ICS71.100.70

CCSY42

GDCA

廣東省化妝品學會團體標準

T/GDCA009—2022

化妝品原料重組可溶性膠原蛋白

CosmeticIngredientRecombinantSolubleCollagen

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

廣東省化妝品學會??發布

T/GDCA009—2022

化妝品原料重組可溶性膠原蛋白

1范圍

本文件規定了重組可溶性膠原蛋白的質量控制要求、檢測指標與方法、穩定性驗證、包裝儲運方法

等，并規定了一種重組可溶性膠原蛋白生物學活性的測定方法和定量標準。

本文件適用于作為化妝品原料的重組可溶性膠原蛋白的質量控制與活性檢測。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T191包裝儲運圖示標志

GB/T601化學試劑標準滴定溶液的制備

GB/T602化學試劑雜質測定用標準溶液的制備

GB/T603化學試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備

GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法

YY/T1849-2022重組膠原蛋白

T/SHRH031-2020化妝品緊致、抗皺功效測試-體外成纖維細胞Ⅰ型膠原蛋白含量測定

化妝品安全技術規范（2015年版）（國家食品藥品監督管理總局公告2015年第268號）

重組膠原蛋白生物材料命名指導原則（國家食品藥品監督管理總局公告2021年第21號）

中華人民共和國藥典

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

膠原蛋白collagen

一類含有至少20種在遺傳學上不同類型的分泌蛋白質家族，主要擔任機體的結構支撐功能，具有

獨特的由三條多膚鏈(被稱為α鏈)組成的三螺旋構型，并具有一定的生物學功能。

重組膠原蛋白recombinationsolublecollagen

采用重組DNA技術，對編碼所需人膠原蛋白質的基因進行遺傳操作和(或)修飾，利用質粒或病毒載

體將目的基因帶入適當的宿主細胞(細菌、酵母或其他真核細胞等)中，表達并翻譯成膠原蛋白(3.1)或

類似膠原蛋白(3.1)的多肽，經過提取和純化等步驟制備而成。

可溶性膠原solublecollagen

用于化妝品原料的可溶于水的膠原蛋白(3.1)或類似膠原蛋白(3.1)的多肽。

4質量控制

通則

重組可溶性膠原蛋白，由于不同膠原蛋白亞型、不同氨基酸序列、不同表達體系等差異，不具有統

一的產物。與天然膠原蛋白相比，氨基酸組成、分子量大小和(或)結構可能差異很大，甚至是個全新的

蛋白質，可以是單一亞型全長氨基酸序列的重組人膠原蛋白，也可以是將兩種或多種亞型嵌合的重組人

源化膠原蛋白，或者與天然膠原蛋白氨基酸序列同源性較低的重組類膠原蛋白。

1

T/GDCA009—2022

重組膠原蛋白的質量控制與分子量大小、結構特性、質量屬性復雜程度以及生產工藝相關。本文件

涉及到的質量控制體系為化妝品原料成品檢測，在生產過程中的原輔料質量控制、生產工藝和過程控制

應確保各類雜質已去除或降低至可接受水平。

分類與命名

參照《重組膠原蛋白生物材料命名指導原則》（國家食品藥品監督管理總局公告2021年第21號），

將重組可溶性膠原蛋白分為重組人膠原蛋白、重組人源化膠原蛋白、重組類膠原蛋白三種。

劑型

根據重組可溶性膠原蛋白的形態，可分為溶液、凝膠、粉末與海綿狀固體等不同劑型。其中粉末與

海綿狀固體應為溶液劑型經冷凍干燥等工藝制得。

質量要求

4.4.1感官評價

重組可溶性膠原蛋白的感官評價標準見表1。

表1感官評價指標

檢測項目要求

外觀白色至淡黃色溶液、凝膠、粉末或海綿狀固體

氣味無或略有特征性氣味

雜質無肉眼可見明顯異物

4.4.2理化性質

重組可溶性膠原蛋白的理化性質標準見表2。

表2理化性質指標

檢測項目要求

純度≥85%

蛋白含量標示量的90%～110%

分子量質譜法為理論計算值±10%；電泳法為理論計算值±10kD

pH值5.0～8.0

4.4.3安全性

重組可溶性膠原蛋白的安全性標準見表3。

2

T/GDCA009—2022

表3安全性指標

檢測項目要求

菌落總數(CFU/mL或CFU/g)≤100

霉菌和酵母菌總數(CFU/mL或CFU/g)≤10

耐熱大腸菌群(mL或g)

