生物學(xué)基本技能基本技能

Ⅺ染色劑和染色01.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?2.生物學(xué)常用的染料03.常用染液的配制04.常用的生物學(xué)染色技術(shù)05.實(shí)驗(yàn)操作實(shí)訓(xùn)目錄Contents1.規(guī)范操作常用的染色技術(shù)。2.掌握常用染色劑的配制方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄒ唬┨烊蝗玖咸烊蝗玖现饕獊碓从谥参铩?dòng)物、微生物或天然彩色礦石，其特征是一般可以自然降解，大部分無毒性，不污染環(huán)境。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的天然染料多為植物染料。蘇木精（hematoxylin）。是南美的蘇木（熱帶豆科植物）干枝中用乙醚浸漬出來的一種色素，是最常用的染料之一。蘇木精不能直接染色，被染材料必須經(jīng)金屬鹽的媒劑作用后才有著色力，所以在配制蘇木精染色時(shí)一般都要用媒染劑。常用的媒染劑有硫酸鋁銨（銨明礬）、硫酸鋁鉀（鉀明礬）等。蘇木精是染細(xì)胞核的優(yōu)良材料。用酸性溶液（如鹽酸\|酒精）分化后呈紅色，水洗后仍恢復(fù)青藍(lán)色；用堿性溶液（如氨水）分化后呈藍(lán)色，水洗后呈藍(lán)黑色。洋紅（carmine）。又叫胭脂紅或卡紅，是將一種產(chǎn)自熱帶的雌性胭脂蟲干燥后，磨成粉末，提取出蟲紅，再用明礬處理，除去其中雜質(zhì)而制成的染料。單純的洋紅不能染色，要經(jīng)酸性或堿性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，堿性溶液有氨水、硼砂等。洋紅是細(xì)胞核的優(yōu)良染料，適于小型材料的整體染色。番紅（safranine）。是從藏紅花柱頭中提取的一種天然染色劑，為橙紅色粉末，可溶解于水和乙醇。常用于組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)的生物染色，能對植物的木質(zhì)化、栓質(zhì)化和角質(zhì)化部分進(jìn)行染色，能將細(xì)胞核、染色體和花粉外壁等染成鮮艷的紅色，其常與固綠等進(jìn)行合作染色。番紅在分析化學(xué)中也被用作氧化還原指示劑。二、生物學(xué)常用的染料（二）人工染料人工染料主要是人工合成的一類染料，其缺點(diǎn)是經(jīng)日光照射后容易褪色，苯胺藍(lán)、亮綠、甲基綠更易褪色。在制片中注意掌握酸堿度，并避免日光直射，能保持多年不褪色。二、生物學(xué)常用的染料染料特性酸性品紅酸性染料，呈紅色粉末狀，能溶于水，略溶于乙醇。是良好的細(xì)胞質(zhì)染色劑，在動(dòng)物玻片標(biāo)本制片中應(yīng)用廣泛。易和堿起作用剛果紅酸性染料，呈棗紅色粉末狀，能溶于水和乙醇，遇酸呈藍(lán)色。它能做染料，也用作指示劑。可以和蘇木精做二重染色，也可以做類淀粉染色甲基藍(lán)弱酸性染料，能溶于水和乙醇。在動(dòng)植物的制片技術(shù)方面應(yīng)用極廣。極易被氧化，因此染色后不能長久保存固綠酸性染料，能溶于水、乙醇。是一種染含有漿質(zhì)的纖維素細(xì)胞組織的染色劑，在染細(xì)胞和植物組織上應(yīng)用極廣蘇丹Ⅲ弱酸性染料，呈紅色粉末狀，易溶于脂肪和乙醇伊紅紅色酸性染料，在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，是鑒別產(chǎn)酸性細(xì)菌的一種培養(yǎng)基添加劑。常用的是伊紅Y，伊紅Y是一種化學(xué)合成的酸性染料（二）人工染料二、生物學(xué)常用的染料染料特性堿性品（復(fù)）紅堿性染料，呈暗紅色粉末或結(jié)晶狀，能溶于水、乙醇。在生物學(xué)制片中用途很廣結(jié)晶紫堿性染料，能溶于水、乙醇。在細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)和細(xì)菌學(xué)等方面應(yīng)用極廣，是一種優(yōu)良的染色劑龍膽紫混合的堿性染料，主要是結(jié)晶紫和甲基紫的混合物。醫(yī)藥上用的紫藥水，主要成分是甲基紫中性紅弱堿性染料，呈紅色粉末狀，能溶于水、乙醇。無毒，常作為活體染色的染料亞甲藍(lán)或美藍(lán)堿性染料，呈藍(lán)色粉末狀，能溶于水、乙醇。是動(dòng)物學(xué)和細(xì)胞學(xué)染色中十分重要的細(xì)胞核染料，其優(yōu)點(diǎn)是染色不會過深甲基綠是堿性染料，呈綠色粉末狀，能溶于水、乙醇。是最有價(jià)值的細(xì)胞核染色劑，細(xì)胞學(xué)中常用來染染色質(zhì)姬姆薩是用天青色素、伊紅、次甲藍(lán)混合而成的一種染料，可對血液涂片、血細(xì)胞、瘧原蟲、立克次體、骨髓細(xì)胞、脊髓細(xì)胞等標(biāo)本進(jìn)行染色（一）呂氏（Loeffer）堿性美藍(lán)染液配制A液：B液：配制方法：分別配制A液和B液，配好后混合即可。三、常用染液的配制（二）齊氏（Ziehl）石炭酸復(fù)紅染液配制A液：B液：配制方法：將堿性復(fù)紅在研缽中研磨后，逐漸加入95%乙醇，繼續(xù)研磨使其溶解，配成A液。將石炭酸溶于蒸餾水中，配成B液。混合A液及B液即成。通常可將此混合液稀釋5～10倍使用，稀釋液易變質(zhì)失效，一次不宜多配。三、常用染液的配制（三）革蘭氏（Gram）染液配制1）草酸銨結(jié)晶紫染液A液：B液：配制方法：混合A液及B液，靜置48h后使用。三、常用染液的配制（三）革蘭氏（Gram）染液配制2）盧戈（lugol）碘液配制方法：先將碘化鉀溶解在少量蒸餾水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加足量的蒸餾水即可。三、常用染液的配制（三）革蘭氏（Gram）染液配制3）脫色液95%乙醇溶液。4）番紅復(fù)染液配制方法：取上述配好的番紅乙醇溶液10mL與90mL蒸餾水混勻即可。三、常用染液的配制（四）芽孢染液（sporestainingsolution）配制1）孔雀綠染液2）番紅水溶液3）苯酚品紅溶液配制方法：取上述溶液10mL與100mL的5%苯酚溶液混合，過濾備用。三、常用染液的配制（四）芽孢染液（sporestainingsolution）配制4）黑色素溶液配制方法：稱取10g黑色素溶于100mL蒸餾水中，置沸水浴中30min后，用濾紙過濾兩次，加蒸餾水至100mL，加0.5g甲醛備用。