基因工程的基本操作程序(一輪復習)高三—人教版—生物學選擇性必修3—第3章

現有某個品系的玉米不抗病。香蕉NPR

1基因是植物抗病信號傳導的關鍵基因，該基因在植物中的過量表達促使植物內源水楊酸含量升高，從而能誘導植物過敏性反應和系統獲得抗病性的發生，達到廣譜抗病的目的。

科學家擬將NPR

1基因作為目的基因培育抗病的玉米新品種。【從社會中來】如何培育轉基因抗病玉米？3.將目的基因導入受體細胞抗病香蕉與載體拼接普通玉米（無抗病特性）

體細胞或受精卵（含NPR

1抗病基因）轉基因抗病玉米（有抗病特性）提取表達NPR1抗病基因導入NPR1抗病基因重組DNA分子1.目的基因的

篩選與獲取2.基因表達載體的構建4.目的基因的

檢測與鑒定如何培育轉基因抗病玉米？(一)目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞

或獲得預期

等的基因。(二)篩選合適的目的基因1.從相關的已知

的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。2.利用

（如GenBank）和序列比對工具（如BLAST）進行篩選。(三)獲取目的基因性狀表達產物結構和功能清晰序列數據庫1.人工合成目的基因。2.通過構建基因文庫來獲取目的基因。3.利用______________目的基因（常用）。PCR獲取和擴增主要是指編碼蛋白質的基因。目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定如：香蕉的NPR

1抗病基因。(三)獲取目的基因3.利用PCR獲取和擴增目的基因。目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定DNA粗提取NPR1抗病基因PCR快速獲得大量抗蟲基因①PCR的中文全稱：聚合酶鏈式反應②原理：DNA半保留復制③操作環境：體外（PCR擴增儀/PCR儀）④目的：⑤優點：對目的基因的核苷酸序列進行大量復制。可以在短時間內大量擴增目的基因。PCR擴增儀⑥PCR反應所需的基本條件項目體內DNA復制體外PCR擴增在PCR中的作用場所細胞內(主要在細胞核內)PCR擴增儀內一定的緩沖溶液(Mg2＋)DNA聚合酶需要Mg2＋激活模板DNA母鏈含目的基因的DNA母鏈提供DNA復制的模板解旋解旋酶高溫打開DNA雙鏈原料4種脫氧核苷酸dNTP(4種脫氧核苷酸三磷酸)合成DNA子鏈的原料，并提供能量子鏈延伸DNA聚合酶催化耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)催化合成DNA子鏈引物能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸2種引物使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸⑦PCR擴增的過程：90單鏈50引物72耐高溫的DNA聚合酶⑧PCR擴增的結果：呈

擴增(約為

，其中n為擴增循環的次數）。指數形式⑨PCR產物的鑒定：常采用

來鑒定。瓊脂糖凝膠電泳2n目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定延伸后得到的產物又可以作為下一個循環的模板，如此重復循環多次。NPR1抗病基因3’5’5’3’5’3’引物13’5’引物2

設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請分別說明理由。【對點練習】第1組：

；第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發生堿基互補配對而失效引物Ⅰ′自身內部部分堿基發生互補配對而失效兩種引物的要求：①引物自身不能環化或折疊；②兩種引物之間不能互補配對；③引物長度不宜過短，防止引物隨機結合。1.目的：2.基因表達載體的組成：基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取核心步驟①使目的基因在受體細胞中穩定存在,并且可以遺傳給下一代；②使目的基因能夠表達和發揮作用。位于基因的上游，RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA。位于基因的下游，終止轉錄。一般是抗生素抗性基因或熒光蛋白基因，用來鑒別或篩選含重組DNA分子的細胞。能控制表達所需要的特殊性狀。注意：目的基因必須插入到啟動子與終止子之間。DNA復制的起始位點。啟動子：終止子：標記基因：目的基因：復制原點：3.構建過程：基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取核心步驟用同種或產生相同末端的限制酶切割含有NPR

1基因的DNA片段。限制酶限制酶用一定的限制酶切割載體，使其出現一個切口，露出黏性末端。DNA連接酶利用DNA連接酶將NPR

1基因片段拼接到載體的切口處，形成一個重組DNA分子。基因表達載體【深度思考】1.使用一種限制酶進行切割，是否只會得到目的基因與載體結合的這一種重組DNA？①目的基因能否自連？②質粒能否自連？③目的基因與質粒能否反向連接？DNA連接酶能能能【深度思考】1.使用一種限制酶進行切割，是否只會得到目的基因與載體結合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質粒自連目的基因與質粒連接目的基因與目的基因連接質粒與質粒連接正向連接

