ICS65.020.30備案號：DB32DiagnosticTechniquesforHaemop江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB32/T1772—2011為規(guī)范副豬嗜血桿菌病的診斷技術(shù)，特制定本標準。本標準按GB/T1.1—2009《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》編制。本標準由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本標準起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本標準起草人：劉茂軍、邵國青、周勇岐、王海燕、馮志新、孫佩元、甘源。1DB32/T1772—2011副豬嗜血桿菌病診斷技術(shù)本標準規(guī)定了副豬嗜血桿菌病診斷技術(shù)要求。本標準規(guī)定的分離鑒定和PCR法適用于本病的確診，間接血凝試驗適用于大批量樣品的普查。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。GB16548病害動物和病害動物產(chǎn)品生物安全處理規(guī)程GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1副豬嗜血桿菌病副豬嗜血桿菌病，又稱格拉澤氏病或革拉澤氏病(Glasser’sdisease)，該病由副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis,HPs）引起，可以影響各年齡段豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5～8周齡的豬，表現(xiàn)為豬的纖維性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、胸膜炎和腦膜炎等。4診斷據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀和特征病變可作出初步診斷，典型病變PCR檢測病原可確診。4.1流行性病學(xué)診斷副豬嗜血桿菌只感染豬，感染2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶前后和保育階段發(fā)病，通常見于5周齡～8周齡的豬，發(fā)病率一般在10%～15%，嚴重時死亡率可達到50%。在敏感豬群內(nèi)，副豬嗜血桿菌引起的死亡主要發(fā)生在幼豬。4.2臨床診斷由副豬嗜血桿菌引起的急性型疾病是非特異性的但卻是特征性的，臨床癥狀包括發(fā)熱、食欲不振和厭食，嚴重時可見呼吸困難、發(fā)紺、不愿活動、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、運動不協(xié)調(diào)以及死亡。急性發(fā)病耐過豬可以痊愈,但病癥嚴重，豬耐過后往往表現(xiàn)慢性病癥，主要是被毛粗亂、咳嗽、呼吸困難和生長遲滯。有些豬由于發(fā)生腦膜炎而表現(xiàn)肌肉震顫、麻痹和驚厥，有些因腹膜粘連而常引起腸2DB32/T1772—20114.3病理變化肉眼可見的損傷主要是在單個或多個漿膜面，可見漿液性和化膿性纖維蛋白滲出物，這些漿膜包括腹膜，心包膜和胸膜，這些損傷也可能涉及腦膜和關(guān)節(jié)表面，尤其是腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)。胸腹腔積液或粘連，關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)腔粘液增多，肺臟出血、表面有纖維素性滲出物附著，全身淋巴結(jié)水腫、出血。在顯微鏡下觀察滲出物，可見纖維蛋白，中性粒細胞和較少量的巨噬細胞。病死豬及病料應(yīng)符合按GB16548的規(guī)定。5病原學(xué)診斷除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682—2008的滅菌二級水。5.1病原分離與鑒定5.1.1材料準備巧克力瓊脂平板，鮮血瓊脂平板，TSA固體培養(yǎng)基，TSB液體培養(yǎng)基，副豬嗜血桿菌標準菌株，細菌微量生化鑒定管，滅菌棉拭子等。5.1.2病料采集按NY/T541規(guī)定的方法，采集呼吸道分泌物，采取具有特征的肺臟、肝臟、脾臟、胸膜、胸腹腔積水、心包積液、心血、關(guān)節(jié)液和腦組織。5.1.3病原分離采集樣品，首先在巧克力瓊脂平板、TSA固體培養(yǎng)基、鮮血瓊脂平板上分別劃線接種，37℃培養(yǎng)48h～72h以后挑取單個菌落，再進行純培養(yǎng)并鑒定。細菌涂片，革蘭氏染色鏡檢。如果為革蘭氏陰性小桿狀或多形性小桿菌，再進行一次巧克力瓊脂亞克隆培養(yǎng)，同時接種鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板。巧克力瓊脂平板生長良好，而鮮血瓊脂平板和普通瓊脂平板沒有菌落生成則菌株保存待進一步鑒5.1.4病原鑒定5.1.4.1生長特性試驗挑取被檢分離株和副豬嗜血桿菌標準株菌落接種綿羊鮮血瓊脂平板和2%胨瓊脂平板上，再以金黃色葡萄球菌點種或垂直劃線，置37℃培養(yǎng)48h。觀察葡萄球菌菌落周圍菌落生成情況，如愈靠近金黃色葡萄球菌菌落生成的半透明菌落愈大，愈遠的愈小，甚至不見菌落生長，且不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象判為陽性。