備案號(hào)：35806-2013DB22DB22/T1673—2012萊姆病螺旋體的檢測(cè)熒光PCR法DetectionofBorreliaburgdorfe——FluorescencePCR2012–12–17發(fā)布2013–01–01實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)PCR:聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraDNA:脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicaciFAM:6-羧基-熒光素（一種熒光報(bào)告基團(tuán)6-carboxy-fluorescein）CTAB:十六烷基三乙基溴化銨（HexadecyltrimethylTm值:核酸融解溫度（Meltingtempret最后通過(guò)熒光信號(hào)的增幅情況來(lái)判定反應(yīng)結(jié)果。PCR反應(yīng)體系中加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一條特異性熒累熒光。MGB探針（Minorgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate,MGB-ODN)，5′端標(biāo)記FAMtripetide,DPI3)，可以穩(wěn)定探針與模板的雜交,升高探針Tm值,使較短的探針同樣能達(dá)到較高的Tm2探針：6-FAM-TTCGGTACTAACTTTTAGTTAA-MGBN陽(yáng)性對(duì)照：萊姆病螺旋體標(biāo)準(zhǔn)株ATCC36.7低溫冰箱（-80℃)、冷藏冷凍冰箱（2℃~8℃和-20℃)。樣品如不能立即用于抽提DNA,可置于4℃保存,但不要超過(guò)2個(gè)月,欲長(zhǎng)期儲(chǔ)存,分3在上述樣品沉淀中加入560μLTE緩沖液，反復(fù)吹打使之重懸），溶液，混勻，65℃溫育10min；加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，12000r/min離心5min，將上清轉(zhuǎn)入一新離心管中；加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，10000r/min離心15min,去上清；75%乙醇洗一次，去上清，干燥，加入50μL的TE緩沖液溶解DNA備用（如不能及時(shí)檢驗(yàn)，可將上反應(yīng)體系總體積為25μL，其中含：TaqManM不同儀器、不同TaqDNA聚合酶可根據(jù)9.2.1檢驗(yàn)過(guò)程中分別設(shè)空白對(duì)照、無(wú)Ct值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，報(bào)告萊姆病螺旋體核酸檢Ct值小于或等于35.0時(shí)，報(bào)告萊姆病螺旋體核酸檢測(cè)結(jié)4檢驗(yàn)樣本Ct值大于35.0且小于40.0時(shí)，建議重復(fù)檢測(cè)一次，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯5在900ml水中溶解100g電泳級(jí)SDS，加熱至68℃助溶，將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K完全溶解量取1mol/LTris-HCl(pH8.0)25mL,0.5mol/LEDTA(pH