65.020.30CCS

B

4415 DB15/T

3551—2024呼倫貝爾羊種質資源冷凍保存技術規程Technical

code

of

resources

sheep2024-07-15

發布2024-08-15

實施內蒙古自治區市場監督管理局 發

布DB15/T

3551—2024 本文件按照GB/T

1.1—2020《標準化工作導則

第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件由內蒙古自治區畜牧業標準化技術委員會（SAM/TC

19）歸口。學院、中國科學院西北高原生物研究所、赤峰學院。畢江華。DB15/T

3551—20241范圍技術要點。本文件適用于呼倫貝爾羊精液、卵母細胞和胚胎的冷凍保存。2規范性引用文件文件。GB/T

26613 呼倫貝爾羊NY/T

1674牛羊胚胎質量檢測技術規程DB15/T

1769 綿羊冷凍精液DB15/T

3401 奶綿羊胚胎冷凍解凍技術規程3 術語和定義GB/T

26613界定的以及下列術語和定義適用于本文件。開放式拉長細管 open

straw卵母細胞和胚胎玻璃化冷凍保存的容器。胚胎保存液 用于胚胎體外發育的一種商品化溶液。4縮略語下列縮略語適用于本文件。BSA：牛血清白蛋白（

Serum

）COCs：卵丘卵母細胞復合體（Cumulus-Oocyte

Complexes）DMSO：二甲基亞砜（Dimethyl

Sulfoxide）EG：乙二醇（Ethylene

）FBSFetal

Serum）OPS：開放式拉長細管（

Pulled

Straw）精子活力≥70%、密度≥×10

個、畸形率≤，顏色為乳白色。I液稀釋至2×

個/精子活力≥70%、密度≥×10

個、畸形率≤，顏色為乳白色。I液稀釋至2×

個/4

℃冰箱平衡2

hII液稀釋至1×10

個/毫升，再平衡

h。PBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphate

Buffered

Solution）TS：玻璃化解凍液（

Solution）VS：玻璃化冷凍液（Vitrified

Solution）5 精液冷凍保存冷凍稀釋液配制按照附錄A中表規定的配方配制。標記按照DB15/T

1769的規定執行。精液要求9精液處理原精液用5倍，緩慢攪拌，孵育5

min，以

rpm離心

，移除上清液。稀釋和平衡88裝管在4

℃條件下，將精液分裝到0.25

細管中，另一端封口。冷凍5.7.1 程序化冷凍利用程序冷凍儀，在4

-35

℃溫區，設置6

℃/min的降溫速率；在

-100

℃的溫區，設置20

℃/min的降溫速率，然后投入液氮。5.7.2 熏蒸冷凍將液氮倒入深度50

cm以上的泡沫箱預冷10

，細管鋪放在支架后放入泡沫箱，支架平面距離液氮面4

cm，熏蒸7

，然后投入液氮。貯存凍精細管以2550支包裝單位投入液氮罐。解凍取出凍精細管，室溫空氣浴5

s，然后放置于

℃水浴10

s取出，無菌紙巾擦干備用。6 卵母細胞冷凍保存DB15/T

3551—2024冷凍方法OPS卵母細胞選擇挑選至少有3層卵丘顆粒細胞的COCs

h0.1%（卵丘顆粒細胞，挑選胞質均勻、折光性好、排出第一極體的裸卵。試劑與溶液按照附錄A中表規定的配方配制。冷凍6.4.1 OPS

將0.25

mL細管加熱變軟后拉成為管壁內徑為

mm，管壁厚0.02

mm的管，冷卻后用手術刀片在其細端切開，細端長度約2

cm。6.4.2凍前準備玻璃化冷凍液及使用器材在室溫25

℃至少預熱30

，在培養皿中制作100μL～200

μL的VS1和VS215

期等，放入保溫杯中，用于OPS的收集。6.4.3 冷凍將卵母細胞在液中平衡30

s，再移入液中平衡不超過25

s，將多枚卵母細胞及少量VS2吸入OPS中，投入液氮保存。解凍6.5.1 準備解凍液及使用器材在室溫

℃至少預熱30

min2

ml的皿中分別制作

μL

、TS2、TS3解凍液微滴，置于37

℃恒溫臺上，至少預熱10

min。6.5.2 解凍取出微滴孵育1

min，然后移入微滴孵育5

TS3微滴孵育5

3～5化碳培養箱中復蘇

h～2

h，備用。7 胚胎冷凍保存冷凍方法程序冷凍儀法。胚胎選擇選擇1、2級桑葚胚至擴張囊胚，胚胎質量鑒定按照NY/T

1674的規定執行。DB15/T

3551—2024溶液配置按照附錄A中表規定的配方配制。標記按照DB15/T

3401的規定執行。胚胎回收回收到裝有胚胎保存液并編號的平皿中。洗滌胚胎在胚胎保存液滴中洗4次，放入做好標記的平皿中，30

min內必須開始冷凍。平衡胚胎在S1和S2液中平衡5

，在1.5M乙二醇中平衡

min。冷凍按照DB15/T

3401的規定執行。貯存將細管裝入相應的拇指管內，放入液氮罐中保存。解凍胚胎細管從液氮中取出，空氣浴2

s～3

s后，放入

℃水浴

s。把胚胎放入T液中平衡5

min，然后把胚胎移入胚胎保存液平衡5

，并洗3次，備用。mPBSDPBS100

0.1

FS0.3

g/mlVS17.5%

v/v7.5%v/vv/vmPBSVS215%v/vv/vv/vmPBSTS10.34

g/mlmPBSTS20.17

g/mlmPBSTS30.085

5%v/vmPBSS1液（

1.5M

S2液（

1.5M

S3液（

1.5

0.17

g/ml80

2.0

10II45

DB15/T

3551—2024

附 錄A（資料性）種質資源冷凍保存溶液配方A.