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文檔簡介

臨床檢驗進展及遺傳病檢測

醫學檢驗學院

2011、9臨床檢驗的常規項目1.血液一般檢查2.尿液一般檢查3.糞便檢查4.體液與分泌物檢查5.骨髓檢查及常用染色技術6.溶血檢查7.出凝血檢查8.血液流變學檢查

檢驗這些項目的方法主要采用一些化學方法、免疫學方法等。近年來,許多分子生物學方法也開始應用于臨床,對疾病的基因進行檢測。血液學檢驗血液學檢驗的臨床意義

人體在某些生理情況下或發生疾病時,常可引起血液細胞成分發生數量和質量的變化。通過對血液中RBC、WBC、PLT數量和形態改變的檢驗,常有助于確定某些疾病的診斷,或可作為輔助診斷。故血液常規檢驗在臨床上重要的臨床意義。特別是對疾病鑒別診斷提供重要臨床依據。臨床檢驗的常規項目血細胞分析儀的發展20世紀50年代美國庫爾特首先發明了電阻式血細胞分析儀20世紀80年代Coulter公司又利用電阻、激光、高能電磁波等幾項技術共同檢測、綜合分析,使血細胞分析個更加準確20世紀90年代初從細胞膜的結構差異進行分析目前,半自動血細胞分析儀在發達國家已經被淘汰,取而代之的是全自動分析儀臨床檢驗的常規項目血細胞計數主要是采用血細胞分析儀,其主要原理:根據血細胞非傳導的性質,在浸入電解質的微孔管內外各有一電極,兩電極形成電流,細胞經過微孔的瞬間以引起電阻的變化為基礎,進行血細胞計數和體積測定。A.正常紅細胞形態B口形紅細胞

血液檢驗與疾病鑒別非血液系統疾病呼吸、消化、類白血病反應、婦科血液系統疾病血友病、骨髓瘤等血液學檢驗的進展

隨著醫學科學技術的發展和各學科的相互滲透,當代的臨床血液學檢驗已發生根本性變化。在檢驗科室內,它已經是一個業務內容廣泛、擁有大量自動化精密儀器、由許多具備血液學基礎及臨床知識和嫻熟技術的人員組成的臨床專業科室。其業務內容已擴展到包括血細胞計數與形態學分析、紅細胞病理相關分析、白細胞病理相關分析以及血栓與止血相關分析等方面。

血細胞計數及形態學

應用最新一代的血液分析儀,除全血細胞計數(CBC)項目和白細胞分類計數以外:1.還可直接計數網織紅細胞,包括網織紅細胞血紅蛋白含量(CHr)和表示網織紅細胞成熟程度的多項指標。2.直接檢測有核紅細胞數,并可從白細胞總數中自動扣除有核紅細胞,以及準確計數血小板總數和計數大型血小板數等數十個參數。3.測定紅細胞比積(Hct)以及計算平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)和平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)。紅細胞病理

分子生物學方法(如PCR、核酸分子雜交,基因或蛋白質芯片技術等)取代生化方法檢測與遺傳有關的溶血性貧血和高鐵血紅蛋白血癥患者紅細胞內各種酶的測定、異常血紅蛋白分析和紅細胞膜骨架蛋白等。

白細胞病理

存在的問題:血液分析儀還不能準確辨認各類幼稚細胞、原始細胞以及諸如中性粒細胞的“毒性”變化和“不典型淋巴細胞”等,必要時還必須在顯微鏡下進行識別。外周血淋巴細胞,實際上是由T細胞、B細胞和自然殺傷(NK)細胞所構成,其中T細胞還可再分成許多亞群。這些細胞在顯微鏡下也無法區分。

