1/1NBD多肽治療實驗性潰瘍性結腸炎的實驗研究NBD多肽治療實驗性潰瘍性結腸炎的實驗研究作者：

楊劍,崔淑蘭,龍友明,陳墾,王暉,王念林,謝文瑞,劉君君【摘要】目的觀察核因子B必需分子(NFBessentialmodulator，NEMO)結合的小分子多肽(micromoleculepolypeptidecombiningwithNEMObindingdomain，NBD多肽)對實驗性大鼠潰瘍性結腸炎的治療作用。

方法60只SD大鼠隨機分成治療組、對照組各30只，采用三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸法制作潰瘍性結腸炎大鼠模型，治療組予腹腔注射1.3mg/100g體質量的NBD多肽，對照組予等量生理鹽水，評估炎癥活動指數（IAI），給藥后7d處死相應組的動物取結腸，肉眼觀察結腸黏膜病變且按損傷情況積分，行病理切片、蘇木素伊紅(hematoxylineosin，HE)染色，光鏡下評估組織損傷；取病變結腸組織切片行免疫組化檢測核因子B(NFB)表達，檢測髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)。

結果治療組大體形態損傷、組織學損傷評分、IAI評分分別為2.410.43、4.800.82、6.020.59，明顯低于對照組(3.500.51、6.901.13、3.050.51)(P0.05)；治療組MDA、MPO及NFB表達均低于對照組(P0.05)。

結論NBD多肽對于潰瘍性結腸炎大鼠模型有較好的治療作用，其作用與其抑制NFB表達有關。

【關鍵詞】NBD多肽潰瘍性結腸炎動物模型NFB免疫組化Abstract:ObjectiveToobservetheTimeactivitycurveofthetherapeuticeffectofmicromoleculepolypeptidecombiningwithNEMObindingdomainonexperimentalulcerativecolitisrat.MethodssixtySDratswererandomlydividedintotreatedandcontrolgroup.Ulcerativecolitisratmodelwasinducedbyenteroclysiswithtrinitrobenzenesulfonicacid(TNBS)，micromoleculepolypeptidecombiningwithNEMObindingdomainwereadministeredbyintraperitonealintreatedgroup，andejustdosesliquornatriichloridiisotonicuswereadministeredlikelyincontrolgroup.IAIscorewereevaluated.assay．Thentheratswerekilledaccordingtogroupsin7daysafterthatthemodelwasmadefortheobservationofthecolonicpathologicchangesbynakedeyeandfortheestimationofthedamagescoresofcolonmucosa.Finally，thecolontissuewasfixedtomakepathologicalsectionandthedamagescoreoftissuewasobservedundermicroscope.AndthendamagedcolontissuespathologicalsectiontestexpressionofNFBbyimmunizinghistochemistry.ThenthevalueofMDA、MPOinsupernatantofsamplessdamagedcolontissuesdivideevenlyanoarweretestedaccordingtotheinstructionofthecorrespkit.Resultthetreatedgroupsbrieflyformdamagescores、damagescoresoftissue、IAIscoreare2.410.43、4.80.82、6.20.59，andtheyallarelowerthanthatofthecontrolgroup(3.50.51、6.91.13、3.050.51)(P0.05).AndthevalueofthethetreatedgroupsMPO、MDA、NFBarelowerthanthatofthecontrolgroup(P0.05).ConclusionmicromoleculepolypeptidecombiningwithNEMObindingdomainhasprotectiveeffectagainstratulcerativecolitis，anditsmechanismrelatwiththeinhibitjionofnuclearfactorB.Keywords:NFBessentialmodulatorbindingdomain(NBD)peptide;ulcerativecolitis;animalmodel;NFB;immunohistochemistry潰瘍性結腸炎(UC)即慢性非特異性潰瘍性結腸炎，是一種病因尚未完全明確的直腸和結腸的慢性炎癥性疾病，病程遷延，有癌變趨勢，近年來患病率呈上升趨勢。

目前研究發現核轉錄因子B（nuclearfactorB，NFB）參與了炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)的發病機制和病理生理過程，并在IBD發病過程中起著核心作用，是IBD炎癥級聯放大效應及瀑布樣效應的開關［1］。

目前治療本病的藥物主要為氨基水楊酸類、腎上腺皮質激素類、免疫調節劑等，取得了一定的治療效果，但毒副作用較大。

NBD多肽可以選擇性抑制NFB基因的表達，抑制促炎癥基因的表達，抑制自身炎癥反應，有很好的應用前景，而目前國內、外尚未有應用NBD治療實驗性IBD的研究，故利用TNBS誘導的大鼠UC模型進行了NBD多肽治療的實驗研究。

