4GB/T21786—XXXX化學品體外哺乳動物細胞基因突變試驗方法本文件規定了化學品體外哺乳動物細胞基因突變試驗的范圍、術語和定義、試驗基本原則、試驗方法、試驗數據和報告。本文件適用于檢測體外哺乳動物細胞基因突變規范性引用文件。2規范性引用文件本文件沒有規范性引用文件。3術語、定義和縮略語下列定義和術語適用于本文件。3.1突變mutagenic在基因或染色體結構上的DNA堿基配對序列上發生遺傳改變。3.2正向突變forwardmutation從原型（野生型）轉變至突變型的基因突變，可引起酶活性和編碼蛋白的改變和丟失。3.3堿基對置換突變劑basepairsubstitutionmutagens能夠引起DNA中一個或幾個堿基對置換的物質。3.4移碼突變劑frameshiftmutagens能夠引起DNA分子中單個或多個堿基對增加或缺失的物質。3.5表型表達時間phenotypicexpressiontime新的突變細胞耗盡未改變的基因產物所需的時間。3.6突變頻率mutantfrequency所觀察到的突變細胞數與存活細胞數之比值。5GB/T21786—XXXX3.7相對總生長數relativetotalgrowth與陰性對照組細胞數相比，整個過程中所增加的細胞數，等于懸浮生長數乘以相對集落形成效率之積。3.8相對懸浮生長relativesuspensiongrowth與陰性對照組相比，整個表達期細胞增加的數量3.9細胞活性viability表達期結束后，接種在選擇性培養基中細胞形成集落的效力。3.10細胞存活率survival處理結束后，接種的處理細胞形成集落的效力，通常以與對照組細胞數的存活率比值表示。3.11克隆效率cloningefficiency細胞在低密度下生長，最后生成可以計數的集落的細胞的百分比。3.12有絲分裂重組mitoticrecombination在有絲分裂過程中，同源染色單體之間的重組可能導致DNA雙鏈斷裂或雜合性的喪失。3.13基因毒性genotoxic指所有類型的DNA或染色體損傷，包括DNA斷裂、加合、重排、突變、染色體畸變和非整倍體。并非所有類型的遺傳毒性效應都會導致基因突變或穩定的染色體損傷。3.14細胞毒性cytotoxicity對于本指南而言，細胞毒性是指處理組與陰性對照的存活率比較顯著下降，說明受試物具有細胞毒3.15相對存活率relativesurvival（RS）RS是受試物細胞毒性的衡量指標。RS是指在受試物處理后的細胞克隆的效率(CE)，其與陰性對照克隆效率的百分比。注：受試物處理時引起的細胞死亡數要考慮。3.166GB/T21786—XXXXS9肝組分S9liverfractions應用9000g離心后的肝勻漿上清，即肝粗提物。3.17S9混合物S9mix肝臟S9組分和代謝酶活性所需輔因子的混合物。3.18溶劑對照solventcontrol單獨用于溶解化學藥品的對照組培養物。3.19未處理對照untreatedcontrol不接受處理(即不含試驗化學物和溶劑)，但與接受試驗化學物的處理培養物處理方式相同。4試驗原則4.1由于TK+/-突變為TK-/-細胞缺乏TK,突變體對嘧啶類似物三氟胸苷(TFT)細胞毒性效應產生抗性。而含TK豐富的細胞則對TFT敏感，從而引起細胞代謝抑制和細胞進一步分化。因此突變細胞能在TFT存在條件下迅速增長，而正常細胞由于含TK而無法生長增殖。同樣地，缺乏HPRT或XPRT的細胞分別因其對6-琉基鳥嘌呤(6-TG)和8-氮鳥嘌呤(8-AG)具有抗性可被挑選出來。如受試的是堿基類似物或與選擇劑在結構上相關的化合物，則在進行任一哺乳動物細胞基因突變試驗時，應仔細考慮受試物的特性，判斷是否適合進行本試驗，例如，應研究受試樣品對突變細胞和非突變細胞可能存在的選擇性毒性。也就是說，在檢測與選擇劑結構相關的化合物時，必須核實選擇系統／選擇劑特性。4.2在加入或不加入代謝活化系統的條件下,懸浮或單層培養的細胞暴露于受試物一定時間(3-6小時）,然后將細胞傳代培養,測定細胞毒性,并在選擇突變細胞前使其表型得到表達。細胞毒性一般通過檢測細胞處理后的相對集落形成效率(生存能力)或集落的相對總生長數。