22DetectionofClonorchissinensiseggsinhumanfeces-PCRandrealtimePCRI 5.2材料 2 2 2 3 3 3 4 4 5 6 7本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件主要起草人：馬文晨、孟慶峰、趙大力、王瑋琳、劉金華、孟日增、王偉1人糞便中華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵檢測(cè)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR法GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)4縮略語(yǔ)CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrithyDNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacidNTP：脫氧核苷酸三磷酸（deoxyriboEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticaFAM：6-羧基熒光素(6-carboxyfluorescTE緩沖液：Tris-HCl、EDTA緩沖液（Tris-EMGB：小溝結(jié)合物（minorgroovebinder）5.1.1除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑。25.1.10異丙醇。5.1.13加樣緩沖液。5.1.14GoldenView核5.1.15PremixTaq反應(yīng)預(yù)混5.1.16PremixExTaq（ProbeqPCR2×)反應(yīng)預(yù)混液（市售商品化熒光PCR基礎(chǔ)試劑）。5.1.17瓊脂糖凝膠。5.35.3.1無(wú)DNA酶污染的離心5’-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3’5’-ACTATCCCAGTAACCCCGCC-3’5’-TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3’5’-AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3’5’-FAM-AGCTCATCATATGTTTACTG-MGB-3’36.5生物安全柜。6.7核酸蛋白分析儀或紫外分光6.9研缽或冷凍粉碎裝置。6.12高壓滅菌器。8.4加2倍體積CTAB沉淀液（0.5%），室溫靜止60m8.5加入350μLNaCl溶液將沉淀重懸浮。再加入350μL三氯甲烷，旋渦振蕩進(jìn)行混勻，8.9可使用等效的商品化DNA提取試劑盒，按操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。4N——核酸稀釋倍數(shù)。作陽(yáng)性對(duì)照，用不含目標(biāo)基因的核酸做陰性對(duì)照，用水做空用量(μL）（含PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、Tap酶）分子量作對(duì)照，使用100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。5V/cm恒壓電泳3卵核酸陰性，表述為“未檢出華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵核酸”；如被檢樣品有條帶，大小為231bp，即判定為華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵核酸陽(yáng)性，表述為“檢出華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)10.1.4.2必要時(shí)取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與附錄B華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵的D5作陽(yáng)性對(duì)照，用不含目標(biāo)基因的核酸做陰性對(duì)照，用水做空用量(μL）PremixExTaq（ProbeqPCR2×)（含PCR緩沖液、dNTP、Mg2+、Ta），線，判定為華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵核酸陽(yáng)性，否則判定為華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵6試劑配制A.6蛋白酶K溶液（20mg/mL稱量A.7NaCl溶液（1.2mol/L稱取8kPa蒸汽壓（121℃)條件下滅菌20min，室溫保存。A.11加樣緩沖液：稱取0.88gNa2EDTA?7B.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列（231bp，GenBankNo.：OM81033TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTGAGCTCATCATATGTTTACTGTTGGGCTGGATTTGGGGACTGCTGTTTTTTTTAGCTCGGTATGATTATAGGTGTGCCTACAGGGATCAAGGT