1材料與方法1.1材料1.1.1動物SD大鼠60只，SPF級，雄性，體質量180～220g，由廣東醫學院實驗動物中心提供，合格證號：

粵監證字2005A010。

1.1.2藥物NBD多肽，美國Sigma公司生產。

1.1.3試劑三硝基苯磺酸(TNBS)：

美國Sigma公司生產，批號：

P2297；髓過氧化物酶（MPO）測試盒及丙二醛(MDA)測試盒，南京建成生物工程研究所，批號均為040722；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號20060814。

兔抗NFB多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司提供。

SP試劑盒和二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)試劑盒均購自上海西唐生物工程有限公司；無水乙醇、乙醚甲醛均為分析純。

1.2實驗方法1.2.1結腸炎動物模型的制備大鼠在試驗前1d禁食，用10%（）氨基甲酸乙酯(烏拉坦)0.1mL/kg腹腔注射麻醉。

將2，4，6TNBS溶于50%乙醇（）中至終濃度為100g/L，取聚丙烯導尿管1根，術前用液狀石蠟潤滑后，從大鼠肛門中插入深度約8cm達結腸部位，緩慢灌注TNBS/乙醇溶液，每只大鼠約0.3mL，制成大鼠潰瘍性結腸炎模型。

1.2.2動物分組與給藥方法60只雄性大鼠隨機分成治療組和對照組，每組各30只。

治療組在造模前給予腹腔注射1.3mg/100g體質量的NBD多肽1次，對照組在造模前給予腹腔注射1.3mL/100g體質量的蒸餾水1次，待大鼠清醒后給予正常飲食，于造模后7d處死兩組大鼠并取結腸標本及血標本。

1.2.3結腸炎癥的評價在各時間點進行IAI評分，而后處死大鼠取病變結腸進行大體形態損傷、組織學損傷評分、病理切片+HE染色及MPO、MDA活性測定。

感染活動指數（inflamationactiveindex，IAI）評分，IAI=(體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3；正常大便成干而小粒狀，半稀便為糊狀但不粘肛門，稀便為液狀而且粘肛門；大體形態損傷按Luk等［2］的標準；組織學損傷按韓英等［3］的標準；常規病理切片+HE染色；MPO、MPA活性測定按試劑盒說明書盤(南京建成生物工程程公司)說明書操作。

1.2.4NFkB表達的檢測及評分用免疫組化SP法檢測，取結腸病變部位組織，甲醛溶液固定后石蠟包埋，組織切片脫蠟；將玻片置檸檬酸緩沖液中用醫用微波爐進行抗原修復，水洗；滴加30mL/L的H2O2室溫10min阻斷內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline，PBS)沖洗；正常血清在室溫下封閉15min，清除多余血清；滴加兔抗NFBP65多克隆抗體37℃孵育1h，PBS液沖洗；滴加生物素化的兔抗羊Ig抗體室溫孵育15min，PBS液沖洗：

滴加過氧化物酶標記的鏈霉親和素室溫孵育15min，PBS液沖洗；DAB顯色2～5min，蘇木素復染后，封片觀察。

PBS代替一抗作為空白對照，細胞染成黃色者為陽性，定位于細胞質和(或)細胞核。

每張片隨機選取10個高倍視野(400)，用美國NikonSpot圖像采集處理系統采圖后，采用ImageProPlus5.0專業圖像分析軟件進行圖像分析，計算陽性細胞百分率（%）和平均吸光度（A）。

1.3統計處理采用SPSS15.0軟件進行統計學分析，實驗數據以s表示，采用t檢驗，P0.05為差異有顯著性。

2結果2.1兩組大鼠大體形態與組織損傷TNBS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型病變主要在近肛門段結腸及降結腸，對照組大鼠可見結腸黏膜充血水腫、糜爛及潰瘍形成，部分腸段腸壁增厚，且病變呈現連續分布；將病變組織切片經HE染色后，鏡下可見結腸黏膜潰瘍及偽膜形成，隱窩和黏蛋白減少或消失，淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，部分小鼠腸段還有纖維化形成，浸潤深度可達固有層或以下，而治療組病變則主要在黏膜層，病變明顯較輕。

兩組評分比較差異有顯著性(P0.01)，提示NBD多肽對TNBS誘導的結腸炎癥具有治療作用，見表1、圖1。

2.2兩組大鼠炎癥活動指數(IAI)兩組大鼠在灌腸蘇醒后均逐漸出現懶動、拱背、厭食、體質量下降、大便次數增多，主要為稀便和膿血便，但治療組癥狀明顯輕于對照組，差異有顯著性(P0.01)，說明NBD多肽對TNBS誘導的結腸炎癥具有治療作用。

