殺鮭氣單胞菌病診斷方法殺鮭氣單胞菌病診斷方法范圍（AeromonasPCRPCR本文件適用于殺鮭氣單胞菌病的普查和診斷，以及感染殺鮭氣單胞菌病的流行病學調查、診斷和出入境魚類檢疫。（GB/T6682 GB/T18088 本文件沒有需要界定的術語和定義?？s略語下列縮略語適用于本文件。BHQ1：黑洞淬滅劑1（Blackholequencher1）bp：堿基對（Basepair）CATB：十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammoniumbromide）Ct：擴增循環數（Cyclethreshold）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTPs：脫氧核糖核苷三磷酸混合物（Deoxy-ribonucleosidetriphosphatemixture）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）FAM：6-羧基熒光素（6-carboxy-fluorescein）PCR：聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction）qPCR：實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Quantitativerealtimepolymerasechainreaction）TAE：TAE電泳緩沖液（tirs-acetate-ethylenediaminetetraaceticacidbuffer）TSA：胰蛋白胨大豆胨瓊脂TSB：胰蛋白胨大豆肉湯Tris：三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane）Taq：水生棲熱菌（Thermusaquaticus）vapA：毒力陣列蛋白A（VirulencearrayproteinA）本文件中所有化學試劑，除非另有規定，僅使用分析純試劑。水：符合GB/T6682（TSA）培養基：按A.1血瓊脂培養基：按A.2（TSB）培養基：按A.3電泳緩沖液：按A.41.5%瓊脂糖凝膠：按A.5配制。dNTPs（10mM）：-20保存。Taq（5U/）：-20保存。DNAMarkerDL2000：-20℃4(2%)。氯仿。（5M）。PCR（10μM）：5’-CATGCTGCCAATGGTCGTGG-3’，-20PCR（10μM）：5’-CGCCTTCAGCATTGGATTTC-3’，-20PCR（10μM）：5’-TAAAGCACTGTCTGTTACC-3’，-20PCR（10μM）：5’-GCTACTTCACCCTGATTGG-3’，-20PCR（10μM）：5’-FAM-ACATCAGCAGGCTTCAGAGTCACTG-BHQ1-3’，-20℃保存。PCRPCRPCRB.4。樣品采樣按GB/T18088規定執行。無菌采集脾臟、肝臟、腎臟樣本。消毒病灶表面，無菌采集病灶深處的組織，同時采集腎臟、脾臟、肝臟。8.2分離培養用接種環（無菌）蘸取無菌采集的病料，劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養基（或血瓊脂培養基）上，25℃±3℃培養24h~72h。挑取光滑、圓整、凸起、半透明的單個菌落。有菌落會出現β-溶血或色素沉著。11min～2min1min～3min95%0.5min～1min10s～30s取干凈的載玻片，滴1滴～2滴生理鹽水。用接種環挑取9.1中培養好的單菌落涂抹在水滴中，蓋上蓋玻片。400倍～600倍顯微鏡檢。殺鮭氣單胞菌菌體在原位顫動，沒有運動性。5sCPCRDNADNA100~300mg8.1.24℃10.2.1.12ml700μL2%65℃700μL氯仿000r/min101.5ml212000r/min5minDNA500μL70%10.2.1.2DNA12000r/min5min25min100μLDNA-20℃DNA分別挑取TSA5mLTSB253200rpm16h～241mL1.5mL000rpm/min5min100100℃10min～133minDNA-20℃注：DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取試劑盒。2510×PCR2.5μL（101μLμL、DNA（5）0.5、MgCL2（25mmol/L）2.5、DNA225。PCR混液。94℃3min；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸20s，35個循環。