色譜分析導(dǎo)論色譜法及其分類色譜流出曲線和術(shù)語色譜分析基本原理1色譜法及其分類（1）定義：

色譜法是一種物理化學(xué)分離和分析方法。它是基于物質(zhì)溶解度、蒸汽壓、吸附能力、立體化學(xué)或者離子交換等物理化學(xué)性質(zhì)的微小差異，使其在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同。當(dāng)兩相做相對運動時，被分離物質(zhì)在兩相之間進(jìn)行反復(fù)多次分配，這樣原來微小的分配差異產(chǎn)生了很大的效果，使各組分分離，從而達(dá)到分離、分析以及測定一些物理化學(xué)常數(shù)的目的。（2）歷史：色譜法最早是由俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）于1906年提出的?，F(xiàn)代色譜方法的分離與檢測是在線連續(xù)進(jìn)行，記錄時間－組分濃度信號圖即色譜圖。固定相流動相（3）分類：

（a）按照流動相和固定相物態(tài)分：氣相色譜：氣-固，氣-液液相色譜：液-固，液-液超臨界流體色譜

（b）按照分離原理分：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜凝膠色譜、生物親和色譜

（c）按照分離系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)形狀分：柱色譜、毛細(xì)管色譜、平板色譜

（d）按照展開程序分：洗脫法、頂替法、迎頭法洗脫法吸附或溶解能力比樣品弱的物質(zhì)作為流動相，利用組分在固定相上溶解能力不同實現(xiàn)分離。洗脫法樣品流出曲線大部分色譜過程采取這種方法。樣品區(qū)帶呈高斯分布。tA頂替法在惰性流動相中加入對固定相吸附或者溶解能力比所有組份都強的物質(zhì)為頂替劑（或者直接用頂替劑做流動相。適合于制備純物質(zhì)或者濃縮分離某一組份，缺點是每經(jīng)一次使用后，必須更新柱子頂替法樣品流出曲線迎頭法是將試樣混合物連續(xù)通過色譜柱。除第一組份外均非純物質(zhì)，因此僅適用于從含微量雜質(zhì)的混合物中切割出一個純組份。迎頭法樣品流出曲線2色譜流出曲線和術(shù)語非滯留組分基線色譜峰峰高區(qū)域?qū)挾龋簶?biāo)準(zhǔn)偏差

；半峰寬W1/2；峰底寬W（W1/2=2.354

；W=4

）

保留值：死時間tm；保留時間tR；調(diào)整保留時間tR’；死體積Vm；保留體積VR；調(diào)整保留體積VR’相對保留值分離度

由色譜峰流出曲線可以實現(xiàn)以下目的：

依據(jù)保留值進(jìn)行定性；依據(jù)峰面積或者峰高進(jìn)行定量分析；依據(jù)保留值以及峰寬評價色譜柱的分離效能3色譜分析基本原理問題：色譜峰為什么是這種形狀？不同物質(zhì)為什么保留值不同？相鄰的峰分離效果如何表示？和什么因素有關(guān)？如何提高分離速度？

……樣品在色譜柱內(nèi)運行有兩個基本特點：不同組分分子差速遷移-物質(zhì)在兩相中的分配平衡，熱力學(xué)同種組分分子分布離散-物質(zhì)在流動相、固定相中的擴(kuò)散和運輸速率以及柱外效應(yīng)，動力學(xué)色譜學(xué)研究的兩個基本問題：熱力學(xué)、動力學(xué)（1）分配過程流動相固定相V色譜柱內(nèi)的分配平衡相轉(zhuǎn)移力：熱力學(xué)理論告訴我們，自發(fā)過程總是向自由能減少的方向進(jìn)行的。而化學(xué)勢（偏摩爾自由能）可以用來判斷相變化和化學(xué)變化的方向，即物質(zhì)總是從化學(xué)勢高的狀態(tài)變到化學(xué)勢低的狀態(tài)，直至化學(xué)勢相等即達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，組分在兩相之間的化學(xué)勢之差就是發(fā)生相轉(zhuǎn)移變化的推動力。溶質(zhì)在流動相和固定相中的化學(xué)勢分別為：平衡狀態(tài)下溶質(zhì)在兩相中的化學(xué)勢相等，即由于色譜體系中溶質(zhì)量很小，一般做稀溶液處理，活度可以用濃度C代替，從而可得到：分配系數(shù)K：

定義為組分在固定相中和流動相中的濃度之比，因此有：（1-5）

物質(zhì)的化學(xué)勢實際上等于其偏摩爾自由能，因此可得：（1-6）

分配系數(shù)K是溶質(zhì)在兩相中的分布平衡性質(zhì)的量度，反映了溶質(zhì)和固定相、流動相作用力的差別，它決定于流動相、固定相和溶質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，而和色譜柱特性以及儀器無關(guān)。分配比色譜學(xué)中用到的描述溶質(zhì)在固定相和流動相之間分布特性的另一個重要的參數(shù)是分配容量k’，也叫容量因子，分配比，容量比。相比