三、常用染液的配制（五）莢膜染液（capsulestainingsolution）配制1）黑色素水溶液配制方法：將黑色素在蒸餾水中煮沸5min，加入福爾馬林作防腐劑。2）番紅染液與革蘭氏染液中番紅復(fù)染液配制法相同。三、常用染液的配制（六）鞭毛染液（flagellumstainingsolution）配制1）硝酸銀鞭毛染液A液：在冰箱內(nèi)可以保存3～7天，延長保存期會產(chǎn)生沉淀，但用濾紙除去沉淀后仍能使用。B液：配制方法：待AgNO3充分溶解后，取出10mL備用，向其余的90mLAgNO3中滴入NH4OH，使之成為濃厚懸浮液，再繼續(xù)滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新剛剛?cè)芙鉃橹埂溆玫?0mLAgNO3緩慢滴入，則出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到搖動(dòng)后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止。通常在冰箱內(nèi)保存10天內(nèi)仍可使用。如霧重，為析出銀鹽沉淀，不宜再使用。三、常用染液的配制（六）鞭毛染液（flagellumstainingsolution）配制2）Leifson鞭毛染液A液：B液：C液：臨用前將A、B、C液等量混合均勻后使用。三種溶液分別于室溫保存，可保存數(shù)周；若分別置冰箱保存，可保存數(shù)月。混合液裝密封瓶內(nèi)置于冰箱中數(shù)周內(nèi)仍可使用。三、常用染液的配制（一）植物組織染色（planttissuestaining）植物組織染色的常用方法是番紅-苯胺藍(lán)（或固綠）二重染色法，具體操作方法有兩種。1）方法一（1）將植物切片材料放入30%乙醇中，5min后移入水中。（2）用0.1%番紅水溶液染色12～24h。（3）倒去番紅水溶液，用清水沖洗數(shù)次后，再放回50%乙醇中浸泡5min。（4）將材料從50%乙醇中轉(zhuǎn)入70%乙醇中脫色，直至硬木質(zhì)化的細(xì)胞壁呈現(xiàn)紅色，其他部分呈粉紅色或近于無色時(shí)為止。（5）用1%苯胺藍(lán)（用70%乙醇配制）對染2～5min。若用0.1%固綠對染，則0.5min左右即可。（此步要不時(shí)地在顯微鏡下檢視，切忌染色過深，當(dāng)木質(zhì)化細(xì)胞壁呈紅色、其他部分為淡藍(lán)或淡綠色時(shí)，即可停止。）（6）用95%乙醇沖去多余染液，再經(jīng)無水乙醇脫水5min。（7）放入等量無水乙醇與二甲苯溶液中及純二甲苯中，使溶液透明各3min。（8）將切片材料移到載玻片上，在二甲苯未干時(shí)立即加一滴中性樹膠封片，而后將玻片平放，自然晾干或置于35℃溫箱中烘干。染色結(jié)果：木質(zhì)化細(xì)胞壁呈現(xiàn)紅色，纖維素細(xì)胞壁呈現(xiàn)藍(lán)色或淡綠色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（一）植物組織染色（planttissuestaining）2）方法二（1）將切得的薄片移入盛有福爾馬林-醋酸-乙醇固定液(FAA)的小容器中，蓋上蓋固定0.5～1h，也可固定24h以上。材料固定后，如不即時(shí)制片可移入70%乙醇中長期保存。（2）將材料從固定液中移入盛有蒸餾水的小培養(yǎng)皿中，漂洗0.5～1h，換水一次。（3）將材料移到載玻片上，用吸水紙吸去多余水分，加一滴苯胺番紅染色約10min。（4）吸去染液，滴入95%乙醇洗兩次，去浮色及脫水。（5）加一滴苯胺固綠復(fù)染2～5s，并輕輕晃動(dòng)玻片，使染色均勻。（此步要迅速，若染色時(shí)間過長會使紅色全部褪去。）（6）吸去染液，滴入無水乙醇清洗兩次，去浮色及脫水。（7）滴入等量無水乙醇與二甲苯溶液約1min后吸去，再滴入純二甲苯?jīng)_洗兩次，使材料透明。（8）擦去材料以外的殘存藥劑，使玻片清潔，但不能使材料上的二甲苯干掉，并及時(shí)鏡檢。（9）鏡檢后，如材料的構(gòu)造清晰，紅綠對比鮮明，立即加一滴中性樹膠封片。染色結(jié)果同樣使木質(zhì)化細(xì)胞壁呈現(xiàn)紅色，纖維素細(xì)胞壁呈現(xiàn)淡綠色。這種方法更節(jié)省時(shí)間。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（二）植物細(xì)胞染色（plantcellstaining）植物細(xì)胞的體積微小，且含有較高比例的水，故大多是無色透明的，如果不經(jīng)染色處理，在顯微鏡下難以看清細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。因此，要觀察某種細(xì)胞時(shí)，通常先進(jìn)行染色處理。在普通光學(xué)顯微鏡下可見的細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)一般為細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核等。1）細(xì)胞核染色。植物細(xì)胞核的染色常用浮爾根染色法、番紅-結(jié)晶紫-橘紅G三重染色法以及蘇木精染色法等。2）鑒定植物細(xì)胞死活。死細(xì)胞和活細(xì)胞不但透性不同，而且pH等情況也不同，對某些染料的反應(yīng)明顯不同。某些染料能在活細(xì)胞的細(xì)胞液中積累，卻不能染活的原生質(zhì)，但能使死細(xì)胞的原生質(zhì)染色而不積累于液泡，所以可根據(jù)某些染料活體染色的情況來鑒定細(xì)胞死活。具體操作如下。（1）取洋蔥或其他材料，用鑷子撕下表皮（如表皮不易撕下，也可在水中用鋒利的刀片輕輕刮去多余部分），或用刀片做切片若干。（2）將表皮或切片浸入中性溶液5～10min，取出用清水浸洗后置于載玻片水滴內(nèi)，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察。（3）活細(xì)胞一般在液泡內(nèi)染成紅色至紫色，原生質(zhì)不染色；死細(xì)胞常成橙紅色，原生質(zhì)和細(xì)胞核染色。