關于蛋白質的研究方法與原理第一節概述第2頁,共121頁，星期六，2024年，5月

蛋白質的分離純化包括以下過程：1.破碎生物組織，并用適當的緩沖液將蛋白質抽提出來；2.將有關的蛋白質分級沉淀下來;

（鹽析法或有機溶劑法）3.應用層析法或電泳法使它們各自分開；4.蛋白質結晶；5.蛋白質純度鑒定和含量測定。直接從生物組織中提純蛋白——第3頁,共121頁，星期六，2024年，5月

制備過程中注意事項：要求自始至終保持在天然狀態避免一切過激因素--如過酸或過堿，高溫，重金屬等的影響。2.通常都在低溫條件下操作。3.盡可能使樣品中蛋白質的濃度維持在較高水平。第4頁,共121頁，星期六，2024年，5月第二節蛋白質的分離與純化技術第5頁,共121頁，星期六，2024年，5月一、蛋白質沉淀與結晶第6頁,共121頁，星期六，2024年，5月

（一）鹽析法

概念：將中性鹽加入蛋白質溶液，破壞水化膜和電荷而使蛋白質沉淀，叫鹽析。各種蛋白質鹽析所需的鹽濃度及PH不同，加入不同濃度的中性鹽可使各種蛋白質依次分別沉淀出來。

優點：操作簡便對易變性的蛋白質有一定的保護作用，適用范圍十分廣泛。缺點：分辨能力差，純化倍數低第7頁,共121頁，星期六，2024年，5月（1）鹽的種類對同一種Pr而言，價數愈高的鹽離子，鹽析能力也愈強:

PO3-4＞SO42-＞C2O42-＞（CHOHCOO-）2＞

AC－＞CL－＞NO3-＞Br-＞I-＞CNS-K+＞Rb+＞Na+＞Cs+＞Li+＞NH4+常用的中性鹽有如硫酸鹽、磷酸鹽等。第8頁,共121頁，星期六，2024年，5月硫酸銨（常用鹽析劑）

優點：鹽析能力較強具有較高的溶解度較低的溶解度溫度系數價格低廉不產生副作用。

缺點：緩沖能力較差

PH難控制第9頁,共121頁，星期六，2024年，5月（2）PH和溫度S。代表蛋白質在無機鹽溶液中的溶解度

除取決于Pr的種類，還受PH及溫度影響:PH=PI時，S。的數值極小

S。隨溫度增加而減低。鹽析過程中，若增高溫度，有助于Pr的析出。第10頁,共121頁，星期六，2024年，5月（3）蛋白質濃度

[Pr]較高，在較低無機鹽濃度時,蛋白質便開始析出，鹽析界限比較寬。

[Pr]較低，需要無機鹽的濃度也高，即鹽析界限變窄。第11頁,共121頁，星期六，2024年，5月1.基本原理（1）在PI附近，Pr主要以中性離子形式存在。此時若添加有機溶劑，由于有機溶劑可使溶液電離常數減小，增強了中性離子間靜電引力，從而使分集合而沉淀出來。（2）有機溶劑本身的水合作用會破壞Pr表面的水合層，也促使Pr變得不穩定而聚集析出.常用的有機溶劑：乙醇和丙酮

（二）有機溶劑沉淀法

分辨力比鹽析方法高，提純效果好

第12頁,共121頁，星期六，2024年，5月（三）選擇性沉淀法

選擇一定的條件使其它蛋白質變性沉淀而不影響目標蛋白質的分離方法。例如，將提取液加熱至一定溫度并維持一段時間，是某些不耐熱的蛋白質變性沉淀等。應用選擇星辰殿，徐實現對系統中需除去的及欲提純的蛋白質的理化性質均有較全面的了解。第13頁,共121頁，星期六，2024年，5月（四）蛋白質結晶

蛋白質結晶即是溶液中的蛋白質由隨機狀態轉變為有規則排列狀態的固體，常用語分析研究其結構。蛋白質結晶是一個有序化過程，當蛋白質溶液達到過飽和狀態，能夠形成一定大小的晶核，溶液中的分子失去自由運動的能量，不斷地結合到形成的晶核上，長成適合于X線衍射分析的晶體。第14頁,共121頁，星期六，2024年，5月二、離心技術分離蛋白質

離心技術是利用物體告訴旋轉時產生強大的離心力，使置于旋轉體中的懸浮顆粒發生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達到濃縮或與其它顆粒分離之目的。第15頁,共121頁，星期六，2024年，5月三、層析技術分離純化蛋白質最基本的特征：固定相流動相層析技術（chromatography）又稱色譜技術，是利用不同物質理化性質的差異而建立起來的技術。