反向連接11’22’122’1’22’1’1①質粒、目的基因自身環化；②質粒與目的基因反向連接。單酶切缺點：【深度思考】2.如何防止目的基因和質粒的自身環化以及目的基因的反向連接？選擇兩種不同的限制酶同時對目的基因和載體切割，防止目的基因和載體的自身環化和反向連接。活動：用EcoRⅠ限制酶（識別GAATTC，切割GA之間）和BgIⅡ限制酶（識別AGATCT，切割AG之間），切割載體和目的基因，并將其連接。雙酶切-G-CTTAA-A-TCTAG如圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內切核酸酶的酶切位點，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列敘述錯誤的是(

)A.在構建重組質粒時，可用PstⅠ和HindⅢ切割質粒和外源DNAB.在酶切過程中，不能破壞質粒中全部的標記基因C.若只用PstⅠ處理質粒和外源DNA分子片段，無法避免自身環化和反向連接D.導入重組質粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養基中生長D【對點練習】1.轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達

的過程。2.過程：兩次拼接和兩次導入拼接1拼接2導入1導入2Ti質粒目的基因構建基因表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌導入植物細胞將目的基因

插入染色體DNA中轉基因植物細胞表現出新性狀的轉基因植株植物組織培養基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取農桿菌轉化法細胞種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法

、農桿菌轉化法

受體細胞轉化過程花粉管通道法受精卵或體細胞目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA中→表達顯微注射法受精卵目的基因表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理法原核細胞（常用大腸桿菌）Ca2+處理細胞→能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態細胞→重組的基因表達載體導入細胞中基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取分子水平的檢測個體水平的鑒定（選擇性必修3p83</m>---到社會中去）轉基因抗蟲棉培育過程中,檢測目的基因是否成功表達的常見方法有哪兩種？__________________________________。抗原—抗體雜交法、用棉葉飼喂棉鈴蟲基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（一）體外DNA片段的擴增——PCR1.PCR原理：

2.PCR反應體系：DNA半保留復制、DNA的熱變性。模擬體內DNA半保留復制PCR反應體系：1.DNA模板；2.原料：4種脫氧核苷酸；3.引物：2種；4.TaqDNA聚合酶；5.合適的反應條件：pH、Mg2+等。模板DNA5～10μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實際為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μL1—5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U10倍濃縮的擴增緩沖液（含Mg2+）5μLH2O（無菌水）28～33μL總體積50μL注：模板DNA的用量為1pg-1μg。PCR反應體系的配方探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（一）體外DNA片段的擴增——PCR3.PCR方法步驟：移液用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分

離心待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）反應參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。循環程序變性復性延伸預變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min可根據目的片段長度適當調整延伸時間預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。（二）PCR產物的鑒定——電泳1.電泳原理：

①電泳的DNA分子具有可解離的基團，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的

作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷

的電極移動，這個過程就是電泳。

②PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的

濃度、DNA分子的

等有關。

③凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的

下被檢測出來。相反大小和構象紫外燈探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（二）PCR產物的鑒定——電泳1.電泳方法步驟：

用電泳緩沖液配制質量分數為0.8%—1.2%的瓊脂糖溶液，加熱至瓊脂糖熔化，稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子。凝膠溶液完全凝固后拔出梳子，形成加樣孔。取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中。將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物（Marker）。配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳、觀察接通電源，待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（三）結果分析與評價

P85·1.你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據是什么？可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。轉NPR

1基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉NPR1基因品系；)DNA標準樣液(Marker)陽性對照陰性對照待測樣品陽性對照：用于檢測PCR效率；陰性對照：用于檢測是否存在含有其他序列的DNA污染。探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定（三）結果分析與評價

P85·2.你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因？如果擴增不成功，可能的原因有：①漏加了PCR的反應成分；②各反應成分的用量不當；③PCR程序設置不當等。如果擴增結果不止一條條帶，可能的原因有：①引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；②退火溫度過低；③DNA聚合酶的質量不好等。探究·實踐：DNA片段的擴增及電泳鑒定謝謝觀看！基因工程的基本操作程序(一輪復習答疑)高三—人教版—生物學選擇性必修3—第3章【真題演練體驗感悟】1.(2021·湖北)某實驗利用PCR技術獲取目的基因，實驗結果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應非特異條帶的產生，以下措施中有效的是A.增加模板DNA的量

B.延長熱變性的時間C.延長延伸的時間

D.提高復性的溫度√【真題演練體驗感悟】2.(2020·北京)為了對重金屬污染的土壤進行生物修復，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉運蛋白(HMA3)基因與外源高效啟動子連接，導入楊樹基因組中(如圖)。A.①＋③ B.①＋② C.③＋② D.③＋④為檢