銅綠假單胞菌(mL或g)不得檢出

金黃色葡萄球菌(mL或g)

鉛（mg/kg）≤10

汞（mg/kg）≤1

砷（mg/kg）≤2

鎘（mg/kg）≤5

4.4.4穩定性

重組可溶性膠原蛋白的穩定性受多種因素影響，包括純化工藝、微生物負載、包裝貯存條件等。重

組可溶性膠原蛋白原料的穩定性主要受溫度影響，即熱穩定性，其性質可能會直接影響預期用于化妝品

的安全性和有效性，因此，應對其熱穩定性進行動態評價和分析。

重組可溶性膠原蛋白的穩定性標準為，進行熱穩定性檢測后，肉眼觀察無可見析出物或凝膠化。

4.4.5生物學活性

重組可溶性膠原蛋白的生物學活性是指與天然膠原蛋白功能相關的生物學作用。膠原蛋白是皮膚真

皮層細胞外基質的主要成分，主要生物學功能是為細胞提供支架和良好的微環境，如促進細胞黏附、增

殖等，并能夠促進皮膚成纖維細胞合成分泌細胞外基質蛋白。因此，可通過評價細胞-膠原蛋白相互作

用或成纖維細胞合成分泌細胞外基質蛋白能力來評價重組可溶性膠原蛋白的生物學活性。

進行測定的任意一個或多個生物學活性指標中，重組可溶性膠原蛋白處理組與未經處理的對照組相

比，表現出具有統計學意義的提升效果，可表明重組可溶性膠原蛋白具有生物學活性。

5檢測方法

本文件所用試劑和水，在沒有注明其他要求時，均指分析純試劑和GB/T6682規定的一級水。實驗

中所用標準溶液、制劑及制品，參引《中華人民共和國藥典》2020版四部的，均按《中華人民共和國藥

典》2020版四部的規定制備?！吨腥A人民共和國藥典》2020版四部方法外的試劑配制方法參照GB/T601、

GB/T602、GB/T603方法配制標定。

外觀與氣味

自然光下肉眼直接觀測，嗅聞氣味，應符合表1要求。

雜質

溶液樣品直接取樣，凝膠樣品可根據粘稠度加水稀釋后取樣，粉末與海綿狀固體樣品稱取適量加水

制成適當濃度的待測溶液，將樣品置于比色管內，自然光下肉眼直接觀察，應無肉眼可見異物。

純度

3

T/GDCA009—2022

按照YY/T1849-20225.4中規定的方法進行測定。

蛋白含量

按照YY/T1849-20225.6中規定的方法進行測定。

分子量

按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0541電泳法第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