撕破的細(xì)胞只剩細(xì)胞壁時(shí)，呈淡紅色或淡紫色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（三）植物細(xì)胞器染色（plantorganellestaining）在真核細(xì)胞中存在著多種具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞器，如線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、中心體、核糖體等。這些細(xì)胞器中有的經(jīng)過特殊的染色后在光鏡下就可被觀察到，而有些細(xì)胞器由于體積非常小，只有在電鏡下才可觀察到。1）線粒體染色。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進(jìn)行超活染色。這是由于線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍(lán)綠色；而線粒體周圍的細(xì)胞質(zhì)中，這些染料被還原為無色的色基（即無色狀態(tài)）。以洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞線粒體的超活染色為例介紹具體操作方法。（1）用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴于干凈的載玻片上。然后，撕取一小片洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，置于染液中，染色10～15h。（2）用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內(nèi)表皮組織展平，蓋上蓋玻片進(jìn)行觀察。（3）將制備好的洋蔥內(nèi)表皮組織裝片標(biāo)本放到光鏡下，先用低倍鏡找到形態(tài)和著色良好的表皮細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察。在鏡下可見線條狀或顆粒狀的線粒體染成藍(lán)綠色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（三）植物細(xì)胞器染色（plantorganellestaining）2）液泡染色。中性紅為弱堿性染料，對液泡系的染色有專一性，只將活細(xì)胞中的液泡染成紅色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)完全不著色，這可能與液泡中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。下面以洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞液泡系的活體染色為例介紹具體操作方法。（1）撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮。（2）置于加有一滴1/3000的中性紅染液的載玻片中，染色5～10h。（3）用吸水紙吸去染液，換上Ringer液，蓋上蓋玻片。（4）顯微鏡下觀察，可見被染成磚紅色的中央大液泡。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（四）植物細(xì)胞染色體染色（plantchromosomestaining）1）浮爾根染色浮爾根（Feulgen）染色是鑒別細(xì)胞核中DNA的組織化學(xué)方法,其原理與希夫試劑的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。希夫試劑是由堿性品紅與亞硫酸氫鈉和鹽酸作用而生成的,為無色透明的溶液,遇醛類物質(zhì)即呈紫紅色,故可用于鑒定醛基的存在。DNA分子結(jié)構(gòu)中本身無醛基,但在60℃1mol/L鹽酸的水解作用下,部分地打斷DNA分子中脫氧核糖與嘌呤間的糖苷鍵,使嘌呤堿基脫落,并在脫氧核糖的第一個(gè)碳原子上釋放出活性醛基,該基團(tuán)遇希夫試劑即呈紫紅色。在細(xì)胞內(nèi)只有DNA才具有這種反應(yīng),故可定性地鑒定細(xì)胞核內(nèi)DNA的存在。這一染色方法是Feulgen和Rossenbeck于1924年首先發(fā)現(xiàn)和確定的,故稱浮爾根染色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（四）植物細(xì)胞染色體染色（plantchromosomestaining）1）浮爾根染色以蠶豆根尖細(xì)胞染色體染色為例介紹浮爾根染色的具體操作。（1）固定：蠶豆根尖材料用卡諾固定液處理4～8h，貯存在70%乙醇中備用。（2）準(zhǔn)備：取出根尖，先后用50%乙醇和蒸餾水漂洗兩次。用吸水紙吸干上面的水分。（3）水解：將根尖在冷（室溫，下同）的1mol/LHCl中浸1～2min后，轉(zhuǎn)移到60℃（±0.5℃）的1mol/LHCl中，溫育10～15min,隨后用冷的1mol/LHCl略洗，蒸餾水漂洗,倒去蒸餾水。（4）染色：取出根尖，放入含有希夫試劑的染色缸中，用黑紙包好，染色3h以上。（5）漂洗：倒去希夫試劑，用漂洗液洗3次，每次3～5min。流水沖洗10～15min，然后用蒸餾水洗1次。（6）壓片：置根尖于載玻片上，加一滴45%乙酸溶液。加蓋玻片，壓片。（7）鏡檢：在顯微鏡下觀察，可見到間期核中的染色質(zhì)和分裂期的染色體被染成紫紅色，而細(xì)胞質(zhì)和核仁未著色。（8）制作永久片：選擇較好的壓片，制成永久片。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（四）植物細(xì)胞染色體染色（plantchromosomestaining）2）醋酸洋紅染色（1）根尖培養(yǎng)：將前一年收獲的洋蔥的老鱗片剝?nèi)ィ玫蹲由陨韵魅ジ康睦细俜湃肭逅邪l(fā)根。水以浸沒根基部為宜，每天換1次清水，3～4天后。根基部長出大量的根（洋蔥經(jīng)一定時(shí)期的低溫處理，打破了根的休眠期，從而促進(jìn)了根的萌發(fā)和生長）。培養(yǎng)至根長1～2cm時(shí)，切取根尖。（2）預(yù)處理：切下根尖，投入預(yù)處理液（秋水仙素）中處理3～4h。（3）固定：根尖用水沖洗兩次，然后移入卡諾固定液中（固定液的量約為材料的10倍，要求一個(gè)容器中所裝的材料不能太多，溫度不能太高）。固定2～24h后用95%乙醇沖洗。（4）解離：取根尖加入1mol/LHCl的解離液，解離液的量是材料的3～4倍，室溫下解離10～15min。