處理后的細胞在培養液中保持足夠時間后,根據所選細胞和突變位點的特性,使誘發的突變表型表達至臨近可觀察到的水平。突變率則通過在含選擇劑的培養基中接種已知數目的細胞檢測突變細胞數,或在不含選擇劑的培養基中檢測集落形成效率(生存能力)。孵育適當時向后，計數細胞集落。根據選擇性培養液中奕變集落數和非選擇性培養液中集落數利用公式計算得出突變率。5試驗方法5.1試驗準備5.1.1細胞5.1.1.1本試驗有多種細胞類型可供選擇,包括L5178Y亞群、CHO、AS53、V79或TK6細胞。用多種于本試驗的細胞類型對化學性致突變物應具有明確的敏感性,高的集落形成效率以及穩定的自發突變率。應檢測細胞是否被支原體感染,若已被感染則不能使用。5.1.1.2試驗設計時應預先確定敏感性和檢測能力(power)。所用細胞數,培養皿/瓶數和所設受試物劑量組應能反應這些特定的參數。經處理后仍存活的最小細胞數以及每一試驗階段所用的最小細胞數應根7GB/T21786—XXXX據自發突變率確定?？偟脑瓌t是所用細胞數至少是自發突變率倒數的10倍。但推薦應用的細胞數量是至少106個細胞。實驗室對所用的細胞體系應有合適的歷史數據,以用于對試驗結果的穩定性和可靠性進行評價。5.1.2培養基和培養條件本試驗宜選用適宜培養基和孵育條件(培養皿、溫度、CO3體積分數和濕度)。應根據試驗所用的選擇系統和細胞類型選擇適宜的培養基。特別重要的是所選的培養條件,應確保在表達期細胞呈最佳生長狀態且突變細胞和非突變細胞有形成集落的能力。5.1.3培養準備從菌種培養基得到的細胞經繁殖后接種于培養基中，在37℃培養。需預先清除受試細胞中的已突變細胞。5.1.4代謝活化細胞株應在有或無外源性哺乳動物代謝活化系統的條件下與受試樣品接觸。最常用的活化系統是經酶誘導劑處理的,從嚙齒類動物肝臟制備的加有輔助因子的線粒體組分(S9)。所用的酶誘導劑包括Aroclor1354或苯巴比妥和β-萘黃酮的聯合誘導S9通常用在培養基中應用的終體積分數范圍為1%-3%，但在最終測試培養基中可能增加到10%。應根據受試樣品的特點選擇代謝活化系統及其應用條件。在某些情況下,可能使用一個以上的S9濃度。隨著代謝活化系統的不斷發展,目前已構建了含有能表達特殊活性酶的基因工程細胞系,可以為細胞提供內源性代謝活化能力。但應按科學的方法選擇所用的細胞系(例如分析細胞色素P450同功酶與受試物代謝之間的相關性)。5.1.5受試物/準備固體受試樣品應該溶解或混懸于合適的溶劑或賦形劑中,在處理細胞前如需要可進行適度稀釋。液體受試樣品可直接加入測定體系或在處理前適度稀釋。應使用新鮮制備的受試物,否則應有資料證明溶液貯存是穩定的。氣體或者揮發性試驗化學品應該根據標準步驟進行適當測試，如在密封的培養容器。除非已有數據證明受試物可以穩定保存，否則試驗化學品應該在試驗前制備。5.2試驗條件5.2.1溶劑/賦形劑溶劑/賦形劑不應與受試樣品發生化學反應,且對細胞的存活和S9的活性無影響。若選用的不是常用的溶劑或賦形劑,應有資料支持其適用性。建議盡可能用水或二甲基亞砜作溶劑。一般有機溶劑不應超過1%(v/v)，水溶劑(鹽水或水)不應超過10%(v/v)。如果所用溶劑/賦形劑尚未確定(例如乙醇或丙酮)，則應有數據證明其與試驗化學品和試驗系統的相容性，以及在所用濃度下無遺傳毒性來支持其使用。在缺乏這些支持數據的情況下，添加未處理的對照以證明所選溶劑沒有產生有害或誘變效應。5.2.3接觸濃度5.2.3.1在確定最高濃度時應考慮受試物的細胞毒性,溶解度和pH值或滲透性的變化。5.2.3.2在正式試驗中，細胞的毒性需在有或無代謝活化系統存在的條件下分別測定,可用細胞完整性和生長程度作為指標,例如細胞集落形成效率(存活能力)或相對總生長數。在預試驗中先測定細胞毒性和溶解性有利于正式試驗的設計。8GB/T21786—XXXX5.2.3.3至少應設立4個受試物濃度（不包括陽性組和對照組）以滿足測試要求。每個濃度至少有兩次重復測試。每次測試的數據應該有單獨報告，但是在結果分析中可以放在一起進行分析。如有細胞毒性,濃度設計應涵蓋產生最大毒性到產生最小或不產生毒性的范圍。