白細胞病理解決方案:采用特異的抗淋巴細胞分化抗原群(CD)單克隆抗體,建立免疫方法(如流式細胞術)進行免疫表型檢測。細胞遺傳學(Cytogenetics,即染色體分析),形成了所謂“MIC”鑒別模式。隨著分子生物學技術的發展,又加入MICM模式。目前公認的白血病分型標準是形態學-免疫學-細胞遺傳學-分子生物學即MICM分型。糞便檢驗臨床檢驗的常規項目糞便檢驗及進展常規方法目視檢查顯微鏡檢查糞便的化學檢查糞便的致病菌檢查其他糞便檢驗臨床檢驗的常規項目糞便隱血實驗的進展隱血實驗是指檢查胃腸道隱性出血的一類實驗方法。傳統的隱血實驗是利用血液中紅細胞的血紅蛋白的亞鐵血紅素具有類過氧化物酶作用,能分解H2O2為水和活性氧而設計的簡易化學實驗。這類方法雖然成本低廉、簡單易行,但特異性差、靈敏度較低,易受食物及服用藥物成分的影響。為解決傳統隱血實驗的特異性問題,探索出了一些新的實驗方法,如放射性核素鉻(51Cr)法等放射性核素法和免疫學方法。糞便隱血實驗放射性核素方法鉻(51Cr)法測定糞便隱血量:51Cr-紅細胞經靜脈注射后,正常不進入消化道,消化道出血時則進入并不被吸收,隨大便排出。將糞便中的放射性與每毫升血液中放射性比較計算可求出胃腸道出血量。免疫學方法:是當前發展最快也最有臨床實用價值的隱血實驗方法。具有很好的靈敏度,很高的特異性。糞便隱血實驗免疫學方法用于糞便隱血實驗的抗體主要有三類:一種為抗人血紅蛋白抗體,一種抗人紅細胞基質抗體,另一種為抗血液中其他成分如Tf、Hb-Hp等。抗人血紅蛋白法或抗人紅細胞基質的隱血試驗是目前被認為對大腸癌普查最適用的試驗。糞便基因檢驗的研究進展近年來,大腸癌發病率有上升趨勢,而大腸癌的癥狀體征均無特異性,致使臨床上確診的大腸癌大部分為中、晚期,臨床治療效果差。五年生存率極低。如能早期診斷出大腸癌,可使90%以上的患者得到治愈。大腸癌的診斷方法:大便隱血實驗、纖維結腸鏡檢查、腫瘤標記物檢查和基因檢測。糞便基因檢驗的研究進展大便隱血實驗是大腸癌的篩選檢查纖維結腸鏡檢查是檢出大腸癌的可靠方法腫瘤標記物檢查,雖然對大腸癌的臨床診斷及預后判斷有幫助,但對早期大腸癌診斷的特異性及敏感性均不高。隨著分子生物學的發展,糞便中基因檢測可望成為篩選診斷大腸癌的新方法。(脫落細胞)糞便基因篩檢的分子生物學基礎分子生物學研究表明,腫瘤的產生是多能干細胞像正常細胞增殖、分化的過程中,受環境因素和遺傳因素的影響,相關基因改變的結果。腫瘤細胞的基因與基因表達與正常細胞有顯著區別,因此如能檢出這種基因改變就能為腫瘤的診斷和預防提供條件。與大腸癌相關的癌基因有ras、c-myc、-erb2等,與大腸癌相關的抑癌基因主要有APC/MCC、DCC、P53及RB等。糞便基因突變檢測的方法免疫組織化學檢測Southern印跡雜交DNA直接測序PCR產物單鏈DNA泳動變位技術和錯配PCR糞便檢驗的新思路基因芯片技術是一種高度集成的基因探針雜交技術。它既承襲了DNA探針雜交技術的高特異性,又具備了同時檢測多靶基因的實驗高通量的特點。雖然有很好的優越性,目前還沒有應用到臨床糞便檢驗。色質譜分析是利用混合物中各組分的質量與所帶電荷的比值不同而實現組分分離的分離技術。目前還沒有利用色質譜法大量讀取糞便醫用信息的報道,但國內的許多學者以及開始了利用色譜法和質譜法進行糞便藥動學研究、糞便毒物代謝研究甚至疾病的診斷探索。遺傳病檢測遺傳病臨床基因診斷的意義在我國,出生缺陷調查提示各種先天性缺陷與遺傳病約占13%。由于對這些疾病基本上沒有特異性治療手段,因此預防患者出生成為現階段對付這些疾病的主要方法,尤其在我國,對遺傳病高危群體進行孕期產前基因診斷,對于提高人口素質,落實優生的基本國策具有重要的現實意義。攜帶者的檢出最為重要。

