（流動相A）和ACN+0.1%

FA（流動相B）的組成是分析和分離MPAEs的理想組合。流動相篩選過程中，

使用ACN和MeOH作為流動相時，靈敏度幾乎沒有明顯差異。MeOH與ACN

相比可能會導致更高的系統壓力[133]，因此選擇ACN作為流動相。測試初始流動

相A和流動相B的不同比例（90:10、80:20、70:30和60:40，v/v），由于13種

MPAEs結構和極性存在差異，利用梯度洗脫來實現最佳分離，并在梯度比例運

行后，流動相A和流動相B在90:10時獲得了較好的分離效率。然而，MMP、

MEP和MCPP的靈敏度較低，因此進一步對流動相改性劑的類型和含量進行優

化以提高化合物的靈敏度。甲酸銨和甲酸作為首選改性劑，結果表明化合物在甲

酸條件下有著較高的靈敏度，可能是pH可以改變化合物的電離效率，并且偏酸

性的流動相更易提高ESI-模式下目標化合物的響應。為確定目標物達到最大響應

時甲酸的濃度，設計梯度實驗（0.1%、0.15%和0.2%，v/v）來驗證。當甲酸濃

度為0.1%（v/v）時，所有化合物的靈敏度最高。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

此外，實驗過程中對梯度洗脫程序最終調節時間（至少1.5min）進行優化，可

提高目標檢測化合物保留時間的再現性。

表1液相色譜流動相線性梯度洗脫程序

時間（min）流速（mL/min）流動相A(%)流動相B（%）

00.359010

0.30.359010

10.352080

20.351090

3.50.35595

40.359010

60.359010

在色譜柱的選擇方面，使用XBridgeC18（2.1id×150mm，3.5μm）和UHPLC

XB-phenyl（2.1id×100mm，1.8μm）色譜柱，調節色譜條件，分離效果始終不

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理想。選用WatersACQUITYUPLC?BEHPhenyl色譜柱，調節色譜條件后，分

離效果和峰形都很好。13種鄰苯二甲酸單酯及其內標標準工作溶液液相色譜-串

聯質譜色譜圖見圖10。

-10-

圖10目標化合物標準工作溶液液相色譜-串聯質譜色譜圖

5、質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）。

掃描方式：負離子掃描。

離子噴霧電壓：5500V。

離子源溫度：500℃。

多離子反應監測方式（MRM）。

在優化質譜條件時，首先選擇合理的內標物質，在本文件中，氘代鄰苯二甲

酸單甲酯、鄰苯二甲酸單乙酯、鄰苯二甲酸單異丁酯、鄰苯二甲酸單正丁酯、鄰

苯二甲酸單環己酯、鄰苯二甲酸單芐基酯、鄰苯二甲酸單辛酯、鄰苯二甲酸單異

-11-

壬酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯、鄰苯二甲酸單（3-羧基丙基）酯、鄰苯

二甲酸單（2-乙基-5-酮基己基）酯、鄰苯二甲酸單（2-乙基-5-羥基己基）酯、鄰

苯二甲酸單（2-乙基-5-羧基戊基）酯作為鄰苯二甲酸單酯的內標物質。

此外，對目標化合物的母離子、子離子、碰撞能量等進行優化，確定最佳質

譜條件。對1.0μg/mL各鄰苯二甲酸單酯及其內標物標準溶液以流動注射泵進樣

方式在正離子模式下進行母離子全掃描，確定每種化合物的準分子離子，然后分

別以其準分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，在碎片離子中選擇合適的

定性離子和定量離子，各目標化合物最后采用多反應監測正離子模式，優化各種

質譜參數，確定最佳監測條件。13種鄰苯二甲酸單酯及其內標物的多反應監測

條件見表3。

表3目標化合物的多反應監測條件

化合物母離子(m/z)錐孔電壓(V)子離子(m/z)碰撞電壓(V)

MMP179.11077,107*27,10

MMP-D4183.14281*,111.116,10

MEP193.13877.1*,121.118,14

MEP-D4197.14081.1*,150.118,12

MOP277.1277,127.1*18,16

MOP-D4281.14681.1,127.1*20,16

MiBP221.14077*,134.120,12

MiBP-D4225.15280.9*,138.122,18

MnBP221.11577*,149.115,10

MnBP-D4225.14671,81*12,20

MiNP291.24877,141.1*20,18

MiNP-D4295.24881.1,141.1*22,16

MCPP251.124103*,16510,14

MCPP-D4255.114102.9*,168.98,12

MCHP247.14477,97*18,14

MCHP-D4251.15281,97*24,18

MBZP255.14277*,183.116,12

MBZP-D4259.14677.1*,107.120,12

MEHP277.138127.1,134.1*18,14

MEHP-D4281.25280.9,138.1*34,20

MECPP307.140113.1,159.1*28,12

MECPP-D4311.130113.1,159.130,12

MEHHP293.115121*,145.118,13

MEHHP-D4297.24125.1,145.1*18,14

MEOHP291.150113.1,143.1*20,14

MEOHP-D4295.148125.1,143.1*20,14

-12-

注：帶*的為定量離子

6、標準曲線范圍

取一定量13種鄰苯二甲酸單酯及其內標標準使用液于2mL進樣瓶中，制

備至少5個點標準系列，鄰苯二甲酸單酯在各點的質量濃度分別為1.0μg/L、5.0

μg/L、10.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L和200.0μg/L（參考濃度），內標的質量