如最高濃度可產生細胞毒性,那么細胞存活能力(相對集落形成效率)或相對總生長數應達到10%～30%范圍內(但不應低于10%)。如果有數據表明受試物毒性低或者沒有細胞毒性，不同濃度的梯度在3~3倍之間即可；最高濃度至少達到10mM,3mg/mLor3μL/mL，當測試化學品的成分不確定時，例如未知或可變成分的物質、復雜反應產物或生物材料(即未知或可變成分的化學物質)、環境提取物等，最高濃度可能需要更高(例如5mg/mL)；在沒有足夠的細胞毒性的情況下，增加各組分的濃度。但應該注意的是，這些要求對人類藥物可能有所不同。5.2.3.4相對不溶的受試樣品應盡量使其在培養條件下達到溶解度的限值。應觀察細胞染毒時終處理液中不溶的證據。在處理開始和結束時評價其溶解度可獲得有價值的資料,因為在試驗體系中有細胞、S9和血清等成分存在,受試樣品的溶解度在染毒過程中可能發生改變。不溶現象可通過肉眼觀察。5.2.4對照5.2.4.1每次試驗均應在有和無代謝活化系統的條件下同時設置的陽性和陰性(溶劑或賦形劑)對照。在使用代謝活化系統時,選用的陽性物應是需要活化才具有致突變作用的間接致突變物。5.2.4.2可用作陽性對照的化學品有以下幾種,見表1。表1可用作陽性對照的化學品TK（小和大HprtTK（小和大No.50-18-0(6055-19-35.2.4.3也可以使用其他適合的陽性對照參比物。如某試驗室有5-溴3'-脫氧尿苷[CASNo.59-14-3]的歷史性數據,則也可以將其作為陽性對照參比物。如可能,也可考慮使用與受試物在化學結構上相關的化合物作為陽性對照。5.2.4.4在每次試驗時,陰性對照除在試驗培養基中只加入溶劑或賦形劑外,其余處理應與各處理組相同。另外,如果沒有歷史數據證明所用溶劑或賦形劑無毒性作用或致突變作用,還應設不做任何處理的空白對照組。5.3試驗步驟9GB/T21786—XXXX5.3.1受試樣品處理5.3.1.1在有或無代謝活化系統存在的情況下,分別使增殖細胞與受試樣品接觸適當時間(通常3h～6h即有效)。接觸時間也可延長至一個或多個細胞周期。5.3.1.3在試驗的每個階段，用于每個試驗(對照和處理)培養的最小細胞數應基于自發突變頻率。一般原則是：在試驗的所有階段，處理和傳代的細胞，在每個培養瓶自發突變體不高于10。自發突變頻率在5~30×10-6之間。如果自發突變頻率為5×10-6，且自發突變數在10及以上時，可導致90%的細胞毒性(10%RS)，此時，細胞數至少30×106。此外，在突變選擇或表細胞培養時，細胞的數量不應低于300萬個。5.3.3存活能力、生存能力和突變率的檢測5.3.3.1在受試物染毒末期,細胞經洗滌、培養,以檢測存活能力,并使突變體的表型獲得表達。細胞毒性的檢測通常以染毒后開始測定的相對集落形成效率(存活能力)或相對總生長數來表示。5.3.3.3每個突變位點的新誘發突變體,其最佳表型表達需要經過(有)最短時間(HPRT和XPRT位點突變需要至少7d～9d,TK至少3d)。細胞在含選擇劑和不含選擇劑的培養液中生長,以分別測定突變體數目和集落形成效率。生存能力的檢測(用于計算突變效率)可以從表達期結束時開始,通過檢測接種在非選擇性培養基中的細胞來實施。5.3.3.3如果受試物在L5178YTK+/-試驗中為陽性,至少應測定一個受試樣品濃度(最高的陽性濃度)以及陰性和陽性對照中的集落大小。如受試樣品在L5178YTK+/-試驗結果為陰性,應測定陰性和陽性對照的集落大小。6試驗數據和報告6.1結果的處理6.1.1數據應包括處理組和對照組的細胞毒性和生存能力,集落計數和突變率。如L5178YTK+/-試驗結果為陽性,應分別計數至少一個受試樣品濃度(最高陽性濃度)以及陰性和陽性對照的大集落和小集落數。在TK+-試驗中,集落計數標準為正常生長集落(大集落)和慢生長集落(小集落)。小集落的成因是突變細胞受到嚴重的遺傳損傷,導致倍增期延長,細胞數量增加緩慢,典型的此類損傷范圍包括從整個基因的缺失至細胞核內可見的典型染色體畸變。小的突變集落的誘發與化學品誘發顯著的染色體畸變有關。損傷較輕的突變細胞生長速率與親代細胞相似，可形成較大的集落。