各種物質得以分離的最基本原因：就在于它們在這兩個相之間具有不同的分配系數.兩相作相對運動時，這些物質在兩相間進行多次的分配，即使它們的分配系數只有微小的差異，通過這個過程也能得到最大的分離效果。第16頁,共121頁，星期六，2024年，5月

氣相層析按兩相狀態來分液相層析

吸附層析

分配層析離子交換層析按層析機理來分

凝膠排阻層析

親和層析

柱層析按操作方式來分薄層層析

紙層析層析技術的種類第17頁,共121頁，星期六，2024年，5月

（一）凝膠過濾層析又稱分子篩或凝膠過濾（gelfiltration）原理：載體為有一定孔徑的多孔性親水性凝膠。當分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時，直徑大于孔徑的分子將不能進入凝膠內部，便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。較小的分子進入能容納它的孔穴，繞道而行，在柱內保留時間就比較長。這樣，較大的分子被先洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而達到相互分離的目的。第18頁,共121頁，星期六，2024年，5月第19頁,共121頁，星期六，2024年，5月

離子交換層析法*原理：陰（陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相）填充在層析柱內，由于陰（陽）離子交換樹脂顆粒上帶正（負）電荷，能吸引溶液中的

陰（陽）離子。然后再用含陰（陽）離子的溶液洗柱。含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來，增加陰離子濃度，含負電量多的蛋白質也被洗脫下來，于是兩種蛋白質被分開。第20頁,共121頁，星期六，2024年，5月第21頁,共121頁，星期六，2024年，5月

親和層析法原理：利用生物高分子具有能和某些相對應的專一分子可逆結合的特性。

如，酶的活性部位能和底物\抑制劑\輔助因子專一性地結合,改變條件又能使這種結合解除.[酶的變構中心與變構因子（或稱效應物）之間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結合蛋白與結合物之間]。這些被作用的對象物質稱之為配基（ligand)。第22頁,共121頁，星期六，2024年，5月

高效液相層析法（HighPerformanceLiquidChromatography

，HPLC）

又稱“高壓液相色譜，是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。

第23頁,共121頁，星期六，2024年，5月四、電泳技術分離蛋白質電泳（electrophoresis）是指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷相反方向電極移動的現象。第24頁,共121頁，星期六，2024年，5月

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS–(十二烷基硫酸鈉)是陰離子型去污劑(Sodiumdodecylsulfate,SDS)Qu=

（遷移率）6πrηu與Q、r有關

若蛋白質分子帶有足夠的電荷，在SDS中進行電泳，由于分子篩效應，

u僅取決于分子的大小。因此SDS一凝膠電泳可以按蛋白質分子大小的不同將其分開。這時，若以分子量的對數（logM）對相對于染料前沿的遷移率（Rf）作圖，呈現線性關系。

第25頁,共121頁，星期六，2024年，5月第26頁,共121頁，星期六，2024年，5月

這種關系，對一種膠濃度時，只適用于一定的分子量范圍：

5％膠濃度時，適用于分子量6～200萬的區間；

10％膠濃度時，適用于分子量1.6～7萬的區間；

15％膠濃度時，適用于分子量1.2～4.5萬的區間。

第27頁,共121頁，星期六，2024年，5月聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜第28頁,共121頁，星期六，2024年，5月

等電聚焦電泳——（isoelectricfocusing,IEF）

是一種根據樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術。利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質）在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）內制造一個pH梯度。

pH梯度制作利用的兩性電解質（ampholyte，商品名為ampholine），是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度。

凝膠可用：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等

第29頁,共121頁，星期六，2024年，5月

Pr分子有一定的PI，它處在一個由陽極到陰極梯度逐漸增加的介質中，并通過以直流電時，它便“聚焦”在與其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白質泳動后形成位置不同的區帶而得到分離。第30頁,共121頁，星期六，2024年，5月優點：1.有很高的分辨率；2.可以區分等電點只有0.01pH單位差異的蛋白質；3.根據其所在位置還能夠測定蛋白質的分子量；4.對很稀的樣品，最后達到高度的濃縮。第31頁,共121頁，星期六，2024年，5月雙向電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis）