72℃延伸10min。8μLPCR（）2μL1.5%DNAMarkerDL2000V/cm3/4264bpPCR264bpPCRPCR擴增產物序列與NCBI99%264bpPCR按照10.1規定執行。DNA按照10.2規定執行。2510×PCR2.5μL（100.5μL（10）1μLμLDNA（5μLmmol/DNA225μL。注：反應體系中各試劑的量可根據具體情況或不同反應總體積進行適當調整。亦可使用經驗證的商品化TaqMan探針實時熒光PCR擴增預混液。95℃預變性2min；95℃變性15s，56℃退火30s，72℃延伸20s，40個循環；在56℃階段設置采集熒光。注：PCR反應參數可根據反應體系和不同品牌PCR儀做適當調整。陽性對照Ct值≤35，有典型的擴增曲線，陰性對照和空白對照無典型擴增曲線或Ct值≥40，試驗結果成立；否則，試驗不成立。被檢樣品Ct值≤35，且有典型擴增曲線，判定被檢樣品殺鮭氣單胞菌檢測結果為陽性；Ct值或Ct值≥4035<Ct40Ct值≥40檢測結果符合以下任何一項，判定為疑似感染：——出現典型臨床癥狀；——組織中檢測到殺鮭氣單胞菌核酸。對疑似感染殺鮭氣單胞菌病的樣本進行細菌分離鑒定，符合以下任何一項，判定為確診感染：——所分離細菌，理化鑒定為殺鮭氣單胞菌檢測結果陽性；——所分離細菌，普通PCR檢測為殺鮭氣單胞菌檢測結果陽性；——所分離細菌，實時熒光PCR檢測為殺鮭氣單胞菌檢測結果陽性。附錄A（）胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養基胰酪白15.0大豆白5.0氯化5.0瓊脂15.0將A.1.11000pH7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min45℃～50成分胰酪白10.0大豆白5.0氯化3.0瓊15.0滅菌纖羊或50mL～100mL制法將A.2.11000pH7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min45℃～501000mL（TSB）成分胰蛋15.0大豆白5.0氯化3.0蒸餾1000制法將A.3.1中的各種成分混勻，完全溶解后，調節pH7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min，冷卻后備用。成分三羥基基烷（Tris） 4.84乙二四酸鈉（EDTA-Na2） 0.744冰乙酸 1.142蒸餾1000制法將A.4.1中的各種成分混勻，完全溶解后，調節pH7.3±0.2，121℃高壓滅菌15min，冷卻后備用。1.5%成分泳沖液 100瓊脂1.5核酸料 0.5制法將A.5.1中的各種成分混勻，加熱完全溶解后，15℃~25℃冷卻至固體，現配現用。附錄B（資料性）疾病概述（theinfectionofAeromonassalmonicida）（Aeromonassalmonicida）γ-鮭氣單胞菌有多個亞種，包括殺鮭亞種（Aeromonassalmonicidasubsp.salmonicida）、無色亞種（Aeromonassalmonicidasubsp.achromogenes)、殺日本鮭亞種（Aeromonassalmonicidasubsp.aoucdemoasaoncdasubp.haAermoasaoncdasubp.pectinolytica)（Salmotrutta）（Salvelinusfontinalis）（Squaliuscephalus）（Leuciscusleuciscus）（Anguilla（Thymallus)（Coregonus（Polyodon（Esoxlucius）（Dicentrarchuslabrax）（Petromyzonmarinus）等。（amosaaavenusapnu（Oncorhynchus(Oncorhynchusmykiss)（Salvelinus（Salmo（Thymallus)（Gadus（Hippoglossushippoglossus）（Cyprinuscarpio）（Anguillaanguilla）（Sebastesschlegeli）（Esoxlucius）等。/或粘液從排氣口排出等癥狀。癤瘡通常在背部一處410402030404天至21天～3，60℃下分鐘可殺滅殺鮭氣單胞菌。在被有機物污染的水中，可以存活長達23天。在死魚體內，5℃的溫度下，沙門氏菌可在內臟中存活長達6天。附錄C（規范性）生化特性表C.1殺鮭氣單胞菌各亞種的生化特性表生化特性殺鮭氣單胞菌亞種殺鮭亞種無色亞種殺日本鮭亞種史氏亞種溶果膠亞種運動性-----β-溶血+-+--氧化酶+++++