法（SDS法）或按照YY/T1849-2022中、描述的方法（高效液相色譜法、質譜法）

進行檢測。

pH值

按《化妝品安全技術規范》2015年版第四章1.1pH值中方法測試，溶液和凝膠樣品可采用直測法測

定，粉末與海綿狀固體樣品用水制成1mg/mL待測溶液進行測定。

菌落總數

參照《化妝品安全技術規范》2015版規定的方法檢驗。

霉菌和酵母菌總數

參照《化妝品安全技術規范》2015版規定的方法檢驗。

耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌

參照《化妝品安全技術規范》2015版規定的方法檢驗。

鉛、汞、砷、鎘的測定

參照《化妝品安全技術規范》2015版規定的方法檢驗。

穩定性測定

將各劑型重組可溶性膠原蛋白以水配制成10mg/mL溶液，置于（60±0.5）℃水浴中保持4h，應滿

足肉眼觀察無可見析出物或凝膠化。

與穩定性相關的工藝驗證宜采用連續三批次重組可溶性膠原蛋白進行。在相關工藝條件無變化時，

每年宜進行至少一個批次產品的穩定性檢驗。在工藝條件有變化時,應考慮對重組可溶性膠原蛋白穩定

性的影響，必要時進行再次驗證。

生物學活性測定

細胞增殖、黏附等細胞活性可按照YY/T1849-20225.4中規定的方法進行測定。成纖維細胞合成分

泌I型膠原蛋白能力可按照T/SHRH031-2020中方法進行測定。成纖維細胞合成分泌其他細胞外基質蛋白

能力可以以熒光定量PCR法進行測定，具體實驗方法見附錄A。

6包裝、運輸和貯存

溫度

作為蛋白制品，重組可溶性膠原蛋白貯存和運輸過程中的溫度條件與劑型有關，溶液劑型貯存與運

輸環境為-20～-18℃，凝膠劑型貯存與運輸環境為4～8℃，粉末與海綿狀固體可在常溫下短時間貯存與

運輸，長時間貯存應在4～8℃環境中。

標志

產品銷售包裝圖示標志應按GB/T191執行，標注內容為：產品名稱、商標（如有）、保質期（用生

產日期、保質期或生產批號、限期使用日期等方式組合表示）、生產者名稱、地址、凈含量、執行標準

號以及根據產品特點所應標注的其他內容。

包裝

4

T/GDCA009—2022

產品采用適宜要求包裝，產品根據用戶要求包裝。

運輸

產品屬于非危險品，在運輸時應防火、防熱、防雨淋、防受潮。

貯存

避光、密閉，避免陽光直射。

保質期

在符合規定的運輸和貯存條件下，產品在包裝完整和未啟封的情況下，保質期按銷售包裝標注執行。

5

T/GDCA009—2022

A

A

附錄A

（規范性）

生物學活性測定—熒光定量PCR法

熒光定量PCR法是對細胞中目的基因的mRNA水平實現定量檢測的方法。以mRNA反轉錄出的cDNA作為

模板，在含有特異性結合DNA雙鏈的熒光染料與目的基因的特異性引物的體系中進行PCR擴增，得到的CT

值與模板起始拷貝數的對數呈線性負相關，根據CT值結果，可以計算出模板DNA的起始拷貝數，實現對

目的基因的相對定量。

A.1材料與試劑

實驗中用到的細胞首選人皮膚成纖維細胞系（如BJ）或小鼠胚胎成纖維細胞系（如NIH/3T3）;其他

成纖維細胞或細胞系也可用于本試驗；但應證明其等同性。

實驗中用到的試劑包括：TRIzol試劑、一步法反轉錄試劑盒、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒、DEPC-

水、無水乙醇、氯仿、異丙醇。

實驗中用到的主要設備包括：高速冷凍離心機、全波長酶標儀、熒光定量PCR儀。

A.2實驗方法

A.2.1細胞處理

A.2.1.1細胞在正常生長條件下培養至豐度約70%后，更換為不含血清的培養基，饑餓培養4小時。

A.2.1.2將配制好的膠原蛋白樣品以適當濃度添加入細胞培養基中，培養24小時。

A.2.2細胞內總RNA提取純化

A.2.2.1取培養的細胞吸除培養基，使用預冷的PBS洗兩次，加入1mLTRIzol試劑，吹打收集到離

心管中，室溫放置5分鐘。

A.2.2.2向離心管中加入200μL氯仿，渦旋振蕩器震蕩離心管15秒，靜置10分鐘后，4℃下12000g

離心15分鐘。

A.2.2.3離心后液體分層，RNA存在于上層無色透明的水相層中，體積約600μL，轉移至新的離心管

后，加入500μL異丙醇，緩慢上下顛倒幾次混勻，靜置15分鐘后，4℃下12000g離心10分鐘。

A.2.2.4離心后RNA沉淀于離心管底部，面對光源可見為膠狀沉淀，吸除上清后，加入1mL75%乙醇

洗滌RNA，4℃下12000g離心5分鐘。

A.2.2.5吸除乙醇上清，靜置5分鐘干燥RNA，加入20μLDEPC-水溶解RNA。

A.2.2.6提取出的RNA在-80℃可以暫存1個月，需盡快完成以下2.3與2.4步驟。

A.2.3RNA濃度測定

A.2.3.1將提取的RNA取1μL，加入到99μLDEPC-水中，使總體積為100μL。將稀釋后的RNA溶液

加入到96孔UV紫外板中。

A.2.3.296孔版放入全波長酶標儀中，選擇待測區域，設置程序為：震蕩10秒、測定260nm吸光值、

測定280nm吸光值，讀取數值。

A.2.3.3計算OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之間時表明提取的RNA質量滿足后續需要。