解離完畢，用自來水換洗3次，每次5min，將解離液徹底洗凈。（5）染色與壓片：取一解離好的根尖置于載玻片中間，切去根冠（因?yàn)楦诩?xì)胞的細(xì)胞壁要比根尖分生區(qū)的細(xì)胞厚得多），從分生組織（經(jīng)酸解離后，根尖的頂端有一小段乳白色的組織即為分生組織）中切取一段，加一小滴醋酸洋紅染液，5min后加蓋玻片，用吸水紙放在蓋玻片上面，左手按住載玻片，右手拇指在吸水紙上對準(zhǔn)根尖部位施加壓力，使材料均勻分散。（6）鏡檢：先在低倍鏡下觀察，可觀察到有絲分裂過程中不同分裂時(shí)期的染色體。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（四）植物細(xì)胞染色體染色（plantchromosomestaining）3）鐵明礬-蘇木精染色該染色方法是在根尖細(xì)胞有絲分裂染色體計(jì)數(shù)中效果最好的一種方法。（1）將解離沖洗后的材料置于4%鐵明礬溶液中染色2～4h,如加溫（30～40℃）媒染，則可縮短至0.5～1h。換水洗滌4~5次，每次約5min,務(wù)必將殘留的鐵明礬充分洗凈。再置于0.5%蘇木精水溶液中染色2～4h。（2）染色后的材料用水沖洗5～10min，移入45%乙酸溶液內(nèi)進(jìn)行分色和軟化10～20min，方可壓片。（3）壓片時(shí)，用鑷子取根尖置于載玻片上，切下根尖分生組織，將其切成薄片，滴一小滴45%乙酸溶液，迅速搗碎根尖，加蓋玻片，壓片。（4）鏡檢。4）改良苯酚品紅染色根尖解離后，將根尖放在載玻片中央，用刀片將根冠和伸長區(qū)切除，只留乳白色的分生區(qū)，滴上一滴改良苯酚品紅染液，染色8～15min后，蓋上蓋玻片。用吸水紙放在蓋玻片上，左手按住載玻片，右手拇指在吸水紙上對準(zhǔn)根尖部位施加壓力，使材料均勻分散。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（五）動(dòng)物組織染色（肝臟的組織染色法——Mallory苯胺藍(lán)染色法）1）肝組織固定于Zenker液中。2）石蠟切片，脫蠟。3）以0.5%酸性復(fù)紅水溶液染5min。4）速洗或不洗，直接浸入下列染液中染10～20min（水溶性苯胺藍(lán)0.5g，橙黃G2g，1%磷鉬酸水溶液100mL）。5）蒸餾水速洗。6）95%乙醇分色并脫水。7）無水乙醇脫水。8）二甲苯透明。9）封片。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（六）動(dòng)物細(xì)胞染色（animalcellstaining）1）細(xì)胞核染色：常用的染料有甲苯胺藍(lán)、蘇木精、胭脂紅、番紅、甲基綠、結(jié)晶紫等。以人口腔黏膜上皮細(xì)胞為例介紹甲苯胺藍(lán)染色法。（1）取材：用牙簽伸入自己的口腔內(nèi)，在口腔內(nèi)壁單向刮取黏膜上皮細(xì)胞5～6次。（2）涂片：將牙簽上的黏膜上皮細(xì)胞按一定的方向涂在潔凈的載玻片上。（3）染色：加一滴1%甲苯胺藍(lán)溶液染色約1min后加蓋蓋玻片（盡量避免產(chǎn)生氣泡），用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。（4）觀察：將自制的口腔上皮細(xì)胞標(biāo)本置于顯微鏡下觀察。先用低倍鏡尋找較分散的、輪廓清晰的上皮細(xì)胞；然后換高倍鏡，在高倍鏡下可見人口腔上皮細(xì)胞的細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被染成淺藍(lán)色。2）鑒定細(xì)胞死活（臺盼藍(lán)染色法）細(xì)胞膜喪失完整性，細(xì)胞即可被認(rèn)為已經(jīng)死亡。臺盼藍(lán)(trypanblue)是檢測細(xì)胞膜完整性最常用的生物染色試劑。健康的正常細(xì)胞能夠排斥臺盼藍(lán)，而死亡的細(xì)胞，膜的完整性喪失，通透性增加，細(xì)胞可被臺盼藍(lán)染成藍(lán)色。依據(jù)此原理，細(xì)胞經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，可通過顯微鏡，直接鏡下計(jì)數(shù)或拍照后計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞存活率比較精確的定量分析。

四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（七）動(dòng)物細(xì)胞器染色（animalorganellesstaining）1）線粒體染色（人口腔黏膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察）（1）取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴兩滴1/5000詹納斯綠B染液。（2）實(shí)驗(yàn)者用牙簽寬頭在自己口腔頰黏膜處稍用力刮取上皮細(xì)胞，將刮下的黏液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10～15min（不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液）。蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。（3）在低倍鏡下選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡進(jìn)行觀察。可見扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即線粒體。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（七）動(dòng)物細(xì)胞器染色（animalorganellesstaining）2）高爾基復(fù)合體染色高爾基復(fù)合體可用硝酸鈾染液、硝酸鈷-硝酸銀染液、氯化鉻-甲醛染液、升汞-鋨酸染液等染色。以硝酸鈷-硝酸銀染液染色法為例介紹高爾基復(fù)合體染色步驟。（1）將組織固定于A液3～8h，固定一段時(shí)間后將組織切小再繼續(xù)固定。（2）蒸餾水洗。（3）在硝酸銀水溶液（B液）中染24～48h（暗處）。（4）蒸餾水速洗。（5）用Cajal液浸12～24h。（6）蒸餾水洗30min。