（1-8）

相比與填料的顆粒度、表面積、固定相的用量、填充的情況等因素有關(guān)?。?）保留值保留值是組分在色譜柱內(nèi)滯留行為的一個指標(biāo)，與分配過程有關(guān)，受熱力學(xué)和動力學(xué)因素的控制。保留時間、保留體積等。

基本保留方程為：

組分在色譜柱內(nèi)停留的時間tR可以看成兩部分：停留在流動相里面的時間t0–受流動相流速的影響，與組分的分配保留無關(guān)停留在固定相里面的時間t0

k’–決定于分配比，即分配系數(shù)以及色譜柱的結(jié)構(gòu)參數(shù)相對保留值：代表固定相對兩組分的分離能力即分離選擇性的大小。取決于：固定相性質(zhì)與流動相性質(zhì)柱溫

（3）色譜過程基本理論色譜過程理論需要解決的問題：組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？影響分離效果的因素及改進(jìn)途徑？

色譜分離過程的熱力學(xué)和動力學(xué)問題，柱效與分離度的評價指標(biāo)及其關(guān)系。1940年Wilson提出了平衡色譜理論。對于譜線移動的速度和非線性分配等溫線時的流出曲線形狀給了很好的說明。由于該理論忽略了傳質(zhì)速率的有限性與物質(zhì)分子的縱向擴(kuò)散的影響，因而對在線性色譜條件下的色譜峰區(qū)域擴(kuò)寬的現(xiàn)象不能解釋。1941年，Martin和Synge提出塔板理論。對色譜流出曲線分布和譜帶移動規(guī)律，以及柱長和理論塔板高度H對區(qū)域擴(kuò)張的影響給予了近似的解釋。但是塔板理論對影響理論塔板高度H的各種因素沒有從實質(zhì)上進(jìn)行考慮，只是一個半經(jīng)驗的理論，未能掌握色譜過程中區(qū)域擴(kuò)張的實質(zhì)。20世紀(jì)50年代，vanDeemter等提出了速率理論。同時考慮傳質(zhì)速率和縱向擴(kuò)散互相影響的關(guān)系式并不斷得到發(fā)展，統(tǒng)稱為速率理論，可以更好地闡明各種操作參數(shù)對柱效能與峰形的影響。1）平衡色譜理論基本假設(shè)：組分以脈沖的形式進(jìn)入色譜柱，組分在兩相之間的分配平衡瞬間達(dá)成。即不考慮傳質(zhì)速率的有限性和物質(zhì)的擴(kuò)散對平衡過程的影響。dxc+dcc(c+dc)puqdt

=pqdxcpuqdt流動相固定相q

=(1-p)qdx2）塔板理論塔板理論就是將色譜柱和蒸餾塔進(jìn)行類比為基礎(chǔ)的半經(jīng)驗理論，并且得到了廣泛的應(yīng)用。塔板理論假設(shè)如下：（1）雖然物質(zhì)在兩相之間的平衡實際上不能瞬間達(dá)到，但從統(tǒng)計的角度來看，可以認(rèn)為平衡能夠在一個小段色譜柱內(nèi)形成。這一小段色譜柱稱為一個理論塔板，其相應(yīng)占有的色譜柱長稱為理論塔板高度（H）。整個色譜柱由一系列按順序排列的塔板組成。在這一小段塔板內(nèi)，K為平衡時物質(zhì)在兩相間的分配濃度比即分配系數(shù)。（2）假設(shè)在柱內(nèi)塔板高度為常數(shù)，長度為L的色譜柱內(nèi)塔板數(shù)目為n=L/H。（3）假定流動相不是采取連續(xù)的方式前進(jìn)，而是跳躍式前進(jìn)。設(shè)q和p分別是柱的橫截面積和在柱橫截面積中流動相所占據(jù)的截面積分?jǐn)?shù)，那么一個塔板上流動相所占據(jù)的空間體積為Hqp。當(dāng)通過色譜柱的流動相體積為V時，相當(dāng)于流動相在整個柱內(nèi)每個塔板上跳動的次數(shù)為r=V/Hqp。（4）流動相不可以被壓縮。（5）塔板編號依次為0，1，2，3，

n，總塔板數(shù)為n+1，實際上n很大，所以總塔板數(shù)約等于n。（6）全部樣品開始都集中在第一塊塔板上。（7）分配系數(shù)不隨組分濃度變化，即分配等溫線是線性的。

