甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術(shù)規(guī)程（送審稿）編制說明《甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術(shù)規(guī)程》編制組2024年8月一、目的意義1.產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀甘藍(lán)類蔬菜作物種類眾多，包括結(jié)球甘藍(lán)、花椰菜、青花菜、芥藍(lán)、苤藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、抱子甘藍(lán)等十余種變種類型，在我國不同地域均有分布和種植。在諸多甘藍(lán)類蔬菜中，結(jié)球甘藍(lán)的種植面積約為1400萬畝，花椰菜和青花菜種植面積分別約為700萬畝和130萬畝，在全國蔬菜周年供應(yīng)及出口貿(mào)易中占有十分重要的地位。江蘇省是甘藍(lán)類蔬菜的重要產(chǎn)區(qū)，播種面積約為200萬畝。隨著甘藍(lán)類蔬菜栽培面積的逐步擴(kuò)大及復(fù)種指數(shù)的提高，由蕓薹生鏈格孢（Alternariabrassicicola）引起的黑斑病呈加重態(tài)勢。此外，黑斑病菌還能侵染角果，導(dǎo)致種子帶菌，從而影響制種產(chǎn)量和質(zhì)量。2.制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性目前生產(chǎn)上缺乏商業(yè)化的抗病品種，化學(xué)藥劑成為防治黑斑病的主要手段。黑斑病菌的準(zhǔn)確識別對于化學(xué)藥劑選擇和施藥時機(jī)把握具有重要生產(chǎn)意義。重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinasepolymeraseamplification，RPA）是一種新型恒溫擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)可在較低恒溫（37℃~42℃）條件下，通過重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、鏈置換DNA聚合酶的作用，在短時間內(nèi)實現(xiàn)目標(biāo)區(qū)段的高效擴(kuò)增。本項目制定的甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術(shù)規(guī)程，旨在通過標(biāo)準(zhǔn)化檢測，及時掌握黑斑病的發(fā)生危害程度，提高黑斑病的防控意識和能力，對促進(jìn)江蘇省甘藍(lán)類蔬菜產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有十分重要的意義。3.制定標(biāo)準(zhǔn)的可行性江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院與江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站在甘藍(lán)類蔬菜病害綠色防控技術(shù)研發(fā)和推廣方面具有良好的合作基礎(chǔ)，在國家重點研發(fā)計劃子課題、江蘇省重點研發(fā)計劃、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金等相關(guān)項目的資助下，在黑斑病病原的鑒定與分子檢測、抗病種質(zhì)資源篩選與利用等方面開展了大量工作。本規(guī)程是在試驗研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻(xiàn)查閱而提出，該技術(shù)規(guī)程可實現(xiàn)目標(biāo)病原菌的特異靈敏檢測，助力黑斑病的長效防控。二、任務(wù)來源2023年8月4日，江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布《關(guān)于下達(dá)2023年度江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)項目計劃的通知》（蘇市監(jiān)標(biāo)〔2023〕173號），下達(dá)2023年度343項地方標(biāo)準(zhǔn)制（修）訂項目，其中122號《甘藍(lán)類蔬菜真菌性黑斑病快速檢測技術(shù)規(guī)程》標(biāo)準(zhǔn)編制的任務(wù)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站共同負(fù)責(zé)起草制定。經(jīng)專家建議和進(jìn)一步的資料檢索，我們發(fā)現(xiàn)引起甘藍(lán)類蔬菜黑斑病的病原雖有細(xì)菌和真菌之分，但通常只將細(xì)菌引起的黑斑病稱為細(xì)菌性黑斑病，而鏈格孢屬真菌引起的病害則仍稱為黑斑病。因此在不改變范圍和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，我們對標(biāo)準(zhǔn)名稱進(jìn)行了適當(dāng)修改，更改后的標(biāo)準(zhǔn)名稱為“甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術(shù)規(guī)程”。三、編制過程（1）成立編制組2023年8月，收到江蘇省市場監(jiān)督管理局《關(guān)于下達(dá)2023年度江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)項目計劃的通知》文件后，立即成立標(biāo)準(zhǔn)起草小組，由余方偉擔(dān)任組長，曾曉萍、李建斌、馬金俊、王神云、張偉、于利6位成員組成。（2）起草階段2023年8月，起草組系統(tǒng)查閱了十字花科蔬菜黑斑病的病原鑒定、發(fā)生規(guī)律、綜合防控和黑斑病菌分子檢測等有關(guān)的技術(shù)資料，對收集的資料進(jìn)行全面分析、比較，結(jié)合起草組承擔(dān)的各類國家和省級項目在黑斑病病原分離、分子檢測等方面的研究成果，確定了標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)設(shè)置，并于2024年4月完成初稿，隨后召開內(nèi)部討論會，根據(jù)討論會意見對文稿進(jìn)行進(jìn)一步修改完善，2024年5月形成了征求意見稿。