第一向采用聚丙烯酸胺凝膠等電聚焦電泳--PI第二向采用SDS一凝膠電泳--分子量由于結合了蛋白質的等電點和分子量兩種完全不同的特一性來進行分離，因此具有非常高的分辨率可同時分析幾千上萬個蛋白，分辨率高，分離度好。是蛋白質組學研究的核心技術。第32頁,共121頁，星期六，2024年，5月雙向PAGE第33頁,共121頁，星期六，2024年，5月具有以下特征的蛋白質在二維電泳中還很難被檢測到：①等電點（pl)值很大或很小的，比如大于8和小于4的那些蛋白質；②分子質量很大的蛋白質，比如大于l00kDa的蛋白質就比實際的少了，而大于150kDa的蛋白質就幾乎完全探測不到了（盡管在一維電泳凝膠上這些大蛋白質都能清楚地被觀察到；③疏水性蛋白質。

雙向電泳技術缺點第34頁,共121頁，星期六，2024年，5月高效毛細管電泳第35頁,共121頁，星期六，2024年，5月1.毛細管區帶電泳（CZE）

毛細管區帶電泳也稱為自由溶液溶液區帶電泳,這種電泳模式的特征是整個系統都用同一種緩沖溶液充滿，帶電粒子的遷移速度依賴物質的荷/質比差異。荷/質比越大，泳動越快。第36頁,共121頁，星期六，2024年，5月2.毛細管凝膠電泳（capillarygelelectrophoresis，CGE）

將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。第37頁,共121頁，星期六，2024年，5月3.膠束電動毛細管色譜（Micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC）

緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長；可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍。

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。第38頁,共121頁，星期六，2024年，5月4.毛細管等電聚焦電泳（Capillaryisoelectricfocusing，CIEF）

是根據等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術；CIEF是在毛細管內充有兩性電解質，當施加直流電壓（6～8V）時，管內將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質帶而相互分離；此法可用于測定蛋白質的等電點、純度鑒定、不同變異體的分析等。第39頁,共121頁，星期六，2024年，5月5.毛細管等速電泳（Capillaryisotachophoresis，CITP）

將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。負離子分析時，前導電解質的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。第40頁,共121頁，星期六，2024年，5月6.親和毛細管電泳（affinitycapillaryelectrophoresis,ACE）

是毛細管內壁涂布或在凝膠中加入親和配基，以親和力的不同達到分離目的。第41頁,共121頁，星期六，2024年，5月7.毛細管電動色譜（Capillaryelectrokineticchromatography，CEC）

在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲泵”取代機械泵，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程。第42頁,共121頁，星期六，2024年，5月第三節蛋白質含量的測定方法第43頁,共121頁，星期六，2024年，5月測定蛋白質含量的方法較多基本上都是根據蛋白質的理化性質和生物學活性建立起來的。第44頁,共121頁，星期六，2024年，5月

目前常用的有四種古老的經典方法:定氮法,雙縮脲法(Biuret法)，Folin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法.另外還有一種近十年才普遍使用起來的新測定方法,考馬斯亮藍法(Bradford法).其中Bradford法和Lowry法靈敏度高，比紫外吸收法高10-20倍,比Biuret法高100倍以上.凱氏定氮法比較復雜,但較準確,往往以定氮法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。第45頁,共121頁，星期六，2024年，5月一、凱氏定氮法

凱氏定氮法的原理基于蛋白質的平均含氮量為16%，通過測定樣品中氮元素的量來計算出蛋白質的含量。基本操作過程：①用硫酸對樣品加熱消化，蛋白質被硫酸氧化成CO2和H2O，氮元素被還原成NH3

，并形成(NH4)2SO4

；②加入強堿，使硫酸銨釋放出NH3，并將NH3收集在無機酸液中；③用標準堿溶液滴定，確定NH3量；④根據量確定樣品含氮量，進而求得樣品中的蛋白質含量。第46頁,共121頁，星期六，2024年，5月(1)H2NCH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3(2)2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4(3)(NH4)SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3此法靈敏度低,適用于0.3-3.0μg氮,誤差為2%,最大缺點是受樣品中非蛋白質含氮化合物的影響。測定前需用蛋白質沉淀劑沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。第47頁,共121頁，星期六，2024年，5月優點凱氏定氮法由于具有測定準確度高，可測定各種不同形態樣品等兩大優點，因而被公認為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質含量的標準分析方法。

1、酒精燈2、蒸汽發生器3、長玻璃管4、橡皮管5、小玻杯6、棒狀玻璃塞7、反應室8、反應室外殼9、夾子10、反應室中插管11、冷凝管12、錐形瓶13、石棉網第48頁,共121頁，星期六，2024年，5月二、紫外吸收法

蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，因此，蛋白質具有吸收紫外光的性質，其最大吸收峰位于280nm附近（不同的蛋白質吸收波長略有差別）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質溶液的濃度的關系符合朗伯-比耳定律，因此，可用比色法直接測定蛋白質濃度。第49頁,共121頁，星期六，2024年，5月

