Word1/1紙層析的實(shí)驗(yàn)報(bào)告篇二：氨基酸的薄層層析試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)六紙層析法觀看轉(zhuǎn)氨基作用

【試驗(yàn)名稱】：紙層析法觀看轉(zhuǎn)氨基作用

09救援一班第三大組李嵐宇20xx222336

室溫：28°

（一）試驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、學(xué)習(xí)氨基酸紙層析的基本原理。

2、把握氨基酸紙層析的操作原理。

（二）試驗(yàn)原理：

轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸代謝過(guò)程中的一個(gè)重要反應(yīng)，在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸與α-酮基的互換反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨基作用。轉(zhuǎn)氨基作用廣泛地存在于機(jī)體各組織器官中，是體內(nèi)氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反應(yīng)時(shí)均由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基轉(zhuǎn)移到另一α－酮基酸上。各種轉(zhuǎn)氨酶的活性不同，其中肝臟的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）催化如下反應(yīng)：

α—酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸

本試驗(yàn)以丙氨酸和α-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的消失，以證明轉(zhuǎn)氨基作用。紙層析屬于安排層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強(qiáng)，水被吸附在濾紙的纖維素的纖維之間形成固定相。有機(jī)溶劑與水不相溶，把預(yù)分別物質(zhì)加到濾紙的一端，使流淌溶劑經(jīng)此向另一端移動(dòng)，這樣物質(zhì)隨著流淌相的移動(dòng)進(jìn)行連續(xù)、動(dòng)態(tài)的不斷安排。由于物質(zhì)安排系數(shù)的差異，而使移動(dòng)速度就不一樣，在固定相中，安排趨勢(shì)較大的組分，隨流淌相移動(dòng)的速度就慢，反之，在流淌相安排趨勢(shì)較大的成分，移動(dòng)速度快，最終不同的組分彼此分別，物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速率可以用比值Rf表示：ALT

物質(zhì)在肯定的溶液中的安排系數(shù)是肯定的，故比值Rf也相對(duì)穩(wěn)定，因此在同一層析體系中可用Rf值來(lái)鑒定被分別的物質(zhì)。

（三）試驗(yàn)材料與儀器：

試劑：

1、0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液。

2、0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml與0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混勻,用蒸餾水稀釋20倍。

3、0.1mol/L丙氨酸溶液稱取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液中,以1.0NNaOH仔細(xì)調(diào)至pH7.4后,加磷酸鹽緩沖液至100ml。

4、0.1mol/Lα－酮戊二酸稱取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0NNaOH認(rèn)真調(diào)至pH7.4后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。

5、0.1mol/L谷氨酸溶液稱取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0NNaOH認(rèn)真調(diào)至pH7.4后,加磷酸鹽緩沖液至50ml。

6、0.5%茚三酮溶液稱取茚三酮0.5克于100ml丙酮中溶解。

7、層析溶劑：將重蒸過(guò)的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震蕩，靜置24小時(shí)后分層，將下部酚層轉(zhuǎn)移到瓶中備用。

儀器：玻璃勻漿器、10ml試管、培育皿、表面皿、沸水浴鍋、37℃恒溫水浴箱、9cm圓濾紙、烘箱、手術(shù)剪刀、分液漏斗。

（四）試驗(yàn)步驟:

1、肝勻漿制備：取新奇動(dòng)物肝0.5克,剪碎后放入勻漿器,加入冷0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液1.0ml,快速研成勻漿，用上述緩沖液4.5ml混勻備用。

2、酶促反應(yīng)過(guò)程

（1）取離心管兩支，編號(hào)：1（測(cè)定管）、2（對(duì)比管），各加肝勻漿0.5ml。把對(duì)比管放沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。

（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5ml,0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5ml,0.01mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液1.5ml,搖勻。

（3）37℃保溫，30分鐘后取出，保溫完畢。

（4）把測(cè)定管放沸水浴中煮10分鐘，取出后冷卻，過(guò)濾。

3、層析

（1）取圓形濾紙一張（直徑9cm）放雪白紙上，以圓點(diǎn)為中心，約1cm為半徑,用鉛筆劃一圓線作為基線,在線上四等份處標(biāo)清四點(diǎn)編號(hào)作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。

（2）點(diǎn)樣：用四根毛細(xì)玻璃管分別進(jìn)行點(diǎn)樣。把丙氨酸液、谷氨酸液分別點(diǎn)在原點(diǎn)2、4處。把測(cè)定液、對(duì)比液分別點(diǎn)在原點(diǎn)1、3處。留意斑點(diǎn)不宜過(guò)大（應(yīng)在直徑0.5cm以下）。在第一次點(diǎn)樣點(diǎn)干后，再在原處同樣點(diǎn)第2次。

（3）層析：先在濾紙圓心處打一小孔（鉛筆芯粗細(xì)），再取濾紙一條卷成捻如燈芯狀,上端插入濾紙中心孔中，下端剪成須狀。

（4）把濾紙平放在上述培育皿上，使紙芯下浸入層析液中，蓋上培育皿蓋。可見(jiàn)層析液沿紙芯上升到濾紙中心，漸向四周集中。當(dāng)層析液前緣到離濾紙邊緣約1cm時(shí)，約25分鐘，取出濾紙，用鑷子當(dāng)心取下紙芯，放入烘箱中烘干。

（5）顯色：將上述濾紙平放在培育皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使濾紙全部潮濕，再放入烘箱干燥，此時(shí)可見(jiàn)紫色斑消失，比較色斑的位置，及色澤深淺，計(jì)算Rf值，分析是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。

（五）試驗(yàn)結(jié)果記錄：

（六）試驗(yàn)爭(zhēng)論：

1、從表格（1）中可以看出，測(cè)定管上清液點(diǎn)樣消失了兩個(gè)色斑，依據(jù)Rf值的計(jì)算也可以看出，測(cè)定管中氨基酸發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基作用，生成的未知物質(zhì)b為谷氨酸，則未知溶質(zhì)a為丙氨酸；對(duì)比管中由于酶的失活而沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，只有丙氨酸，所以色斑只