5.1.4.2生化實驗培養(yǎng)物接種于添加有NAD的脲酶、氧化酶、吲哚，接觸酶、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸鹽還原酶等細菌微量生化鑒定管，置37℃培養(yǎng)48h。按細菌微量生化鑒定管說明書判定。脲酶試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗均陰性，并接觸酶、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、果糖、核糖、半乳糖、硝酸鹽還原試驗均陽性者判為副豬嗜血桿菌陽性。5.1.4.3聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）3DB32/T1772—2011按5.2進行操作和判定。5.1.5結(jié)果判定以上實驗皆為陽性判為副豬嗜血桿菌。5.2聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）5.2.1材料準備PCR引物P15`-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3`和P25`-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3`，PCR相關(guān)試劑。副豬嗜血桿菌標準菌株DNA提取物為陽性對照，水作為陰性對照。高速離心機（10000r/min）、PCR儀、電泳儀、水平電泳槽凝膠成像系統(tǒng)（或紫外投射儀）、移液器等儀器。5.2.2DNA模板的制備按NY/T541規(guī)定的方法，采集待檢豬的病料置于-20℃保存。取約1g病料，剪碎后勻漿器加5mL水研磨成糊狀，煮沸10min，高速10000r/min離心5min，取上清-20℃保存?zhèn)溆?。另外，按GB16548規(guī)定處理待檢豬。取可疑培養(yǎng)物10000r/min離心5min，棄上清，沉淀以無菌水重懸，煮沸10min，高速10000r/min離心5min，取上清-20℃保存?zhèn)溆?。分離純化的菌株用接種環(huán)刮取2個菌落洗脫于含100μL無菌水的離心管，煮沸10min，高速10000r/min離心5min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3PCRPCR反應(yīng)體系：10×PCRBuffer2.5μL，Mg2+（25mM）1.3μL，P1（20pmol/μL）1.0μL，P2（20pmol/μL）1.0μL，dNTPs（2.5mM）2.0μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，模板2μL～5μL，加ddH2O至總體積25μL。反應(yīng)條件：94℃5min，94℃30s，59℃30s，72℃45s，34個循環(huán)，72℃10min。5.2.4電泳制備1%瓊脂糖凝膠，內(nèi)加適量溴化乙錠或其替代物，取PCR產(chǎn)物10μL～20μL分別與適量加樣緩沖液混合后，加樣到鳥叫孔中，9V/cm恒壓下電泳15min～30min。將電泳好的凝膠放到紫外投射儀或凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。5.2.5結(jié)果判定陽性對照擴增到821bp條帶，同時陰性對照為擴增到條帶時，試驗成立。在試驗結(jié)果成立的前提下，如果樣品擴增到821bp條帶，可確認為可疑培養(yǎng)物或分離純化的菌株副豬嗜血桿菌PCR陽性。6.1材料準備6.1.196孔V型（110°)有機玻璃反應(yīng)板、25μL微量移液器、微量振蕩器等。6.1.2副豬嗜血桿菌純化滅活抗原、副豬嗜血桿菌標準陽性血清、副豬嗜血桿菌標準陰性血清。6.1.3致敏紅細胞:為副豬嗜血桿菌滅活抗原致敏的綿羊紅細胞。4DB32/T1772—20116.1.4稀釋劑:含1%健康兔血清pH7.2PBS。6.2操作方法6.2.1血清的處理取被檢血清0.2mL于無菌小試管中，56℃水浴30min滅活，冷卻后加入0.3mL2%戊二醛紅細胞懸液，搖勻，置37℃水浴3min，離心后吸出血清供檢驗用。陽性血清、陰性血清的處理同被檢血清。用微量移液器先向反應(yīng)板每孔中加25μL稀釋劑，再向第1孔加人25μL已處理好的被檢血清，充分混勻后，吸取25μL加入第2孔……，依次做倍比連續(xù)稀釋至第6孔（血清的稀釋倍數(shù)為1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64），混勻后從第6孔取出25μL棄去。向每孔中加入25μL2%致敏紅細胞，血清的最終稀釋倍數(shù)為1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128。同時應(yīng)設(shè)陰、陽性血清對照及致敏紅細胞空白對照。置微型振蕩器上震蕩30s后，室溫靜置2h，觀察結(jié)果。6.3結(jié)果判定6.3.1成立條件致敏紅細胞對照無自凝現(xiàn)象，陽性對照血清抗體價>1:32；陰性對照血清抗體價<1:16時表明試驗成立。6.3.2判定標準++++:紅細胞100%凝集，在孔底凝集濃縮成團，面積較大；+++:紅細胞75%凝集，在孔底形成較厚層凝集，面積較大，卷邊或呈鋸齒狀；++:紅細胞50%凝集，其余不凝集的紅細胞在孔底中央集中成較大的圓點；+:紅細胞25%凝集，不完全沉于孔底，周圍有散在少量的凝集；-:紅細胞呈點狀沉于孔底，周邊光滑。6.3.3判定被檢血清效價大于1:32為陽性；低于1:16為陰性；在1:16～1:32之間為可疑。7最終結(jié)論判定下列任何情