濃度均為80.0μg/L。

由低濃度到高濃度依次對標準系列溶液進樣，以標準系列溶液中目標組分的

質量濃度為橫坐標，其對應的峰面積（或峰高）與內標物峰面積（或峰面積）的

比值乘以內標物濃度的乘積為縱坐標，繪制校準曲線。

7、結果計算與表示

（1）定性分析

按照表3中確定的母離子和子離子進行檢測，在相同的實驗條件下，樣品中

的鄰苯二甲酸單酯保留時間與標準樣品中鄰苯二甲酸單酯的保留時間相對標準

偏差小于2.5%，且在樣品中譜圖中的定性離子的相對豐度（Ksam）與濃度相近的

標準溶液譜圖中對應的定性離子相對豐度（Ksam）偏差不超過表4的范圍，則可

判定樣品中存在鄰苯二甲酸單酯。

Ksam=100%..................(1)

?2

式中：

?1×

Ksam—樣品中鄰苯二甲酸單酯定性離子的相對豐度，%；

A2—樣品中鄰苯二甲酸單酯定性離子對的峰面積（或峰高）；

A1—樣品中鄰苯二甲酸單酯定量離子對的峰面積（或峰高）。

Kstd=100%..................(2)

????2

式中：

????1×

Kstd—標準溶液中鄰苯二甲酸單酯定性離子的相對豐度，%；

Astd2—標準溶液中鄰苯二甲酸單酯定性離子對的峰面積（或峰高）；

Astd1—標準溶液中鄰苯二甲酸單酯定量離子對的峰面積（或峰高）。

表4定性確認時相對離子豐度的最大允許偏差

KstdKstd＞5020＜Kstd≤5010＜Kstd≤20Kstd≤10

-13-

Ksam相對于Kstd

的最大允許偏±20%±25%±30%±50%

差

（2）定量分析

該方法中標準工作溶液和樣液中鄰苯二甲酸單酯的響應值均應在儀器的檢

測線性范圍內。

按下列公式（3）計算出水產品中鄰苯二甲酸單酯的含量：

X=..................(3)

??×?

式中：

?0

X—樣品中鄰苯二甲酸單酯的含量（μg/L）；

Ci—樣品制備液中鄰苯二甲酸單酯的含量（μg/L）；

V—最終定容體積（mL）；

V0—測定樣品體積（mL）。

（3）結果表示

當測定結果小于1.0μg/L時，保留至小數點后三位；當測定結果大于或等于

1.0μg/L時，保留三位有效數字。

8、精密度和準確度

（1）精密度

使用鄰苯二甲酸單酯對水產品樣品進行統一加標，加標濃度分別為0.04μg/L、

0.2μg/L和0.4μg/L，加標樣進行6次重復測定，設置3個批次，實驗結果見表5。

表5方法的精密度和準確度

加標濃度5μg/kg加標濃度20μg/kg加標濃度80μg/kg

MPAEs平均回收率平均回收率RSD平均回收率RSD

RSD（%）

（%）（%）（%）（%）（%）

MMP98.97.5101.23.592.95.3

MEP95.810.498.61.491.85.7

MiBP95.25.496.41.798.17.3

MnBP97.13.396.02.691.07.8

MCHP99.53.4102.36.599.81.5

MCPP99.85.995.09.797.87.2

MBZP90.86.9101.13.595.48.8

MOP99.81.499.72.6100.12.4

MEHP99.33.198.96.694.85.2

MiNP95.48.697.14.489.67.8

MEOHP99.44.099.31.397.98.3

-14-

MEHHP95.43.296.22.387.78.9

MECCP97.77.899.82.195.26.2

本文件中各藥物的批內變異系數≤15%，批間變異系數≤15%。

（2）準確度

對水產養殖生物進行加標回收實驗，加標濃度分別為5μg/kg、20μg/kg和

80μg/kg，實驗結果見表5。整體而言，本方法鄰苯二甲酸單酯的回收率均能滿

足日常檢測的需求。

9、靈敏度

將鄰苯二甲酸單酯加入實際水產養殖生物樣品中，經過前處理富集、凈化后，

經過HPLC-MS/MS檢測，按信噪比為S/N=3、S/N=10，估算方法檢出限和定量

限，13種鄰苯二甲酸單酯見表6。

表6方法的檢出限和定量限

檢出限定量限

MAPEs相關系數基質效應

（μg/kg）（μg/kg）

MMP0.99790.990.882.93

MEP0.99921.060.812.70

MOP0.99970.930.230.78

MiBP0.99901.030.120.41

MnBP0.99940.990.311.04

MiNP0.99981.070.210.69

MCPP0.99951.020.531.77

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