DB37DB37/T2841—2016鴨坦布蘇病毒半套式RT-PCR檢測方法山東省質量技術監督局發布IDB37/T2841—2016本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由山東省畜牧獸醫局提出。本標準由山東省畜牧業專業標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：山東農業大學。本標準主要起草人：刁有祥、唐熠、陳浩、馮強、提金鳳。1DB37/T2841—20161范圍2.1儀器3.1試劑3.1.2rTaqDNA聚合酶(5U/μL);3.1.6dNTPs(2.5mmol/L,10mmol/L);3.1.81.5%瓊脂糖凝膠，見A.1;3.1.10溴化乙錠(10μg/μL),見A.3;3.1.11核酸電泳加樣緩沖液，見A.4;3.1.12商品化的DNA分子量標準，要求在100bp~2000bp之間，有5條以上的指示條帶；2DB37/T2841—2016檢測所需引物下游內側引物5371R:5'-CCAAAGTTGGCYCCCATCTC-3’;下游外側引物5861R:5'-AGCACACGGCAATCTCAT-3’,擴增片段長度為277bp。4操作程序死亡鴨采集卵泡膜、脾和腦等組織樣品，進行分別處理或同時處理；活鴨采集咽喉或泄殖腔拭子。樣品應放在含有抗生素的pH值7.0~7.4的等滲磷酸鹽緩沖液(PBS,附錄B.1)內(無PBS可用25%~7.0~7.4。在室溫放置1h~2h內樣品應盡快處理，不能處理的可在4℃存放24h,也可于低溫條件下酸鹽緩沖液中；研碎的組織用含抗生素pH值7.0~7.4的等滲PBS溶液配成10%～20%(g/mL)的懸液。樣4.2對照設置每次檢測，用相應的陽性對照標準品和陰性對照標準品，至少設置一個或一個以上的陰性對照和陽性對照。4.3RNA提取按照RNA提取試劑盒說明書，提取樣品和對照的RNA。提取的RNA應隨時檢測，否則應于-70℃凍存。μL,M-MLV反轉錄酶1μL,共10μL。3DB37/T2841—20164.6PCR反應4.6.1第一次PCR反應10×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物5455F(100μm4.6.1.2PCR反應條件94℃預變性5min;94℃30s,50℃30s,72℃30s,進行30個循環；72℃延伸5min。4.6.2.1套式PCR反應體系10×PCRbuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,引物5455F(100μmol/L)和5731R(100μmol/L)4.6.2.2PCR反應條件94℃預變性5min,94℃30s,50℃30s,72℃30s,進行30個循環；72℃延伸5min。。4.7套式PCR產物電泳套式PCR反應結束后，取9μL樣品與1μL核酸電泳加樣緩沖液混勻后，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，時，每隔10min觀察一次。當加樣緩沖液中溴酚藍電泳過半至凝膠下2/5處時，可停止電泳)。電泳后，4.8結果判定陽性對照出現相應大小的擴增條帶，且陰性對照無此擴增條帶時，判定檢測有效；否則判定檢測結坦布蘇病毒半套式PCR產物的大小為277bp。如果在陽性對照出現277bp擴增條帶，陰性對照無條帶出現(引物二聚體除外)時試驗成立。被檢樣品出現277bp條帶為坦布蘇病毒陽性，否則為陰性(附4(規范性附錄)相關試劑的配制A.11.5%瓊脂糖凝膠的配制瓊脂糖1.5g0.5×TAE電泳緩沖液加至100mL微波爐中完全融化，待冷至50℃~60℃時加入溴化乙錠(EB)溶液5μL,搖勻。倒入電泳板上，凝固后，取下梳子，備用。A.21×TAE電泳緩沖液的配制A.2.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(pH8.0)mL乙二胺四乙酸二鈉mL滅菌雙蒸水mL氫氧化鈉調pH至滅菌雙蒸水加至mL用于配制A.2.2中的50×TAE電泳緩沖液A.2.2配制50×TAE電泳緩沖液羥基甲基氨基甲烷(Tris)冰醋酸0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na?)溶液(pH8.0)滅菌雙蒸水加至A.2.3配制1×TAE電泳緩沖液50×TAE電泳緩沖液滅菌雙蒸水加至A.3溴化乙錠的配制溴化乙錠滅菌雙蒸水加至20mgA.4核酸電泳加樣緩沖液(10×)聚蔗糖滅菌雙蒸水242100gmLmLmL5DB37/T2841—2016溴酚藍二甲苯青6DB37/T2841—2016附錄B(規范性附錄)試劑的配制Na?HPO?·12H?OKH?PO?雙蒸餾水加