A.2.3.4根據公式OD260×0.04×稀釋倍數，計算得到RNA溶液濃度，單位為μg/μL。以DEPC-水稀

釋調整RNA濃度至1μg/μL。

A.2.4反轉錄（注：試劑盒可能不同，按實際使用的試劑盒說明書配置反轉錄體系與反應程序）

A.2.4.1使用反轉錄試劑盒，在200μL的PCR管中配制反轉錄體系：

a)濃度為1μg/μL的RNA溶液，1μL；

6

T/GDCA009—2022

b)5×qRTSuperMix，4μL；

c)預混酶溶液，1μL；

d)DEPC-水，14μL。

反轉錄體系終體積為20μL，使用移液器輕輕吹打混勻，掌上離心機短暫離心30秒。

A.2.4.2將反轉錄體系PCR管放入RCR儀中，設置反應程序：

——50℃處理15分鐘；

——85℃處理10秒鐘。

體系中的mRNA被反轉錄為cDNA。

A.2.4.3反轉錄出的cDNA能夠作為后續熒光定量PCR反應的模板，對目標分子進行基因水平的檢測。

cDNA在-20℃可以保存6個月，在-80℃可以長期保存。

A.2.5引物設計與特異性驗證

A.2.5.1引物設計使用美國國家生物技術信息中心（NCBI）網站的Primer-BLAST功能在線完成

（/tools/primer-blast）。

A.2.5.2設計引物應遵循以下原則：

——目的產物的長度為150-250個堿基；

——引物長度范圍為18-25個堿基；

——退火溫度在58℃-62℃之間；

——GC含量在40%-60%之間；

——不含有連續的4個及以上相同的堿基；

——引物自身配對堿基少于3個。

A.2.5.3對于每個目標分子，設計3對不同引物，由生物公司進行合成。

A.2.5.4收到合成好的引物后，需先按照下文2.5步驟進行引物特異性進行驗證，滿足擴增效率En

大于0.9，CT值在35以內，熔解曲線峰型單一且峰值溫度在80℃以上的引物，可以用來進行熒光定量

PCR試驗。

本標準中用于生物學活性測定的已驗證引物信息如表A.1所示。其中全大寫斜體基因名代表人源基

因（如COL1A1），首字母大寫斜體基因名代表鼠源基因，并在前加注m標示（如mCOL1A1）。引物名稱

后的F代表正向（Forward）引物，R代表反向（Reverse）引物。

表A.1已驗證的引物信息

引物名稱引物序列Tm（℃）目的片段長度(bp）

COL1A1-F5’-CCCCGAGGCTCTGAAGGT-3’60.0140

COL1A1-R5’-GCAATACCAGGAGCACCATTG-3’57.8

COL3A1-F5’-CCTCCAACTGCTCCTACTCG-3’62.0172

COL3A1-R5’-GACCAGTAGGGCATGATTCACA-3’59.1

ATCB-F5’-GAGAAAATCTGGCACCACACC-3’57.8176

ATCB-R5’-GATAGCACAGCCTGGATAGCA-3’57.8

mCol1a1-F5’-ATGCTTGATCTGTATCTGCCACA-3’56.6171

mCol1a1-R5’-CCCTTGGGTCCCTCGACT-3’60.0

mCol3a1-F5’-GAAAGAGGATCTGAGGGCTCG-3’59.8141

mCol3a1-R5’-GGGTGAAAAGCCACCAGACT-3’62.0

mActb-F5’-CGCTGCGCTGGTCGT-3’56.2123

mActb-R5’-CCCACCATCACACCCTGG-3’60.0

7