（8）塔板之間沒有分子擴(kuò)散?；娟P(guān)系式

在塔板上，某一個分子出現(xiàn)在流動相中的概率（Pm）應(yīng)等于在該塔板上流動相中該物質(zhì)分子的個數(shù)（摩爾數(shù)）與整個塔板上（包括流動相、固定相）該物質(zhì)分子的個數(shù)之比，因此有：經(jīng)過r次跳躍后，各塔板上溶質(zhì)的分布可以用二項展開式來描述。根據(jù)上面的式子可知，經(jīng)過r次跳躍后在第n塊塔板上出現(xiàn)的概率P(r,n)（r

n）為：塔板理論的保留值組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值時，意味著該組分分子在色譜柱最后一塊塔板上的量達(dá)到極大（每塊塔板體積相等）。設(shè)此時流動相在色譜柱內(nèi)相應(yīng)的跳動次數(shù)為rmax，則應(yīng)該滿足以下條件：因為色譜柱的塔板數(shù)n值通常在數(shù)百至數(shù)十萬之間，而r的值比n更大得多，因此可以得到：因為每一次跳動通過色譜柱的流動相體積等于一個塔板上占據(jù)的流動相的體積Hqk，所以保留體積等于跳動次數(shù)與Hqk的乘積，和平衡色譜理論的結(jié)果一致。塔板理論的色譜流出曲線方程上面的式子不夠直觀，因此需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)變換。當(dāng)二項式分布的n，r很大時，可以用正態(tài)分布函數(shù)來表示：當(dāng)足夠量的流動相（r足夠大時）經(jīng)過色譜柱后，溶質(zhì)開始從柱后流出并進(jìn)入檢測器產(chǎn)生響應(yīng)訊號。進(jìn)入檢測器的溶質(zhì)量等于第r次跳動（流動相體積為V）分布在最后一塊塔板上的流動相中溶質(zhì)。可知進(jìn)入檢測器的溶質(zhì)濃度為：流出曲線方程或者是塔板理論方程。塔板高度和理論塔板數(shù)的計算方法根據(jù)色譜峰呈Gaussian分布曲線可以導(dǎo)出計算理論塔板數(shù)的另一個公式。因Gaussian曲線不同高度上的相對寬度，即色譜區(qū)域?qū)挾饶軌蛴脴?biāo)準(zhǔn)偏差

來衡量，色譜峰的峰底寬W=4

，因此：每米柱長上的理論塔板數(shù)，定義為色譜柱效，以n’=n/L表示。它是評價色譜柱效能的指標(biāo)。采用塔板數(shù)評價柱效時，須注意標(biāo)明：組分固定相及其含量流動相及其操作條件柱溫

塔板理論小結(jié)導(dǎo)出了色譜流出曲線方程，初步闡明了溶質(zhì)分布隨流動相體積變化的規(guī)律，給出了保留值的關(guān)系式、計算色譜柱效的方法以及色譜峰區(qū)域?qū)挾鹊年P(guān)系式。不能解釋不同流動相流速下同一溶質(zhì)將給出不同的理論塔板數(shù)。沒有闡明理論塔板數(shù)和塔板高度的色譜含義和實質(zhì)。沒有深入討論影響塔板高度的因素，對色譜體系的設(shè)計、操作條件的選擇的指導(dǎo)意義十分有限。3）速率理論

1956年VanDeemter等人提出速率理論，Giddings等進(jìn)一步加以完善。它將塔板理論中的塔板高度概念與組分在兩相間的擴(kuò)散傳質(zhì)聯(lián)系起來，采用隨機模式描述組分在柱內(nèi)的分離過程。隨機過程總是導(dǎo)致Gaussian分布，采用標(biāo)準(zhǔn)偏差

或者

2作為溶質(zhì)分子在色譜柱內(nèi)離散的度量。總的離散程度應(yīng)該是單位柱長分子離散程度的累計，且與柱長成正比：比例因子H為單位柱長的分子離散：為了簡便，H仍然稱為理論塔板板高度，簡稱板高。色譜柱中并不存在所謂的塔板，在速率理論中，理論塔板高度是色譜柱內(nèi)一個小單元中溶質(zhì)分子離散的程度。作為一個色譜參數(shù)使用，是色譜峰擴(kuò)張的指標(biāo)。塔板高度的統(tǒng)計意義色譜過程中存在多種無規(guī)則的分子運動狀態(tài)，引起色譜區(qū)帶擴(kuò)張。根據(jù)隨機理論，有限個獨立隨機變量和的方差等于它們的方差和。色譜過程總的色譜區(qū)帶擴(kuò)張等于各個獨立因素引起色譜區(qū)帶擴(kuò)張的和，即各獨立離散項具有加和性：渦流擴(kuò)散

采用細(xì)而均勻的填料，均勻填充可降低渦流擴(kuò)散。

縱向分子擴(kuò)散

Dm與分子量有關(guān)，N2、H2；液相Dm小。

流動相傳質(zhì)阻力

abc固定相傳質(zhì)阻力

流動相流動相固定相固定相多孔填料時可以用dp代替df。

VanDeemter速率理論方程填料粒度與填充情況擴(kuò)散系數(shù)流動相線速固定相用量組分分配比哪些方法可以提高柱效？H~u曲線判斷色譜柱填充情況比較色譜柱性能根據(jù)VanDeemter方程可以求出Hmin和uopt：例題:載體粒度由60目改變?yōu)?00目，若其它條件不變，H~u曲線有何變化，為什么？答在其它條件不變的情況下，填料粒度由大變小時（60目變成100目），渦流擴(kuò)散項因子A變小，縱向擴(kuò)散項因子B基本不變，流動相傳質(zhì)阻力項因子C減小。