ICS13.160.20CCSICS13.160.20CCSX04安 徽 省 地 方 標 準DB34/T4878—2024包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測膠體金免疫層析法RapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingRapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingwater—Colloidalgoldimmunochromatographicassay2024073020240830安徽省市場監督管理局發布.前 言本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由安徽省產品質量監督檢驗研究院提出。本文件由安徽省市場監督管理局歸口。包裝飲用水中銅綠假單胞菌快速檢測膠體金免疫層析法范圍本文件規定了包裝飲用水中銅綠假單胞菌的膠體金免疫層析快速檢測方法。本文件適用于包裝飲用水中銅綠假單胞菌的快速檢測。（GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB8538食品安全國家標準飲用天然礦泉水檢驗方法本文件沒有需要界定的術語和定義。原理樣品中的銅綠假單胞菌經濾膜過濾富集，超聲處理提取DNA，以此為模板，設計經異硫氰酸熒光素（biotin）（PCR）FITC（T線（C線除另有說明外，所用試劑均為分析純。水：試驗用水符合GB/T6682：CMCC（B）10282（Tris）。（HCl）。（NaOH）。Tris-HCl溶液：稱取Tris（5.3）6.06g，加水（5.1）40mL溶解，調pH至8.0，加水（5.1）定容至50mL。EDTAED-2?2H2（5.306（5.35mLNaH（.）pH8.0（5.1）50mL。TE1mLTris-HCl（5.7）100mL0.2mLEDTA（5.8）（5.1）100mL。4PCRDNA（dNTP）（MgCl2）（ddH2O）。Tris-HCl2020000。20h～24h（5.2）培養18h～201×108CFU/mL～5×108CFU/mL時，即制得銅綠假單胞菌菌懸液。引物：上游引物 5’-Biotin-GGCATTCAGATTGCTGCTCG-3’ ，下游引物5’-FITC-ACCGCCGTCAGAATCAGTTT-3’。PCR0.01g0.001。47mm，微孔徑為0.45μm5000rpmpH）。檢測將250mL待檢水樣通過孔徑0.45μm的無菌濾膜（6.7）過濾，濾膜備用。以無菌水作為空白對照，以銅綠假單胞菌菌懸液（5.14）作為陽性質控對照。DNA提取將7.11mL的TE1.5mL5000rpm5minPCR擴增取7.22PCR（5.10）12.5μmol/L各0.8μL，ddH2O（5.11）8.9μL。混勻后進行PCR擴增，擴增條件為：95℃預變性5min；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；72℃再延伸2min，得到擴增產物，備用。測定取7.3得到的擴增產物2μL，滴加在膠體金免疫層析檢測試紙條（6.11）上，再滴加48μL上樣緩沖液（5.12）于樣品墊上，靜置3min，觀察T線和C線顯色情況，進行結果判定。8結果判定無效控制線（C線）不顯色，或空白試驗檢測線（T線）顯色，或陽性質控試驗檢測線（T線）不顯色，均判定無效。示意圖見圖1。陰性控制線（C線）顯色，檢測線（T線）不顯色。陽性控制線（C線）與檢測線（T線）均顯色。參比標準檢測結果為陽性時可采用參比標準GB8538進行確認。圖1目視判定示意圖圖1目視判定示意圖9性能指標檢出限檢出限為1CFU/250mL。靈敏度靈敏度≥95%。特異性特異性≥95%。假陰性率假陰性率≤5%。假陽性率≤5%。見附錄A。附錄A（資料性）定性方法性能指標計算方法性能指標計算表見表A.1。表A.1性能指標計算表樣品情況a檢測結果b總數陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2顯著性差異（х2）2（12-21-1）2/（1221自由度（df）=1靈敏度（p+，%）p+=N11/N1.特異性（p-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特異性相對準確度，%c（N11+N22）/