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（7）石蠟包埋、切片。（8）脫蠟后用蒸餾水洗。（9）用硫代硫酸鈉水溶液（C液）固定5～10min。（10）以明礬胭脂紅對比染色。（11）脫水、透明、封片。（七）動(dòng)物細(xì)胞器染色（animalorganellesstaining）2）高爾基復(fù)合體染色A液：B液：1.5%硝酸銀水溶液C液：5%硫代硫酸鈉Cajal液：四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（八）動(dòng)物染色體染色（animalchromosomestaining）有姬姆薩染色法、苯酚品紅染色法、醋酸洋紅染色法、浮爾根染色法四種。1）姬姆薩染色法（小鼠骨髓染色體）（1）秋水仙素處理：選擇體重20g左右的小白鼠1只，于處死前4h向其腹腔注射100μg/mL秋水仙素（注射量按每克體重1.5～2μg計(jì)算）。（2）取材：以頸椎脫臼法處死小白鼠，置于解剖板上，迅速剪開皮膚，剝離肌肉取出兩后肢的股、脛骨，剪去股骨兩頭，用備好的注射器抽取低滲液（0.075mol/L的KCl）將骨髓沖入離心管內(nèi)，反復(fù)沖洗，直到股骨發(fā)白。用同法依次取其余各段股、脛骨的骨髓，一并沖入同一離心管內(nèi)，然后用吸管吹打骨髓細(xì)胞使其分散。置37℃恒溫水浴鍋中，保溫30min后取出，加入1mL新配制的Carnoy固定液預(yù)固定，混勻后以800～1000rpm/min離心10min，去上清液。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（八）動(dòng)物染色體染色（animalchromosomestaining）1）姬姆薩染色法（小鼠骨髓染色體）（3）固定：加入新配制的固定液5mL，用吸管吹打混勻，固定15min，以1000rpm/min離心10min，去上清液，加入上述固定液少許，吹打成細(xì)胞懸液，以備制片。（4）制片：從冰箱中取出預(yù)冷載玻片，將其傾斜30°，吸取細(xì)胞懸液距載玻片15～30cm滴1～2滴（不要重疊）在載玻片上，然后順載玻片斜面輕輕用口吹散，用空氣干燥或酒精燈火焰干燥。（5）染色：用Giemsa原液和磷酸緩沖液（pH為6.8）以1∶10配成Giemsa染液，在玻片標(biāo)本上滴幾滴并鋪勻，染色8～10min，倒去染液，用自來水（或洗瓶）緩緩沖洗干凈、晾干。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（八）動(dòng)物染色體染色（animalchromosomestaining）2）苯酚品紅染色法（果蠅唾液腺染色體）（1）剝?nèi)⊥僖合佗偬羧」壢g幼蟲。用解剖針從培養(yǎng)瓶中挑取行動(dòng)遲緩、爬上管壁但未蛹化的肥大幼蟲，體長約5mm。個(gè)體肥大的幼蟲是制作唾液腺染色體的基礎(chǔ)。②區(qū)分幼蟲的頭部。蟲體尖細(xì)的一端為頭部，有黑色的口器。另外，果蠅的頭部引領(lǐng)身體一伸一縮向前挪動(dòng)。③拉取并剝離唾液腺。左右兩手各執(zhí)一根解剖針，分別扎住幼蟲頭、尾的1/3處，右手迅速向左拉開。在顯微鏡下找出唾液腺，并用解剖針把周圍不需要的組織剝離，用吸水紙擦去，盡可能剝離附著在唾液腺上的脂肪組織，然后滴一滴生理鹽水于載玻片上。（2）解離和染色：用吸水紙吸去多余的生理鹽水，在唾液腺上滴一滴1mol/L的HCl解離1～2min；然后用吸水紙吸去鹽酸，再用蒸餾水漂洗3次，以使唾液腺細(xì)胞吸水充分膨脹，染色體較好地分散開。用吸水紙吸去多余的蒸餾水，滴加改良的苯酚品紅染液，染色10min。（3）壓片及觀察：染色完成后，蓋上干凈的蓋玻片，并覆一層濾紙。將玻片放在實(shí)驗(yàn)臺上，用大拇指用力壓住，并橫向揉幾次。先用低倍鏡進(jìn)行觀察，找到分散好的染色體再轉(zhuǎn)用高倍鏡進(jìn)行觀察。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（九）細(xì)菌的簡單染色（bacteriasimplestaining）1）原理在中性、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，堿性染料在電離時(shí)，其分子染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色，故可用單一的堿性染料對細(xì)菌進(jìn)行染色。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、酒精燈等。（2）實(shí)驗(yàn)材料：菌種為枯草芽孢桿菌、四聯(lián)球菌；染劑為齊氏石碳酸復(fù)紅染液。3）操作步驟（1）先將載玻片洗凈，擦干。（2）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴生理鹽水，在無菌操作條件下從斜面上挑取少許菌苔涂于水滴中，混勻，涂成薄膜，越薄越好，注意取菌不要太多。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（九）細(xì)菌的簡單染色（bacteriasimplestaining）3）操作步驟（3）晾干：讓涂片自然晾干。（4）固定：手執(zhí)載玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2～3次固定（以不燙手為宜）。（5）染色：滴加染液于涂片上，染液剛好覆蓋涂片薄膜即可。（6）水洗：倒去染液，用水沖洗，直到流下的水為無色。（7）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（8）鏡檢：先低倍鏡觀察，再高倍鏡觀察，找出適當(dāng)?shù)囊曇昂螅瑢⒏弑剁R轉(zhuǎn)出，在涂片上加一滴香柏油，將油鏡頭浸入油滴中仔細(xì)調(diào)焦觀察細(xì)菌形態(tài)。4）結(jié)果觀察通過油鏡可看到枯草芽孢桿菌呈桿狀、線狀排列，四聯(lián)球菌常四個(gè)球菌排成方形。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十）革蘭氏染色（gramstaining）1）原理由于細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同，革蘭氏染色法將細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。將碘液作為媒染劑，其能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物，增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇脫色時(shí)溶解類脂質(zhì)，增加細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，細(xì)菌被脫色，再經(jīng)番紅復(fù)染后呈紅色。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、酒精燈等。（2）實(shí)驗(yàn)材料：菌種為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌；染劑為草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅染液；媒染劑為碘液；脫色劑為95%乙醇。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十）革蘭氏染色（gramstaining）3）操作步驟（1）涂片：取干凈載玻片一塊，在載玻片中央加一滴生理鹽水，在無菌操作條件下從斜面上挑取少許菌苔涂于水滴中，混勻，涂成薄膜，越薄越好，注意取菌不要太多。（2）晾干：讓涂片自然晾干。（3）固定：手執(zhí)載玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2～3次固定（以不燙手為宜）。（4）結(jié)晶紫染色：加適量（以蓋滿細(xì)菌涂面）的結(jié)晶紫染色液染色1min。（5）水洗：倒去染色液，用水小心沖洗。（6）媒染：用碘液媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脫色：將玻片傾斜，連續(xù)滴加95%乙醇脫色10～18s至流出液無色，立即水洗。（9）復(fù)染：滴加番紅復(fù)染2min。（10）水洗：用水洗去涂片上的番紅染液。（11）干燥：將染好的涂片用吸水紙吸干。（12）鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍鏡，再用高倍鏡，最后用油鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)。4）結(jié)果用油鏡觀察可看到枯草芽孢桿菌呈紫色，為革蘭氏陽性菌；大腸桿菌呈微紅色，為革蘭氏陰性菌。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十一）細(xì)菌芽孢染色（bacteriasporestaining）1）原理芽孢壁厚、通透性差、不易著色，無法用單染色的方法使其著色，用著色力強(qiáng)的染色劑孔雀綠或石碳酸復(fù)紅，在加熱條件下染色，染料不僅能夠進(jìn)入菌體，也能進(jìn)入芽孢內(nèi)。進(jìn)入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，當(dāng)用對比度大的復(fù)染色劑染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，使芽孢和菌體更易區(qū)分。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、試管、電爐等。（2）實(shí)驗(yàn)材料：菌種為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌；染液為石碳酸復(fù)紅、黑墨汁（需過濾）。3）操作步驟（1）制備菌懸液：加10滴無菌水于小試管內(nèi)，用接種環(huán)挑取2～3環(huán)菌苔于試管內(nèi)，攪拌均勻，制成濃的菌懸液。（2）染色：將15～18滴石碳酸復(fù)紅染液加入小試管內(nèi)，使其與菌懸液混合均勻，然后將試管置于沸水浴的燒杯中，加熱染色8～10min。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十一）細(xì)菌芽孢染色（bacteriasporestaining）3）操作步驟（3）涂片固定：用接種環(huán)挑取試管底部菌懸液數(shù)環(huán)涂于潔凈載玻片上，涂成薄膜，然后將涂片通過火焰3次加熱固定。（4）脫色：用95%乙醇脫色，直至流出液無紅色為止。（5）水洗：用水小心沖洗。（6）復(fù)染：在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再勻速推向另一端，涂成均勻的薄層，自然干燥。（7）鏡檢：干燥后用油鏡觀察。4）結(jié)果通過油鏡可看到，枯草芽孢桿菌的芽孢呈紅色，營養(yǎng)體透明，芽孢有的著生在桿菌的中間部位，有的著生在靠近桿菌端部；巨大芽孢桿菌的芽孢也呈紅色，營養(yǎng)體也透明，但巨大芽孢桿菌的芽孢比較大，含芽孢的巨大芽孢桿菌菌體膨大變形，呈圓柱形，芽孢居于營養(yǎng)體中間。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十二）細(xì)菌莢膜染色（bacteriacapsularstaining）1）原理莢膜是包圍細(xì)菌細(xì)胞的一層黏液性物質(zhì)，具有明確的外緣，牢固附著在菌體細(xì)胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達(dá)90%以上，易變形。莢膜染色通常采用襯托染色法或負(fù)染法，即將菌體和背景分別著色，從而把不著色且透明的莢膜襯托出來。2）材料和器材（1）菌種：褐球固氮菌。（2）染色劑：石碳酸復(fù)紅、黑墨汁（已過濾）。（3）其他：載玻片、無菌水、洗瓶、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯、香柏油、接種用具、95%乙醇。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十二）細(xì)菌莢膜染色（bacteriacapsularstaining）3）操作步驟（1）取培養(yǎng)72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥（不可用火焰烘干）。（2）滴入1～2滴95%乙醇固定（不可加熱固定）。（3）加石碳酸復(fù)紅染液染色1～2min，水洗，自然干燥。（4）在載玻片一端加一滴墨汁，另取一塊邊緣光滑的載玻片與墨汁接觸，再勻速推向另一端，涂成均勻的薄層，自然干燥。（5）干燥后用油鏡觀察。4）結(jié)果菌體呈紅色，莢膜為無色，背景呈黑色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十三）細(xì)菌鞭毛染色（bacteriaflagellumstaining）1）原理細(xì)菌的鞭毛極纖細(xì)，直徑一般為0.1～0.2μm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學(xué)顯微鏡下也能觀察到。鞭毛染色的基本原理：在染色前先用媒染劑(如單寧酸或鉀明礬)處理，讓媒染劑沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進(jìn)行染色（如堿性復(fù)紅、硝酸銀、結(jié)晶紫）。常用的媒染劑由單寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、凹載玻片、蓋玻片、鑷子、細(xì)玻棒、吸水紙等。（2）實(shí)驗(yàn)材料：菌種為枯草芽孢桿菌（鞭毛周生）、銅綠假單胞菌（鞭毛端生）；染液為硝酸銀鞭毛染色劑A液和B液、95%乙醇和蒸餾水。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十三）細(xì)菌鞭毛染色（bacteriaflagellumstaining）3）操作步驟（1）載玻片準(zhǔn)備：將載玻片清洗后，置于95%的乙醇溶液中浸泡20min，使用時(shí)取出在火焰上燒去乙醇及可能殘留的油跡。（2）制片：在處理好的載玻片一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)無菌操作從枯草芽孢桿菌（或銅綠假單孢菌)斜面上挑取菌種，在載玻片液滴上輕輕蘸一下，使液滴表面形成一薄層菌膜；隨后傾斜玻片，使菌懸液緩慢流向另一端，用吸水紙?jiān)谳d玻片邊緣處吸去多余的菌懸液，自然干燥。（3）染色：滴加硝酸銀鞭毛染色劑A液覆蓋菌面3～5min后，用蒸餾水充分洗去A液；用B液洗去殘留水分，再滴加B液覆蓋菌面數(shù)秒至1min，其間可用微火加熱，當(dāng)菌面出現(xiàn)明顯褐色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗，自然干燥。（4）鏡檢：先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察，最后用油鏡觀察。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十三）細(xì)菌鞭毛染色（bacteriaflagellumstaining）4）結(jié)果（見下表）菌體呈深褐色，鞭毛呈淺褐色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十四）細(xì)菌抗酸染色（bacteriaacid

faststaining）1）原理分枝桿菌的細(xì)胞壁含有較多的類脂質(zhì)，極易與石碳酸復(fù)紅染色劑結(jié)合，著色后不易被酸性乙醇脫色，因此這類細(xì)菌被稱為抗酸性細(xì)菌，其他類型的細(xì)菌容易被脫色。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、鑷子等。（2）實(shí)驗(yàn)材料：菌種為結(jié)核分枝桿菌。（3）染劑：石碳酸復(fù)紅染液、酸性乙醇、呂氏堿性美藍(lán)染液。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十四）細(xì)菌抗酸染色（bacteriaacid

faststaining）3）操作步驟（1）滴加石碳酸復(fù)紅染液于玻片上并緩緩加熱，使染液冒蒸氣但不沸騰。并繼續(xù)滴加染液，但不使染液蒸干，保持操作5min。（2）涂片冷卻后，傾倒染液，用酸性乙醇脫色，直到流下來的酸性乙醇無色后用水洗。（3）用呂氏堿性美藍(lán)染液復(fù)染2～3min。（4）水洗，用吸水紙吸干或晾干，鏡檢。4）結(jié)果抗酸性細(xì)菌菌體呈紅色，即抗酸染色陽性；非抗酸性細(xì)菌菌體呈藍(lán)色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十五）細(xì)菌細(xì)胞壁染色（bacteriacellwallstaining）1）原理。細(xì)菌細(xì)胞壁的常用染色法主要有兩種：一種是單寧酸法，另一種是磷鉬酸法。單寧酸和磷鉬酸都起媒染作用，它們使細(xì)胞壁形成可著色的復(fù)合物，而使細(xì)胞質(zhì)不易被著色，經(jīng)結(jié)晶紫或甲基綠染色后，便可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞壁。2）材料和器材（1）儀器：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、鑷子等。（2）實(shí)驗(yàn)材料：菌種為巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌；染色劑為結(jié)晶紫染液、單寧酸水溶液、磷鉬酸水溶液、甲基綠染液。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十五）細(xì)菌細(xì)胞壁染色（bacteriacellwallstaining）3）操作步驟（1）單寧酸法①將巨大芽孢桿菌或者枯草芽孢桿菌按常法制成涂片。②用單寧酸水溶液染5min后，水洗。③用結(jié)晶紫染液染3～5min。④水洗，用吸水紙吸干或晾干，鏡檢。⑤油鏡下，細(xì)胞壁呈紫色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（2）磷鉬酸法①制備濃厚的涂片，在未干時(shí)浸入磷鉬酸水溶液3～5min。②用甲基綠染液染3～5min。③水洗后，用吸水紙吸干或晾干，鏡下觀察。④細(xì)胞壁呈綠色，細(xì)胞質(zhì)為無色。（十六）淀粉染色（starchstaining）淀粉是白色無定形粉末，由直鏈淀粉（占10%～30%）和支鏈淀粉（占70%～90%）組成。直鏈淀粉能溶于熱水而不呈糊狀。支鏈淀粉不溶于水，熱水與之作用則膨脹而成糊狀。溶于水中的直鏈淀粉呈彎曲形態(tài)，并借分子內(nèi)氫鍵卷曲成螺旋狀，加入碘酒，碘分子便鉆入螺旋當(dāng)中空隙，與直鏈淀粉結(jié)合在一起，從而形成絡(luò)合物。這種絡(luò)合物能比較均勻地吸收除藍(lán)光以外的其他可見光（波長范圍為400～750nm），從而使淀粉變?yōu)樯钏{(lán)色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十七）糖類染色（sugarstaining）1）斐林試劑。還原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的單糖和某些二糖（如乳糖和麥芽糖）。在堿性溶液中，還原糖能將Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金屬離子還原，而糖本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類的這種性質(zhì)常被用于糖的定性和定量測定。2）過碘酸希夫反應(yīng)法。過碘酸是一種強(qiáng)氧化劑，過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變?yōu)橐叶┗叶┗^而與希夫試劑結(jié)合，希夫試劑本為無色亞硫酸品紅復(fù)合物，與乙二醛基結(jié)合后形成紫紅色反應(yīng)物。顏色反應(yīng)的深淺取決于組織內(nèi)多糖（包括糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖脂等）的乙二醇分子的多少。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十八）脂肪染色（fatstaining）脂肪染色可用蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、油紅O、蘇丹黑等進(jìn)行染色，常用的是蘇丹Ⅲ染色法。1）蘇丹Ⅲ染色法（1）原理蘇丹Ⅲ是弱酸性染料,由NaOH、CuSO4組成，呈紅色粉末狀,易溶于脂肪和乙醇(溶解度為0.15%)。蘇丹Ⅲ是脂肪染色劑，脂肪和蘇丹染液有比較強(qiáng)的親和力，蘇丹Ⅲ遇脂肪變?yōu)殚冱S色，適用于生物脂肪材料的鑒定，可在光學(xué)顯微鏡下看到被染成橘黃色的小粒。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十八）脂肪染色（fatstaining）1）蘇丹Ⅲ染色法（2）操作方法①處死小鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，用鑷子提起小腸將蓋玻片緊貼于腸系膜，用剪刀將蓋玻片和其上黏附的腸系膜取下，反扣于已滴加甲醛鈣的載玻片上，固定20min。②用吸管吸取蒸餾水滴入載玻片與蓋玻片之間沖洗掉甲醛鈣溶液。③用70%乙醇溶液代替蒸餾水重復(fù)步驟②的操作，沖洗。④滴加蘇丹Ⅲ于蓋玻片上，染色30min。⑤吸去載玻片上溢出的染液，擦凈載玻片表面及周邊，用顯微鏡觀察。（3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果：脂肪細(xì)胞呈圓球形，其內(nèi)充滿橘黃色物質(zhì)，細(xì)胞外液有分散的橘黃色圓脂肪滴四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十八）脂肪染色（fatstaining）2）油紅O脂類染色法（1）原理油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑，與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀。脂溶性染料溶于組織和細(xì)胞中的脂類，在脂類中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切片置入染液中時(shí)，染料即離開染液而溶于組織內(nèi)的脂類(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂類呈橘紅色。（2）操作方法①切片用甲醛鈣固定10min。②用蒸餾水沖洗。③用60%異丙醇浸洗。④用油紅O染液染10min（染液可回收再利用）。

四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十八）脂肪染色（fatstaining）2）油紅O脂類染色法（2）操作方法⑤用60%異丙醇分色至背景無色。⑥用蒸餾水沖洗。⑦用Mayer蘇木精復(fù)染。⑧用自來水沖洗（藍(lán)化）1～3min。⑨用蒸餾水沖洗。⑩用甘油明膠封片。（3）結(jié)果組織細(xì)胞中脂滴呈橘紅色，核呈藍(lán)色。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十九）蛋白質(zhì)染色（proteinstaining）常用的蛋白質(zhì)染色試劑有雙縮脲試劑、考馬斯亮藍(lán)、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中考馬斯亮藍(lán)染色法的應(yīng)用較為廣泛。考馬斯亮藍(lán)染色法（coomassiebluestaining）又稱為Bradford法，是Bradford于1976年建立起來的一種蛋白質(zhì)濃度的測定方法。1）原理考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)\|色素結(jié)合物在595nm波長下達(dá)到最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右達(dá)到平衡，反應(yīng)十分迅速，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級的蛋白質(zhì)含量。測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1000μg/mL，最小可測定2.5μg/mL的蛋白質(zhì)，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。四、常用的生物學(xué)染色技術(shù)（十九）蛋白質(zhì)染色（proteinstaining）2）操作方法該方