見表1。

2.3兩組大鼠MPO、MDA活性測定經NBD多肽處理的大鼠MPO、MDA活性明顯下降，說明NBD多肽對潰瘍性結腸炎局部組織細胞內的過氧化狀態有抑制作用，減少氧化應激，對結腸炎癥進展有抑制作用，見表1。

2.4兩組大鼠NFB的表達其主要表達于表皮、隱窩上皮細胞和巨噬細胞等。

治療組胞質中多呈棕黃色而胞核中為淡黃色，對照組胞質多為深棕黃色，陽性細胞百分率（%）和A值明顯降低，兩組比較差異有顯著性(P0.01)，說明對照組的NFB表達較為活躍，前炎癥介質生成活躍，炎癥比較嚴重。

見表1、圖2。

表1兩組各項指標評分結果（略）Table1Scoresofeveryindexoftwogroups與對照組比較：

*P0.01圖2免疫組化結果(SPXXXX年首次從B細胞核提取物中發現的一種能與免疫球蛋白k輕鏈基因的增強子B序列特異結合的蛋白因子。

現證實其廣泛存在于真核細胞內，能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發生特異性結合而促進轉錄和表達，與炎癥反應、免疫應答以及細胞的增生、轉化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關。

NFB是重要的促炎轉錄因子，正常情況下以非活性態存在于胞漿中，在TNF等胞內外因子作用下使IB激酶催化對IB磷酸化，NFB產生核易位而激活，并進入細胞核內，結合于基因啟動子5區含有B結合位點的TNF、IL2、IL6、IL8、TNFB、粒巨噬集落刺激因子、B整合素、黏附分子等炎性因子的基因位點上，促進相應的基因表達、細胞因子釋放；釋放的細胞因子又可以反過來進一步活化NFB［5，7］，形成正反饋調節，導致炎癥反應失控，引起組織損傷［8］；抑制NFB的表達可以減輕炎癥，打斷這種正反饋過程。

但體內其他正常生理活動必需的細胞因子的轉錄也需要NFB的活化，盲目地阻斷NFB的功能可干擾體內正常的生理過程，非特異性的NFB抑制劑會產生嚴重副作用。

NFB的激活所需要的IKK復合物中，IK和IK有相似的結構與較高的同源性，C端調節酶活性的螺旋環螺旋結構域(helixloophelix，HLH)結構可使激酶發揮高效活性，但必須在其中的6個氨基酸的區域(NEMObindingdomain，NBD)與2種調節亞基IK(也稱NEMO，NFBessentialmodulator，NFB必需調節物或IKAP，IKassociatedprotEin，IK連接蛋白)結合方能發揮作用。

據此設計合成的只有6個氨基酸的長度(H2NLeuAspTrpSerTrpLeuCOOH)的NEMO結合的NBD多肽，可以選擇性阻斷兩者的結合，阻斷干擾IKK、IKK與NEMO的相互作用，選擇性抑制NFB活性，抑制促炎癥基因的表達，從而改善IBD病情。

而且由于其作用具有選擇性，不至于影響NFB的所有功能，并避免完全抑制NFB的活性的毒副反應，且還具有分子結構小、活性極高、免疫原性低，進入細胞后不易被降解、設計、合成簡便等優點，在具有良好的穿透性的透細胞性多肽載體幫助下可以順利地進入細胞內發揮作用。

本實驗中治療組的NFB表達較對照組明顯下降，證實了NBD多肽能抑制NFB的表達。

治療組的組織損傷、組織學評分均較對照組明顯減輕，作為反映臨床癥狀的IAI評分也是如此，與NFB的變化規律相同。

MPO、MDA作為反映組織氧化還原狀態和氧化應激情況的指標，治療組明顯低于對照組，說明組織內過氧化壓力減輕，氧自由基生成和造成的損傷降低，推測與NFB表達受到抑制后炎癥介質產生減少有關。

總之，NBD多肽對于潰瘍性結腸炎有較好的療效，有必要進行更大規模的實驗來進一步證實。

【參考文獻】［1］龍友明,陳墾.核因子B與炎癥性腸病［J］.胃腸病學和肝病學雜志,2003,12(4):394397.［2］LUKHH,KOJK,FUNGHS,etal.Delineationoftheprotectiveactionofzincsulfateonulcerativecolitisinrats［J］.EuropeanJPharmacol,2002,443(1-3):197-204.［3］韓英,村田有志,伊東重毫,等.長期應用尼古丁對噁唑酮誘導的實驗性小鼠腸炎模型的影響及其機制探討［J］.中華消化雜志,2001,21(8):473-476.［4］PAPPM,NORMANGL,ALTORJAYI,et