DB37Identificationofcaprine，sheepandbovinederReal-timefluorescentPCRmet山東省市場監督管理局發布I 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 5 71羊奶中羊、牛源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法GB/T6682分析實驗室用水規格GB/T27403實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測根據線粒體16SrDNA基因在不同物種間保守區設計通用引物，在可變區設計物種特異性探針，采用25.2材料103.4KPa蒸汽壓（121℃)滅菌20min，降至室溫，4℃保存備用。0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉（pH6.4振蕩型恒溫金屬浴：0℃~100℃。36.6低溫冰箱：-20℃~4℃。6.9容量瓶：10mL，50mL首先收集白細胞：取液態羊奶2mL，或者奶粉20mg溶于2ml無菌水中，每個樣品設立2個平行樣,將樣品于4℃、2500g離心30min；棄去離心管的上層乳脂和中間層乳液，保留其底部沉淀，向底部加lmLpH7.4滅菌的PBS緩沖液，將底部沉淀吹打懸浮并轉移至1.5mL的離心管中，離心力3500g，43000g離心1min，取出PCR9試驗數據處理9.2檢測結果分析和表述則需要加大模板量進行PCR反應。若再次擴增5A.1實時熒光定性PCR引物和探針序列AAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTAGATTGCGCTGTTATCCCTAGGACCGTTACCGAGTCCAGGTG5’ROX-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGN-P5’JOE-ACAATCTCCATGAGTTGGTAGTTTCG5’CY5-CGACGGTCCTTTCTAATGTTGCGTCA.2實時熒光PCR反應體系加量(μL）Mix221-3ng/μL2A.3對各種樣品檢測結果的判定6+-+未檢出牛源性成分或含-+未檢出羊源性成分或含++檢出牛和羊源性成分未檢出牛和羊源性成分--如果同時進行的陽性對照實驗結果正常，檢測實際樣品時只有CY5熒光檢出，無JOE、ROX---PCR反應失敗。注意以下幾個方面后再次進行7B.1山羊（Caprahircus）PCR產物序列（GenBank:KY52351山羊（Caprahircus）PCR產物序列（GAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACTAGTCCAAAAGAAATAAATTTAACCACTAAGGGATAACAACATCCTTTAACTAGCAGTTTTGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAAGAGATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTTACAAGTCAAATCAAATTGCTTATTGATCCAAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCB.2綿羊（Ovisaries）PCR產物序列（GenBank:KP702285.綿羊（Ovisaries）PCR產物序列（GenBank:KP7022AAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAAGTAACTCAAGGAAAATAAATTCAACCACCAAGGGATAACAACACTCCTTAGTTAACAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAACAGAAAATCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACTAACAAGTCAAACCAGCTTATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTTAACTAACCAACCCAAAGAGAATAAATTTAACCATTAAGGAGTAACAACAATCTCCAGTTGGTAGTTTCGGTTGGGGTGACCTCGGAGAATAAAAAACCCTCCGAGCGATTTTAAAGACTAGACCCACAAGTCAAATCAGCTCATTGATCCAAAAACTTGATCAACGGAACAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGACCGTTACCGAGTCCAGGTGAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGACGACGGTCCTTTCTAATGTGAA