生物學基本技能基本技能

Ⅺ染色劑和染色01.實驗目的02.生物學常用的染料03.常用染液的配制04.常用的生物學染色技術05.實驗操作實訓目錄Contents1.規范操作常用的染色技術。2.掌握常用染色劑的配制方法。一、實驗目的（一）天然染料天然染料主要來源于植物、動物、微生物或天然彩色礦石，其特征是一般可以自然降解，大部分無毒性，不污染環境。生物學實驗所用的天然染料多為植物染料。蘇木精（hematoxylin）。是南美的蘇木（熱帶豆科植物）干枝中用乙醚浸漬出來的一種色素，是最常用的染料之一。蘇木精不能直接染色，被染材料必須經金屬鹽的媒劑作用后才有著色力，所以在配制蘇木精染色時一般都要用媒染劑。常用的媒染劑有硫酸鋁銨（銨明礬）、硫酸鋁鉀（鉀明礬）等。蘇木精是染細胞核的優良材料。用酸性溶液（如鹽酸\|酒精）分化后呈紅色，水洗后仍恢復青藍色；用堿性溶液（如氨水）分化后呈藍色，水洗后呈藍黑色。洋紅（carmine）。又叫胭脂紅或卡紅，是將一種產自熱帶的雌性胭脂蟲干燥后，磨成粉末，提取出蟲紅，再用明礬處理，除去其中雜質而制成的染料。單純的洋紅不能染色，要經酸性或堿性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，堿性溶液有氨水、硼砂等。洋紅是細胞核的優良染料，適于小型材料的整體染色。番紅（safranine）。是從藏紅花柱頭中提取的一種天然染色劑，為橙紅色粉末，可溶解于水和乙醇。常用于組織學和細胞學的生物染色，能對植物的木質化、栓質化和角質化部分進行染色，能將細胞核、染色體和花粉外壁等染成鮮艷的紅色，其常與固綠等進行合作染色。番紅在分析化學中也被用作氧化還原指示劑。二、生物學常用的染料（二）人工染料人工染料主要是人工合成的一類染料，其缺點是經日光照射后容易褪色，苯胺藍、亮綠、甲基綠更易褪色。在制片中注意掌握酸堿度，并避免日光直射，能保持多年不褪色。二、生物學常用的染料染料特性酸性品紅酸性染料，呈紅色粉末狀，能溶于水，略溶于乙醇。是良好的細胞質染色劑，在動物玻片標本制片中應用廣泛。易和堿起作用剛果紅酸性染料，呈棗紅色粉末狀，能溶于水和乙醇，遇酸呈藍色。它能做染料，也用作指示劑?？梢院吞K木精做二重染色，也可以做類淀粉染色甲基藍弱酸性染料，能溶于水和乙醇。在動植物的制片技術方面應用極廣。極易被氧化，因此染色后不能長久保存固綠酸性染料，能溶于水、乙醇。是一種染含有漿質的纖維素細胞組織的染色劑，在染細胞和植物組織上應用極廣蘇丹Ⅲ弱酸性染料，呈紅色粉末狀，易溶于脂肪和乙醇伊紅紅色酸性染料，在微生物學實驗中，是鑒別產酸性細菌的一種培養基添加劑。常用的是伊紅Y，伊紅Y是一種化學合成的酸性染料（二）人工染料二、生物學常用的染料染料特性堿性品（復）紅堿性染料，呈暗紅色粉末或結晶狀，能溶于水、乙醇。在生物學制片中用途很廣結晶紫堿性染料，能溶于水、乙醇。在細胞學、組織學和細菌學等方面應用極廣，是一種優良的染色劑龍膽紫混合的堿性染料，主要是結晶紫和甲基紫的混合物。醫藥上用的紫藥水，主要成分是甲基紫中性紅弱堿性染料，呈紅色粉末狀，能溶于水、乙醇。無毒，常作為活體染色的染料亞甲藍或美藍堿性染料，呈藍色粉末狀，能溶于水、乙醇。是動物學和細胞學染色中十分重要的細胞核染料，其優點是染色不會過深甲基綠是堿性染料，呈綠色粉末狀，能溶于水、乙醇。是最有價值的細胞核染色劑，細胞學中常用來染染色質姬姆薩是用天青色素、伊紅、次甲藍混合而成的一種染料，可對血液涂片、血細胞、瘧原蟲、立克次體、骨髓細胞、脊髓細胞等標本進行染色（一）呂氏（Loeffer）堿性美藍染液配制A液：B液：配制方法：分別配制A液和B液，配好后混合即可。三、常用染液的配制（二）齊氏（Ziehl）石炭酸復紅染液配制A液：B液：配制方法：將堿性復紅在研缽中研磨后，逐漸加入95%乙醇，繼續研磨使其溶解，配成A液。將石炭酸溶于蒸餾水中，配成B液?；旌螦液及B液即成。通常可將此混合液稀釋5～10倍使用，稀釋液易變質失效，一次不宜多配。三、常用染液的配制（三）革蘭氏（Gram）染液配制1）草酸銨結晶紫染液A液：B液：配制方法：混合A液及B液，靜置48h后使用。三、常用染液的配制（三）革蘭氏（Gram）染液配制2）盧戈（lugol）碘液配制方法：先將碘化鉀溶解在少量蒸餾水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足量的蒸餾水即可。三、常用染液的配制（三）革蘭氏（Gram）染液配制3）脫色液95%乙醇溶液。4）番紅復染液配制方法：取上述配好的番紅乙醇溶液10mL與90mL蒸餾水混勻即可。三、常用染液的配制（四）芽孢染液（sporestainingsolution）配制1）孔雀綠染液2）番紅水溶液3）苯酚品紅溶液配制方法：取上述溶液10mL與100mL的5%苯酚溶液混合，過濾備用。三、常用染液的配制（四）芽孢染液（sporestainingsolution）配制4）黑色素溶液配制方法：稱取10g黑色素溶于100mL蒸餾水中，置沸水浴中30min后，用濾紙過濾兩次，加蒸餾水至100mL，加0.5g甲醛備用。三、常用染液的配制（五）莢膜染液（capsulestainingsolution）配制1）黑色素水溶液配制方法：將黑色素在蒸餾水中煮沸5min，加入福爾馬林作防腐劑。2）番紅染液與革蘭氏染液中番紅復染液配制法相同。三、常用染液的配制（六）鞭毛染液（flagellumstainingsolution）配制1）硝酸銀鞭毛染液A液：在冰箱內可以保存3～7天，延長保存期會產生沉淀，但用濾紙除去沉淀后仍能使用。B液：配制方法：待AgNO3充分溶解后，取出10mL備用，向其余的90mLAgNO3中滴入NH4OH，使之成為濃厚懸浮液，再繼續滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新剛剛溶解為止。將備用的10mLAgNO3緩慢滴入，則出現薄霧，但輕輕搖動后，薄霧狀沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到搖動后仍呈現輕微而穩定的薄霧狀沉淀為止。通常在冰箱內保存10天內仍可使用。如霧重，為析出銀鹽沉淀，不宜再使用。三、常用染液的配制（六）鞭毛染液（flagellumstainingsolution）配制2）Leifson鞭毛染液A液：B液：C液：臨用前將A、B、C液等量混合均勻后使用。三種溶液分別于室溫保存，可保存數周；若分別置冰箱保存，可保存數月。混合液裝密封瓶內置于冰箱中數周內仍可使用。三、常用染液的配制（一）植物組織染色（planttissuestaining）植物組織染色的常用方法是番紅-苯胺藍（或固綠）二重染色法，具體操作方法有兩種。1）方法一（1）將植物切片材料放入30%乙醇中，5min后移入水中。（2）用0.1%番紅水溶液染色12～24h。（3）倒去番紅水溶液，用清水沖洗數次后，再放回50%乙醇中浸泡5min。（4）將材料從50%乙醇中轉入70%乙醇中脫色，直至硬木質化的細胞壁呈現紅色，其他部分呈粉紅色或近于無色時為止。（5）用1%苯胺藍（用70%乙醇配制）對染2～5min。若用0.1%固綠對染，則0.5min左右即可。（此步要不時地在顯微鏡下檢視，切忌染色過深，當木質化細胞壁呈紅色、其他部分為淡藍或淡綠色時，即可停止。）（6）用95%乙醇沖去多余染液，再經無水乙醇脫水5min。（7）放入等量無水乙醇與二甲苯溶液中及純二甲苯中，使溶液透明各3min。（8）將切片材料移到載玻片上，在二甲苯未干時立即加一滴中性樹膠封片，而后將玻片平放，自然晾干或置于35℃溫箱中烘干。染色結果：木質化細胞壁呈現紅色，纖維素細胞壁呈現藍色或淡綠色。四、常用的生物學染色技術（一）植物組織染色（planttissuestaining）2）方法二（1）將切得的薄片移入盛有福爾馬林-醋酸-乙醇固定液(FAA)的小容器中，蓋上蓋固定0.5～1h，也可固定24h以上。材料固定后，如不即時制片可移入70%乙醇中長期保存。（2）將材料從固定液中移入盛有蒸餾水的小培養皿中，漂洗0.5～1h，換水一次。（3）將材料移到載玻片上，用吸水紙吸去多余水分，加一滴苯胺番紅染色約10min。（4）吸去染液，滴入95%乙醇洗兩次，去浮色及脫水。（5）加一滴苯胺固綠復染2～5s，并輕輕晃動玻片，使染色均勻。（此步要迅速，若染色時間過長會使紅色全部褪去。）（6）吸去染液，滴入無水乙醇清洗兩次，去浮色及脫水。（7）滴入等量無水乙醇與二甲苯溶液約1min后吸去，再滴入純二甲苯沖洗兩次，使材料透明。（8）擦去材料以外的殘存藥劑，使玻片清潔，但不能使材料上的二甲苯干掉，并及時鏡檢。（9）鏡檢后，如材料的構造清晰，紅綠對比鮮明，立即加一滴中性樹膠封片。染色結果同樣使木質化細胞壁呈現紅色，纖維素細胞壁呈現淡綠色。這種方法更節省時間。四、常用的生物學染色技術（二）植物細胞染色（plantcellstaining）植物細胞的體積微小，且含有較高比例的水，故大多是無色透明的，如果不經染色處理，在顯微鏡下難以看清細胞的結構。因此，要觀察某種細胞時，通常先進行染色處理。在普通光學顯微鏡下可見的細胞基本結構一般為細胞膜、細胞質和細胞核等。1）細胞核染色。植物細胞核的染色常用浮爾根染色法、番紅-結晶紫-橘紅G三重染色法以及蘇木精染色法等。2）鑒定植物細胞死活。死細胞和活細胞不但透性不同，而且pH等情況也不同，對某些染料的反應明顯不同。某些染料能在活細胞的細胞液中積累，卻不能染活的原生質，但能使死細胞的原生質染色而不積累于液泡，所以可根據某些染料活體染色的情況來鑒定細胞死活。具體操作如下。（1）取洋蔥或其他材料，用鑷子撕下表皮（如表皮不易撕下，也可在水中用鋒利的刀片輕輕刮去多余部分），或用刀片做切片若干。（2）將表皮或切片浸入中性溶液5～10min，取出用清水浸洗后置于載玻片水滴內，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察。（3）活細胞一般在液泡內染成紅色至紫色，原生質不染色；死細胞常成橙紅色，原生質和細胞核染色。撕破的細胞只剩細胞壁時，呈淡紅色或淡紫色。四、常用的生物學染色技術（三）植物細胞器染色（plantorganellestaining）在真核細胞中存在著多種具有特殊形態結構和功能的細胞器，如線粒體、高爾基復合體、內質網、溶酶體、中心體、核糖體等。這些細胞器中有的經過特殊的染色后在光鏡下就可被觀察到，而有些細胞器由于體積非常小，只有在電鏡下才可觀察到。1）線粒體染色。線粒體是細胞進行呼吸作用的場所，其形態和數量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態而發生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進行超活染色。這是由于線粒體內的細胞色素氧化酶的作用，使染料始終保持氧化狀態（即有色狀態），呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質中，這些染料被還原為無色的色基（即無色狀態）。以洋蔥鱗莖內表皮細胞線粒體的超活染色為例介紹具體操作方法。（1）用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴于干凈的載玻片上。然后，撕取一小片洋蔥鱗莖內表皮，置于染液中，染色10～15h。（2）用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內表皮組織展平，蓋上蓋玻片進行觀察。（3）將制備好的洋蔥內表皮組織裝片標本放到光鏡下，先用低倍鏡找到形態和著色良好的表皮細胞，然后轉換高倍鏡觀察。在鏡下可見線條狀或顆粒狀的線粒體染成藍綠色。四、常用的生物學染色技術（三）植物細胞器染色（plantorganellestaining）2）液泡染色。中性紅為弱堿性染料，對液泡系的染色有專一性，只將活細胞中的液泡染成紅色，細胞核與細胞質完全不著色，這可能與液泡中某些蛋白質有關。下面以洋蔥內表皮細胞液泡系的活體染色為例介紹具體操作方法。（1）撕取洋蔥鱗莖內表皮。（2）置于加有一滴1/3000的中性紅染液的載玻片中，染色5～10h。（3）用吸水紙吸去染液，換上Ringer液，蓋上蓋玻片。（4）顯微鏡下觀察，可見被染成磚紅色的中央大液泡。四、常用的生物學染色技術（四）植物細胞染色體染色（plantchromosomestaining）1）浮爾根染色浮爾根（Feulgen）染色是鑒別細胞核中DNA的組織化學方法,其原理與希夫試劑的化學性質有關。希夫試劑是由堿性品紅與亞硫酸氫鈉和鹽酸作用而生成的,為無色透明的溶液,遇醛類物質即呈紫紅色,故可用于鑒定醛基的存在。DNA分子結構中本身無醛基,但在60℃1mol/L鹽酸的水解作用下,部分地打斷DNA分子中脫氧核糖與嘌呤間的糖苷鍵,使嘌呤堿基脫落,并在脫氧核糖的第一個碳原子上釋放出活性醛基,該基團遇希夫試劑即呈紫紅色。在細胞內只有DNA才具有這種反應,故可定性地鑒定細胞核內DNA的存在。這一染色方法是Feulgen和Rossenbeck于1924年首先發現和確定的,故稱浮爾根染色。四、常用的生物學染色技術（四）植物細胞染色體染色（plantchromosomestaining）1）浮爾根染色以蠶豆根尖細胞染色體染色為例介紹浮爾根染色的具體操作。（1）固定：蠶豆根尖材料用卡諾固定液處理4～8h，貯存在70%乙醇中備用。（2）準備：取出根尖，先后用50%乙醇和蒸餾水漂洗兩次。用吸水紙吸干上面的水分。（3）水解：將根尖在冷（室溫，下同）的1mol/LHCl中浸1～2min后，轉移到60℃（±0.5℃）的1mol/LHCl中，溫育10～15min,隨后用冷的1mol/LHCl略洗，蒸餾水漂洗,倒去蒸餾水。（4）染色：取出根尖，放入含有希夫試劑的染色缸中，用黑紙包好，染色3h以上。（5）漂洗：倒去希夫試劑，用漂洗液洗3次，每次3～5min。流水沖洗10～15min，然后用蒸餾水洗1次。（6）壓片：置根尖于載玻片上，加一滴45%乙酸溶液。加蓋玻片，壓片。（7）鏡檢：在顯微鏡下觀察，可見到間期核中的染色質和分裂期的染色體被染成紫紅色，而細胞質和核仁未著色。（8）制作永久片：選擇較好的壓片，制成永久片。四、常用的生物學染色技術（四）植物細胞染色體染色（plantchromosomestaining）2）醋酸洋紅染色（1）根尖培養：將前一年收獲的洋蔥的老鱗片剝去，用刀子稍稍削去根基部的老根，再放入清水中發根。水以浸沒根基部為宜，每天換1次清水，3～4天后。根基部長出大量的根（洋蔥經一定時期的低溫處理，打破了根的休眠期，從而促進了根的萌發和生長）。培養至根長1～2cm時，切取根尖。（2）預處理：切下根尖，投入預處理液（秋水仙素）中處理3～4h。（3）固定：根尖用水沖洗兩次，然后移入卡諾固定液中（固定液的量約為材料的10倍，要求一個容器中所裝的材料不能太多，溫度不能太高）。固定2～24h后用95%乙醇沖洗。（4）解離：取根尖加入1mol/LHCl的解離液，解離液的量是材料的3～4倍，室溫下解離10～15min。解離完畢，用自來水換洗3次，每次5min，將解離液徹底洗凈。（5）染色與壓片：取一解離好的根尖置于載玻片中間，切去根冠（因為根冠細胞的細胞壁要比根尖分生區的細胞厚得多），從分生組織（經酸解離后，根尖的頂端有一小段乳白色的組織即為分生組織）中切取一段，加一小滴醋酸洋紅染液，5min后加蓋玻片，用吸水紙放在蓋玻片上面，左手按住載玻片，右手拇指在吸水紙上對準根尖部位施加壓力，使材料均勻分散。（6）鏡檢：先在低倍鏡下觀察，可觀察到有絲分裂過程中不同分裂時期的染色體。四、常用的生物學染色技術（四）植物細胞染色體染色（plantchromosomestaining）3）鐵明礬-蘇木精染色該染色方法是在根尖細胞有絲分裂染色體計數中效果最好的一種方法。（1）將解離沖洗后的材料置于4%鐵明礬溶液中染色2～4h,如加溫（30～40℃）媒染，則可縮短至0.5～1h。換水洗滌4~5次，每次約5min,務必將殘留的鐵明礬充分洗凈。再置于0.5%蘇木精水溶液中染色2～4h。（2）染色后的材料用水沖洗5～10min，移入45%乙酸溶液內進行分色和軟化10～20min，方可壓片。（3）壓片時，用鑷子取根尖置于載玻片上，切下根尖分生組織，將其切成薄片，滴一小滴45%乙酸溶液，迅速搗碎根尖，加蓋玻片，壓片。（4）鏡檢。4）改良苯酚品紅染色根尖解離后，將根尖放在載玻片中央，用刀片將根冠和伸長區切除，只留乳白色的分生區，滴上一滴改良苯酚品紅染液，染色8～15min后，蓋上蓋玻片。用吸水紙放在蓋玻片上，左手按住載玻片，右手拇指在吸水紙上對準根尖部位施加壓力，使材料均勻分散。四、常用的生物學染色技術（五）動物組織染色（肝臟的組織染色法——Mallory苯胺藍染色法）1）肝組織固定于Zenker液中。2）石蠟切片，脫蠟。3）以0.5%酸性復紅水溶液染5min。4）速洗或不洗，直接浸入下列染液中染10～20min（水溶性苯胺藍0.5g，橙黃G2g，1%磷鉬酸水溶液100mL）。5）蒸餾水速洗。6）95%乙醇分色并脫水。7）無水乙醇脫水。8）二甲苯透明。9）封片。四、常用的生物學染色技術（六）動物細胞染色（animalcellstaining）1）細胞核染色：常用的染料有甲苯胺藍、蘇木精、胭脂紅、番紅、甲基綠、結晶紫等。以人口腔黏膜上皮細胞為例介紹甲苯胺藍染色法。（1）取材：用牙簽伸入自己的口腔內，在口腔內壁單向刮取黏膜上皮細胞5～6次。（2）涂片：將牙簽上的黏膜上皮細胞按一定的方向涂在潔凈的載玻片上。（3）染色：加一滴1%甲苯胺藍溶液染色約1min后加蓋蓋玻片（盡量避免產生氣泡），用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。（4）觀察：將自制的口腔上皮細胞標本置于顯微鏡下觀察。先用低倍鏡尋找較分散的、輪廓清晰的上皮細胞；然后換高倍鏡，在高倍鏡下可見人口腔上皮細胞的細胞核被染成深藍色，細胞質被染成淺藍色。2）鑒定細胞死活（臺盼藍染色法）細胞膜喪失完整性，細胞即可被認為已經死亡。臺盼藍(trypanblue)是檢測細胞膜完整性最常用的生物染色試劑。健康的正常細胞能夠排斥臺盼藍，而死亡的細胞，膜的完整性喪失，通透性增加，細胞可被臺盼藍染成藍色。依據此原理，細胞經臺盼藍染色后，可通過顯微鏡，直接鏡下計數或拍照后計數，實現對細胞存活率比較精確的定量分析。

四、常用的生物學染色技術（七）動物細胞器染色（animalorganellesstaining）1）線粒體染色（人口腔黏膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察）（1）取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/5000詹納斯綠B染液。（2）實驗者用牙簽寬頭在自己口腔頰黏膜處稍用力刮取上皮細胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10～15min（不可使染液干燥，必要時可再加滴染液）。蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。（3）在低倍鏡下選擇平展的口腔上皮細胞，換高倍鏡或油鏡進行觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ毎暮酥車|中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或短棒狀的結構，即線粒體。四、常用的生物學染色技術（七）動物細胞器染色（animalorganellesstaining）2）高爾基復合體染色高爾基復合體可用硝酸鈾染液、硝酸鈷-硝酸銀染液、氯化鉻-甲醛染液、升汞-鋨酸染液等染色。以硝酸鈷-硝酸銀染液染色法為例介紹高爾基復合體染色步驟。（1）將組織固定于A液3～8h，固定一段時間后將組織切小再繼續固定。（2）蒸餾水洗。（3）在硝酸銀水溶液（B液）中染24～48h（暗處）。（4）蒸餾水速洗。（5）用Cajal液浸12～24h。（6）蒸餾水洗30min。四、常用的生物學染色技術（7）石蠟包埋、切片。（8）脫蠟后用蒸餾水洗。（9）用硫代硫酸鈉水溶液（C液）固定5～10min。（10）以明礬胭脂紅對比染色。（11）脫水、透明、封片。（七）動物細胞器染色（animalorganellesstaining）2）高爾基復合體染色A液：B液：1.5%硝酸銀水溶液C液：5%硫代硫酸鈉Cajal液：四、常用的生物學染色技術（八）動物染色體染色（animalchromosomestaining）有姬姆薩染色法、苯酚品紅染色法、醋酸洋紅染色法、浮爾根染色法四種。1）姬姆薩染色法（小鼠骨髓染色體）（1）秋水仙素處理：選擇體重20g左右的小白鼠1只，于處死前4h向其腹腔注射100μg/mL秋水仙素（注射量按每克體重1.5～2μg計算）。（2）取材：以頸椎脫臼法處死小白鼠，置于解剖板上，迅速剪開皮膚，剝離肌肉取出兩后肢的股、脛骨，剪去股骨兩頭，用備好的注射器抽取低滲液（0.075mol/L的KCl）將骨髓沖入離心管內，反復沖洗，直到股骨發白。用同法依次取其余各段股、脛骨的骨髓，一并沖入同一離心管內，然后用吸管吹打骨髓細胞使其分散。置37℃恒溫水浴鍋中，保溫30min后取出，加入1mL新配制的Carnoy固定液預固定，混勻后以800～1000rpm/min離心10min，去上清液。四、常用的生物學染色技術（八）動物染色體染色（animalchromosomestaining）1）姬姆薩染色法（小鼠骨髓染色體）（3）固定：加入新配制的固定液5mL，用吸管吹打混勻，固定15min，以1000rpm/min離心10min，去上清液，加入上述固定液少許，吹打成細胞懸液，以備制片。（4）制片：從冰箱中取出預冷載玻片，將其傾斜30°，吸取細胞懸液距載玻片15～30cm滴1～2滴（不要重疊）在載玻片上，然后順載玻片斜面輕輕用口吹散，用空氣干燥或酒精燈火焰干燥。（5）染色：用Giemsa原液和磷酸緩沖液（pH為6.8）以1∶10配成Giemsa染液，在玻片標本上滴幾滴并鋪勻，染色8～10min，倒去染液，用自來水（或洗瓶）緩緩沖洗干凈、晾干。四、常用的生物學染色技術（八）動物染色體染色（animalchromosomestaining）2）苯酚品紅染色法（果蠅唾液腺染色體）（1）剝取唾液腺①挑取果蠅三齡幼蟲。用解剖針從培養瓶中挑取行動遲緩、爬上管壁但未蛹化的肥大幼蟲，體長約5mm。個體肥大的幼蟲是制作唾液腺染色體的基礎。②區分幼蟲的頭部。蟲體尖細的一端為頭部，有黑色的口器。另外，果蠅的頭部引領身體一伸一縮向前挪動。③拉取并剝離唾液腺。左右兩手各執一根解剖針，分別扎住幼蟲頭、尾的1/3處，右手迅速向左拉開。在顯微鏡下找出唾液腺，并用解剖針把周圍不需要的組織剝離，用吸水紙擦去，盡可能剝離附著在唾液腺上的脂肪組織，然后滴一滴生理鹽水于載玻片上。（2）解離和染色：用吸水紙吸去多余的生理鹽水，在唾液腺上滴一滴1mol/L的HCl解離1～2min；然后用吸水紙吸去鹽酸，再用蒸餾水漂洗3次，以使唾液腺細胞吸水充分膨脹，染色體較好地分散開。用吸水紙吸去多余的蒸餾水，滴加改良的苯酚品紅染液，染色10min。（3）壓片及觀察：染色完成后，蓋上干凈的蓋玻片，并覆一層濾紙。將玻片放在實驗臺上，用大拇指用力壓住，并橫向揉幾次。先用低倍鏡進行觀察，找到分散好的染色體再轉用高倍鏡進行觀察。四、常用的生物學染色技術（九）細菌的簡單染色（bacteriasimplestaining）1）原理在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，堿性染料在電離時，其分子染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色，故可用單一的堿性染料對細菌進行染色。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、酒精燈等。（2）實驗材料：菌種為枯草芽孢桿菌、四聯球菌；染劑為齊氏石碳酸復紅染液。3）操作步驟（1）先將載玻片洗凈，擦干。（2）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴生理鹽水，在無菌操作條件下從斜面上挑取少許菌苔涂于水滴中，混勻，涂成薄膜，越薄越好，注意取菌不要太多。四、常用的生物學染色技術（九）細菌的簡單染色（bacteriasimplestaining）3）操作步驟（3）晾干：讓涂片自然晾干。（4）固定：手執載玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2～3次固定（以不燙手為宜）。（5）染色：滴加染液于涂片上，染液剛好覆蓋涂片薄膜即可。（6）水洗：倒去染液，用水沖洗，直到流下的水為無色。（7）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（8）鏡檢：先低倍鏡觀察，再高倍鏡觀察，找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加一滴香柏油，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀察細菌形態。4）結果觀察通過油鏡可看到枯草芽孢桿菌呈桿狀、線狀排列，四聯球菌常四個球菌排成方形。四、常用的生物學染色技術（十）革蘭氏染色（gramstaining）1）原理由于細菌細胞壁的結構和組成不同，革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。當用結晶紫初染后，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。將碘液作為媒染劑，其能與結晶紫結合成結晶紫和碘的復合物，增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇脫色時溶解類脂質，增加細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，細菌被脫色，再經番紅復染后呈紅色。革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、酒精燈等。（2）實驗材料：菌種為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌；染劑為草酸銨結晶紫染液、番紅染液；媒染劑為碘液；脫色劑為95%乙醇。四、常用的生物學染色技術（十）革蘭氏染色（gramstaining）3）操作步驟（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴生理鹽水，在無菌操作條件下從斜面上挑取少許菌苔涂于水滴中，混勻，涂成薄膜，越薄越好，注意取菌不要太多。（2）晾干：讓涂片自然晾干。（3）固定：手執載玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2～3次固定（以不燙手為宜）。（4）結晶紫染色：加適量（以蓋滿細菌涂面）的結晶紫染色液染色1min。（5）水洗：倒去染色液，用水小心沖洗。（6）媒染：用碘液媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色10～18s至流出液無色，立即水洗。（9）復染：滴加番紅復染2min。（10）水洗：用水洗去涂片上的番紅染液。（11）干燥：將染好的涂片用吸水紙吸干。（12）鏡檢：鏡檢時先用低倍鏡，再用高倍鏡，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應。4）結果用油鏡觀察可看到枯草芽孢桿菌呈紫色，為革蘭氏陽性菌；大腸桿菌呈微紅色，為革蘭氏陰性菌。四、常用的生物學染色技術（十一）細菌芽孢染色（bacteriasporestaining）1）原理芽孢壁厚、通透性差、不易著色，無法用單染色的方法使其著色，用著色力強的染色劑孔雀綠或石碳酸復紅，在加熱條件下染色，染料不僅能夠進入菌體，也能進入芽孢內。進入菌體的染料經水洗后被脫色，當用對比度大的復染色劑染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，使芽孢和菌體更易區分。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、試管、電爐等。（2）實驗材料：菌種為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌；染液為石碳酸復紅、黑墨汁（需過濾）。3）操作步驟（1）制備菌懸液：加10滴無菌水于小試管內，用接種環挑取2～3環菌苔于試管內，攪拌均勻，制成濃的菌懸液。（2）染色：將15～18滴石碳酸復紅染液加入小試管內，使其與菌懸液混合均勻，然后將試管置于沸水浴的燒杯中，加熱染色8～10min。四、常用的生物學染色技術（十一）細菌芽孢染色（bacteriasporestaining）3）操作步驟（3）涂片固定：用接種環挑取試管底部菌懸液數環涂于潔凈載玻片上，涂成薄膜，然后將涂片通過火焰3次加熱固定。（4）脫色：用95%乙醇脫色，直至流出液無紅色為止。（5）水洗：用水小心沖洗。（6）復染：在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再勻速推向另一端，涂成均勻的薄層，自然干燥。（7）鏡檢：干燥后用油鏡觀察。4）結果通過油鏡可看到，枯草芽孢桿菌的芽孢呈紅色，營養體透明，芽孢有的著生在桿菌的中間部位，有的著生在靠近桿菌端部；巨大芽孢桿菌的芽孢也呈紅色，營養體也透明，但巨大芽孢桿菌的芽孢比較大，含芽孢的巨大芽孢桿菌菌體膨大變形，呈圓柱形，芽孢居于營養體中間。四、常用的生物學染色技術（十二）細菌莢膜染色（bacteriacapsularstaining）1）原理莢膜是包圍細菌細胞的一層黏液性物質，具有明確的外緣，牢固附著在菌體細胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達90%以上，易變形。莢膜染色通常采用襯托染色法或負染法，即將菌體和背景分別著色，從而把不著色且透明的莢膜襯托出來。2）材料和器材（1）菌種：褐球固氮菌。（2）染色劑：石碳酸復紅、黑墨汁（已過濾）。（3）其他：載玻片、無菌水、洗瓶、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯、香柏油、接種用具、95%乙醇。四、常用的生物學染色技術（十二）細菌莢膜染色（bacteriacapsularstaining）3）操作步驟（1）取培養72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥（不可用火焰烘干）。（2）滴入1～2滴95%乙醇固定（不可加熱固定）。（3）加石碳酸復紅染液染色1～2min，水洗，自然干燥。（4）在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再勻速推向另一端，涂成均勻的薄層，自然干燥。（5）干燥后用油鏡觀察。4）結果菌體呈紅色，莢膜為無色，背景呈黑色。四、常用的生物學染色技術（十三）細菌鞭毛染色（bacteriaflagellumstaining）1）原理細菌的鞭毛極纖細，直徑一般為0.1～0.2μm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學顯微鏡下也能觀察到。鞭毛染色的基本原理：在染色前先用媒染劑(如單寧酸或鉀明礬)處理，讓媒染劑沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色（如堿性復紅、硝酸銀、結晶紫）。常用的媒染劑由單寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、擦鏡紙、接種環、酒精燈、載玻片、凹載玻片、蓋玻片、鑷子、細玻棒、吸水紙等。（2）實驗材料：菌種為枯草芽孢桿菌（鞭毛周生）、銅綠假單胞菌（鞭毛端生）；染液為硝酸銀鞭毛染色劑A液和B液、95%乙醇和蒸餾水。四、常用的生物學染色技術（十三）細菌鞭毛染色（bacteriaflagellumstaining）3）操作步驟（1）載玻片準備：將載玻片清洗后，置于95%的乙醇溶液中浸泡20min，使用時取出在火焰上燒去乙醇及可能殘留的油跡。（2）制片：在處理好的載玻片一端滴一滴蒸餾水，用接種環無菌操作從枯草芽孢桿菌（或銅綠假單孢菌)斜面上挑取菌種，在載玻片液滴上輕輕蘸一下，使液滴表面形成一薄層菌膜；隨后傾斜玻片，使菌懸液緩慢流向另一端，用吸水紙在載玻片邊緣處吸去多余的菌懸液，自然干燥。（3）染色：滴加硝酸銀鞭毛染色劑A液覆蓋菌面3～5min后，用蒸餾水充分洗去A液；用B液洗去殘留水分，再滴加B液覆蓋菌面數秒至1min，其間可用微火加熱，當菌面出現明顯褐色時，立即用蒸餾水沖洗，自然干燥。（4）鏡檢：先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察，最后用油鏡觀察。四、常用的生物學染色技術（十三）細菌鞭毛染色（bacteriaflagellumstaining）4）結果（見下表）菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。四、常用的生物學染色技術（十四）細菌抗酸染色（bacteriaacid

faststaining）1）原理分枝桿菌的細胞壁含有較多的類脂質，極易與石碳酸復紅染色劑結合，著色后不易被酸性乙醇脫色，因此這類細菌被稱為抗酸性細菌，其他類型的細菌容易被脫色。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、載玻片、接種環、酒精燈、鑷子等。（2）實驗材料：菌種為結核分枝桿菌。（3）染劑：石碳酸復紅染液、酸性乙醇、呂氏堿性美藍染液。四、常用的生物學染色技術（十四）細菌抗酸染色（bacteriaacid

faststaining）3）操作步驟（1）滴加石碳酸復紅染液于玻片上并緩緩加熱，使染液冒蒸氣但不沸騰。并繼續滴加染液，但不使染液蒸干，保持操作5min。（2）涂片冷卻后，傾倒染液，用酸性乙醇脫色，直到流下來的酸性乙醇無色后用水洗。（3）用呂氏堿性美藍染液復染2～3min。（4）水洗，用吸水紙吸干或晾干，鏡檢。4）結果抗酸性細菌菌體呈紅色，即抗酸染色陽性；非抗酸性細菌菌體呈藍色。四、常用的生物學染色技術（十五）細菌細胞壁染色（bacteriacellwallstaining）1）原理。細菌細胞壁的常用染色法主要有兩種：一種是單寧酸法，另一種是磷鉬酸法。單寧酸和磷鉬酸都起媒染作用，它們使細胞壁形成可著色的復合物，而使細胞質不易被著色，經結晶紫或甲基綠染色后，便可在普通光學顯微鏡下觀察到細胞壁。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、載玻片、接種環、酒精燈、鑷子等。（2）實驗材料：菌種為巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌；染色劑為結晶紫染液、單寧酸水溶液、磷鉬酸水溶液、甲基綠染液。四、常用的生物學染色技術（十五）細菌細胞壁染色（bacteriacellwallstaining）3）操作步驟（1）單寧酸法①將巨大芽孢桿菌或者枯草芽孢桿菌按常法制成涂片。②用單寧酸水溶液染5min后，水洗。③用結晶紫染液染3～5min。④水洗，用吸水紙吸干或晾干，鏡檢。⑤油鏡下，細胞壁呈紫色，細胞質呈淡紫色。四、常用的生物學染色技術（2）磷鉬酸法①制備濃厚的涂片，在未干時浸入磷鉬酸水溶液3～5min。②用甲基綠染液染3～5min。③水洗后，用吸水紙吸干或晾干，鏡下觀察。④細胞壁呈綠色，細胞質為無色。（十六）淀粉染色（starchstaining）淀粉是白色無定形粉末，由直鏈淀粉（占10%～30%）和支鏈淀粉（占70%～90%）組成。