遺傳病臨床基因診斷的分類1.臨癥診斷:直接對特定遺傳病患者的致病基因進行檢測,判斷被檢基因是否存在異常。如地中海貧血患者的基因診斷。2.癥狀前診斷:由于并不是所有的遺傳病患者出生時即有相關臨床表現,這是針對某些遲發性遺傳病家系高危個體進行的一種基因診斷。這在動態突變類遺傳病中應用最廣泛,如遺傳性小腦脊髓性共濟失調。3.產前診斷:是預防遺傳病患兒出生最有效的方法。由于大多數遺傳病在出生前均無特異性的臨床表現,生化檢查又難以進行,因此通過獲得胎兒細胞中的遺傳物質進行產前基因診斷是目前唯一可行的辦法。如進行性肌營養不良癥。基因診斷在遺傳病中的發展傳統的疾病診斷曾歷經過三個階段:一是臨床學診斷,二是血清學診斷,三是生物化學診斷。而這些診斷都是以疾病的表型改變為依據的。隨著分子生物學技術的發展及其在疾病研究中的廣泛應用,特別是在遺傳病的研究中的應用,又興起了第四代診斷技術—基因診斷技術。基因診斷在遺傳病中的發展遺傳病是指遺傳物質發生突變所引起的疾病。可分為三大類:單基因病多基因病染色體病基因診斷在遺傳病中的發展基因診斷是以DNA和RNA為診斷材料,應用分子生物學技術,通過檢查基因的結構及其表達功能來診斷疾病的方法和過程。基因突變的類型片段性突變(大片段缺失、插入或倒位)染色體片段如染色體病整個基因數個外顯子倒位點突變單核苷酸取代少數核苷酸缺失或插入動態突變多態性三核苷酸重復序列的擴增基因診斷的途徑如果某種遺傳病是由于基因缺失造成的,可通過檢測受檢者是否缺失該基因來直接判斷其基因型。如果致病突變或病因還不清楚,但有與其緊密連鎖的多態性位點,通過該位點狀態的連鎖分析進行檢測。不同類型的突變有不同的診斷途徑:1.突變已知時用直接檢測法—突變檢測2.突變未知或突變已知但突變類型較多時用間接診斷法—多態性連鎖分析基因診斷的途徑一、直接檢測法是指直接檢測基因的致病突變,因此其前提是被檢致病基因的正常序列和結構已被闡明。基因診斷的途徑二、多態性連鎖分析連鎖是指同一條染色體上和致病基因相鄰近的基因一起被遺傳,可以作為遺傳標記,這樣只要鑒定標記的存在,就可以判斷受檢者是否帶有致病基因。

基因診斷的途徑典型的連鎖分析包括以下程序:確定分析方法首選PCR方法,檢測RFLP和缺失的Southern印跡方法已被PCR產物的酶切法或多重PCR取代。選擇合適的多態性標記位點多態性分析多家系核心成員(父母及先癥者)及待測個體進行多態性分析,確定標記位點的基因型分析、判斷并解釋得到的結果分析、判斷并解釋多得到的結果

首先根據孟德爾定律遺傳模式,通過核心家系成員的多態性資料,確定父源或母源等位基因的標記,即確定致病基因與標記點等位片段的連鎖相,然后根據待測個體獲得的父源或及母源標記等位基因確定其是否攜帶致病基因。進行間接診斷必備的先決條件家系中的關鍵成員(父母)為標記位點雜合子,這樣才能區分兩條同源染色體。子代中存在患病的純合子,這樣才能確定致病基因與哪條染色體的標記位點共同遺傳。任何一種遺傳病,單獨使用一種多態性位點,均有相當一部分父母的染色體無法區別。需要聯合使用多種標記位點,以提高診斷率。受檢的親代必須為生物意義上的親代。基因突變的檢測技術點突變的檢測片段性突變的檢測動態突變的檢測點突變的檢測已知點突變的檢測與PCR相關的技術以核苷酸探針雜交為基礎的技術以核苷酸探針雜交為基礎的技術

等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO雜交)DNA芯片技術點突變檢測未知點突變的篩選方法變性梯度凝膠電泳(DGGE)單鏈構象多態性(SSCP)雙脫氧指紋分析(ddF)異源雙鏈體分析(HA)化學切割法(CCA)酶促錯配切割(EMC)蛋白截短測試(PTT)變性高效液相色譜分析(DHPLC)DNA序列測定片段性突變檢測Southern印跡雜交多重PCR動態突變的檢測動態基因的致病等位基因的片段擴展較大,可以用PCR方法進行檢測,但這些三核苷酸序列富含CG,擴增條件與常規PCR不同,需要添加7-deazadGTP或DMSO,并須適當提高復性溫度。有些動態突變的異常基因其長度已經超過PCR最佳擴增長度,信號顯示很弱,需要PCR產物電泳后,用重復單元的多聚體為探針進

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