6.1.2應提供存活能力(相對集落形成效率)或相對總的生長率數據。突變率可以用存活細胞數中突變細胞數所占比例來表示。6.1.3應提供每次培養的試驗數據。此外,所有數據應以表格形式列出。6.1.4對明確的陽性結果無需進行驗證試驗。意義不明確的結果最好通過改進試驗條件進一步試驗來澄清。陰性結果需視具體情況決定。如認為陰性結果無需進行驗證試驗,應提供依據。對可疑或陰性結果,在以后的試驗中應改進試驗參數以擴大試驗條件范圍,可改進的參數包括濃度間隔、代謝活化條件等。落大小。在使用TK6細胞株的TK+/-試驗中,也應測定集落大小。6.2結果評價和解釋6.2.1陽性結果判定有多個標準。如有劑量反應關系,或突變率增加,且結果可重復。應首先考慮結果的生物學意義。統計學方法可用于幫助試驗結果評價,但統計學意義不能作為陽性反應判定的唯一因素。GB/T21786—XXXX6.2.3不符合以上標準的受試樣品則被認為在本試驗體系中無致突變性。6.2.3盡管大多數試驗都能給出明確的陽性或陰性的結果,但也不排除極少數情況不能對受試物活性做出明確判斷,例如,無論重復試驗多少次,結果仍模校兩可或可疑。6.2.4體外哺乳動物細胞基因突變試驗陽性結果,表明受試樣品可引起所用哺乳動物細胞基因突變。有可重復的濃度-反應關系意義較大。陰性結果表明在本試驗條件下,受試樣品不引起所用哺乳動物細胞的基因突變。6.3試驗報告試驗報告應包括以下信息:6.3.1樣品a)名稱和識別碼如CAS編號(如已知);b)物理性質和純度;c)與試驗實施相關的物理化學特性;d)受試樣品穩定性。e)多組分物質、uvb及混合物6.3.2賦形劑a)選擇溶劑/賦形劑的理由;b)最終培養基中溶劑/賦形劑的百分比。6.3.3細跑a)細胞類型和來源;b)細胞培養皿/瓶數量;c)細胞傳代的次數(如適用);d)細胞培養的維護方法(如適用);e)沒有支原體的證據。e)核型特征/或染色體模式數f)細胞倍增時間6.3.4試驗條件a)細胞濃度和細胞培養數量選擇的理由,包括細胞毒性數據和溶解度限值等(如可能);b)培養基成分、CO2濃度、體積分數;c)受試樣品濃度;d)所加入的賦形劑和受試樣品的體積;e)孵育溫度;f)孵育時間;g)處理持續的時間;h)細胞處理時的密度;i)代謝活化系統的類型和成分,包括可接受的標準（S9來源、S9混合料的制備方法、S9混合料和S9在最終培養基中的濃度、S9的質量控制）;GB/T21786—XXXXj)陽性和陰性對照;k)表達期長短(包括細胞接種數,傳代和接種程序及所加培養液,如適用);1)選擇劑及其濃度特征:m)測試可接受性的標準;n)計數存活細胞和突變細胞的方法;o)集落大小和類型認定的定義(包括所謂小集落和大集落的標準,如適用)。p)考慮研究為肯定、否定或者存疑的標準6.3.5結果a)細胞毒性和其他觀察到的結局;b)沉淀現象和測定時間;c)受試樣品接觸過程中的pH值和滲透性數據(如可確定);d)集落大小(至少包括陰性和陽性對照組的數據);e)實驗室具備檢測L5178YTK+/-體系小突變集落能力的說明(如適用);f)劑量-反應關系(如有);g)統計學分析(適用與單次或多次重復數據)，p值，如果有；h)同期的陰性(溶劑/賦形劑)和陽性對照數據;i)同時陰性和陽性對照數據（濃度和溶劑）j)突變率。6.3.6結果討論6.3.7結論6.3.8注：歷史對照數據實驗室應建立:-本實驗室陽性對照范圍和95%可信區間-本實驗室陰性(未處理，溶劑)對照范圍和95%可信區間。當首次獲得陰性對照范圍的數據，相應的陰性對照應與發表的對照數據一致。隨著陰性對照的數據越來越多，理想的陰性對照應在該對照的均數95%控制限以內。開始建立實驗室的歷史陰性對照數據庫時，應至少有10次實驗的數據，相同實驗條件下進行的至少30次實驗為更好。實驗室應使用質量控制方法，例如控制圖(例如c圖或x條形圖[i])，以識別其陽性和陰性對照數據的變異，并表明該方法在其實驗室是“可控”。陰性對照數據應包括單個或兩個陽性物處理后的突變頻率。相應實驗時，陰性對照最好在實驗室歷史陰性對照數據的95%范圍內。如果陰性數據不在95%的控制線，這些陽性數據要想應用，其條件