直鏈淀粉能溶于熱水而不呈糊狀。支鏈淀粉不溶于水，熱水與之作用則膨脹而成糊狀。溶于水中的直鏈淀粉呈彎曲形態，并借分子內氫鍵卷曲成螺旋狀，加入碘酒，碘分子便鉆入螺旋當中空隙，與直鏈淀粉結合在一起，從而形成絡合物。這種絡合物能比較均勻地吸收除藍光以外的其他可見光（波長范圍為400～750nm），從而使淀粉變為深藍色。四、常用的生物學染色技術（十七）糖類染色（sugarstaining）1）斐林試劑。還原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的單糖和某些二糖（如乳糖和麥芽糖）。在堿性溶液中，還原糖能將Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金屬離子還原，而糖本身被氧化成糖酸及其他產物。糖類的這種性質常被用于糖的定性和定量測定。2）過碘酸希夫反應法。過碘酸是一種強氧化劑，過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變為乙二醛基，乙二醛基繼而與希夫試劑結合，希夫試劑本為無色亞硫酸品紅復合物，與乙二醛基結合后形成紫紅色反應物。顏色反應的深淺取決于組織內多糖（包括糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖脂等）的乙二醇分子的多少。四、常用的生物學染色技術（十八）脂肪染色（fatstaining）脂肪染色可用蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、油紅O、蘇丹黑等進行染色，常用的是蘇丹Ⅲ染色法。1）蘇丹Ⅲ染色法（1）原理蘇丹Ⅲ是弱酸性染料,由NaOH、CuSO4組成，呈紅色粉末狀,易溶于脂肪和乙醇(溶解度為0.15%)。蘇丹Ⅲ是脂肪染色劑，脂肪和蘇丹染液有比較強的親和力，蘇丹Ⅲ遇脂肪變為橘黃色，適用于生物脂肪材料的鑒定，可在光學顯微鏡下看到被染成橘黃色的小粒。四、常用的生物學染色技術（十八）脂肪染色（fatstaining）1）蘇丹Ⅲ染色法（2）操作方法①處死小鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，用鑷子提起小腸將蓋玻片緊貼于腸系膜，用剪刀將蓋玻片和其上黏附的腸系膜取下，反扣于已滴加甲醛鈣的載玻片上，固定20min。②用吸管吸取蒸餾水滴入載玻片與蓋玻片之間沖洗掉甲醛鈣溶液。③用70%乙醇溶液代替蒸餾水重復步驟②的操作，沖洗。④滴加蘇丹Ⅲ于蓋玻片上，染色30min。⑤吸去載玻片上溢出的染液，擦凈載玻片表面及周邊，用顯微鏡觀察。（3）實驗結果：脂肪細胞呈圓球形，其內充滿橘黃色物質，細胞外液有分散的橘黃色圓脂肪滴四、常用的生物學染色技術（十八）脂肪染色（fatstaining）2）油紅O脂類染色法（1）原理油紅O屬于偶氮染料，是很強的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結合呈小脂滴狀。脂溶性染料溶于組織和細胞中的脂類，在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當組織切片置入染液中時，染料即離開染液而溶于組織內的脂類(如脂滴)中，使組織內的脂類呈橘紅色。（2）操作方法①切片用甲醛鈣固定10min。②用蒸餾水沖洗。③用60%異丙醇浸洗。④用油紅O染液染10min（染液可回收再利用）。

四、常用的生物學染色技術（十八）脂肪染色（fatstaining）2）油紅O脂類染色法（2）操作方法⑤用60%異丙醇分色至背景無色。⑥用蒸餾水沖洗。⑦用Mayer蘇木精復染。⑧用自來水沖洗（藍化）1～3min。⑨用蒸餾水沖洗。⑩用甘油明膠封片。（3）結果組織細胞中脂滴呈橘紅色，核呈藍色。四、常用的生物學染色技術（十九）蛋白質染色（proteinstaining）常用的蛋白質染色試劑有雙縮脲試劑、考馬斯亮藍、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中考馬斯亮藍染色法的應用較為廣泛?？捡R斯亮藍染色法（coomassiebluestaining）又稱為Bradford法，是Bradford于1976年建立起來的一種蛋白質濃度的測定方法。1）原理考馬斯亮藍G-250在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變為青色，蛋白質\|色素結合物在595nm波長下達到最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右達到平衡，反應十分迅速，其結合物在室溫下1h內保持穩定。該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級的蛋白質含量。測定蛋白質濃度范圍為0～1000μg/mL，最小可測定2.5μg/mL的蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。四、常用的生物學染色技術（十九）蛋白質染色（proteinstaining）2）操作方法該方