（3）征求意見情況2024年5-8月，將征求意見稿發(fā)送至浙江大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、北京市農(nóng)林科學(xué)院、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、西南大學(xué)、福建農(nóng)林大學(xué)、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、重慶三峽農(nóng)業(yè)科學(xué)院、宜興市蔬菜辦公室和江蘇中江種業(yè)股份有限公司等13家單位相關(guān)專家征求意見，共征集到來自11個單位11位專家的32條意見，起草小組根據(jù)專家意見進(jìn)行修改完善，最終形成了送審稿。四、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)的編寫原則本標(biāo)準(zhǔn)遵循“科學(xué)、適度、可行”的原則，嚴(yán)格按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定進(jìn)行編寫。在標(biāo)準(zhǔn)的征求意見稿和送審稿的編制過程中力求做到技術(shù)內(nèi)容的敘述正確無誤，文字表達(dá)準(zhǔn)確、簡單易懂，標(biāo)準(zhǔn)的構(gòu)成嚴(yán)謹(jǐn)合理，內(nèi)容編排符合邏輯。制定的標(biāo)準(zhǔn)力求切實可行，易于為相關(guān)從業(yè)者所掌握和使用。（二）標(biāo)準(zhǔn)的提出依據(jù)蕓薹生鏈格孢是引起甘藍(lán)類屬蔬菜黑斑病的主要病原。目前，國內(nèi)尚未正式制定“甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術(shù)規(guī)程”的國家或行業(yè)技術(shù)規(guī)程。標(biāo)準(zhǔn)起草小組為解決甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌的RPA檢測，前期開展了該檢測技術(shù)的靶標(biāo)選擇、引物設(shè)計、反應(yīng)體系優(yōu)化、室內(nèi)檢測的研究。最終，標(biāo)準(zhǔn)起草小組在結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索和現(xiàn)有試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，撰寫了基于RPA的甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測技術(shù)規(guī)程。主要參考文獻(xiàn)如下：[1]劉煥然,柯桂蘭.十字花科蔬菜黑斑病原種群組成及季節(jié)變化[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,1992,1(4):6-10.[2]肖長坤,李勇,李健強(qiáng).十字花科蔬菜種傳黑斑病研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2003,8(5):61-68.[3]李明遠(yuǎn).十字花科蔬菜黑斑病識別與防治[J].當(dāng)代蔬菜,2004,(10):34-36.[4]文朝慧,李鐵夫,王軍平,劉箐,周圍.出口蘿卜種子中蕓薹生鏈格孢的分離與鑒定[J].植物檢疫,2007,21(1):4-6.[5]王漢榮,方麗,任海英,蘇英京.青花菜黑斑病的識別與防治[J].中國蔬菜,2010,(5):23-24.[6]王超,張曉烜,王寧寧.甘藍(lán)黑斑病病原菌鑒定[C]//中國園藝學(xué)會十字花科蔬菜分會.中國園藝學(xué)會十字花科蔬菜分會第十屆學(xué)術(shù)研討會論文集.2012:5.[7]王瑩瑩,宋加偉,石延霞,張揚,李寶聚.李寶聚博士診病手記（八十四）白菜黑斑病病原菌鑒定及防治方法[J].中國蔬菜,2015,(7):72-74.[8]ChoY.HowthenecrotrophicfungusAlternariabrassicicolakillsplantcellsremainsanenigma[J].EukaryoticCell,2015,14(4):335-344.[9]高威芳,朱鵬,黃海龍.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù):一種新的核酸擴(kuò)增策略[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2016,32(6):627-634.[10]付永文.西蘭花黑斑病重發(fā)原因與防控技術(shù)初探[J].中國農(nóng)技推廣,2016,32(12):47-49.[11]DonosoA,ValenzuelaS.In‐fieldmoleculardiagnosisofplantpathogens:recenttrendsandfutureperspectives[J].PlantPathology,2018,67(7):1451-1461.[12]NowakowskaM,WrzesińskaM,KamińskiP,SzczechuraW,LichockaM,TartanusM,KozikEU,NowickiM.Alternariabrassicicola–Brassicaceaepathosystem:insightsintotheinfectionprocessandresistancemechanismsunderoptimizedartificialbio-assay[J].EuropeanJournalofPlantPathology,2019,153:131-151.[13]馮黎霞,魏霜,余辛,張永江,武目濤,胡學(xué)難.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）快速檢測玉米褪綠斑駁病毒[J].植物保護(hù)學(xué)報,2020,47(1):217-218.[14]周瑩,岳瑾,李云龍,劉梅,喬廣行.重組酶介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)及其在植物病原檢測中的應(yīng)用[J].中國植保導(dǎo)刊,2020,40(6):27-31.[15]馬志敏,段玉,許建建,賓羽,周常勇,宋震.基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）的柑橘潰瘍病菌檢測方法[J].園藝學(xué)報,2021,48(3):590-599.[16]馬文娣,田逸英,焦志遠(yuǎn),周濤,范在豐.重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)在植物病原快速檢測中的應(yīng)用[J].植物保護(hù),2021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