在測定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白質的濃度：蛋白質濃度（mg/mL）=1.45×A280nm―0.74×A260nm

上式中的OD280nm是蛋白質溶液在280nm下測得的光密度，OD260nm是蛋白質溶液在260nm下測得的光密度。第50頁,共121頁，星期六，2024年，5月優點：1.快速；2.對蛋白質無破壞性。缺點：1.不是嚴格的定量方法。因為此法是根據酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）殘基的強吸收值來測定的，不同的蛋白質具有不同的消光系數。另外，當蛋白質分子中不含Tyr、Phe或Trp殘基時，該方法就不能檢出蛋白。（此法用于測粗提總蛋白濃度較為適宜）2.核酸可引起強烈干擾。

第51頁,共121頁，星期六，2024年，5月（一）考馬斯亮藍法（Bradford法）

考馬斯亮藍G-250法是比色法與色素法相結合的復合方法。考馬斯亮藍G-250是一種染料，在游離狀態下呈棕紅色，在465nm下有最大吸收峰；當與蛋白質結合后呈青藍色。在一定范圍內，也就是當蛋白質含量在0~1000μg范圍內，蛋白質-色素結合物在595nm下的吸光度與蛋白質含量成正比，所以可用比色法測定。第52頁,共121頁，星期六，2024年，5月

優點是：

（1）靈敏度高：蛋白質－染料復合物具有很高的消光系數，因此蛋白質測定的靈敏度較高，最低檢出量為1ug蛋白質。據估計比Lowry法約高四倍。（2）測定快速、簡便：染料與蛋白質的結合，大約只需2分鐘，結合物的顏色在1小時內是穩定的。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。第53頁,共121頁，星期六，2024年，5月（二）lowry法

在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物

Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質中的Tyr和Phe殘基還原，產生深蘭色的鉬蘭和鎢蘭的混合物。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。在680nm處測定樣品吸光值，確定其蛋白質含量。第54頁,共121頁，星期六，2024年，5月優點：操作簡單、迅速，不需要復雜而昂貴的設備，靈敏度比較高。缺點：Folin-酚試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中的酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法受蛋白質特異性影響，蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸含量不同使得顯色強度也不同，標準曲線也不是嚴格的直線。此方法的初步顯色是雙縮脲反應，因此，凡是干擾雙縮脲反應的基團（因素）都會干擾Folin-酚反應。第55頁,共121頁，星期六，2024年，5月第四節蛋白質結構分析方法第56頁,共121頁，星期六，2024年，5月一、蛋白質的一級結構分析步驟：①分離蛋白質樣品必需純（>97%以上）。②測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。

③巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，產生單一多肽鏈。

④分離純化單一多肽鏈。⑤測定多肽鏈的氨基酸組成。⑥多肽鏈斷裂可采用特異的酶或化學試劑將多肽樣品斷裂成肽碎片，并將其分離開來。⑦對每一肽段進行測序。⑧確定肽段在多肽鏈中的次序。⑨確定蛋白質分子中二硫鍵及酰胺基的位置以及磷酸化、糖基化位點。第57頁,共121頁，星期六，2024年，5月（一）測序前的準備工作1.多肽鏈氨基端和羧基端分析2.多肽鏈氨基酸組成分析3.多肽鏈有限水解為若干個肽段N-端：丹酰氯—丹酰肽層析分離鑒定C-端：肼解法，羧肽酶法高效液相色譜測定氨基酸的種類和含量采用特異性的酶或化學試劑將單一多肽鏈有限水解為具有部分重疊的若干個肽段。第58頁,共121頁，星期六，2024年，5月（二）多肽鏈氨基酸序列測定1.Edman降解法Edman降解法：是肽鏈或蛋白質中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲爾·埃德曼（PehrEdman）首先創立。第59頁,共121頁，星期六，2024年，5月

原理：用異硫氰酸苯酯（PITC）與待分析多肽的N-端氨基在堿性條件下反應，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸處理，關環，肽鏈N-端被選擇性地切斷，得到N-端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接著用有機溶劑將該衍生物萃取出來，酸作用下，該衍生物不穩定，會繼續反應，形成一個穩定的苯基乙內酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽鏈中的酰胺鍵不受影響。通過用HPLC或電泳法分析生成的苯乙內酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鑒定出是哪一個氨基酸。每反應一次，結果是得到一個去掉N-端氨基酸殘基的多肽，剩下的肽鏈可以進入下一個循環，繼續發生降解。第60頁,共121頁，星期六，2024年，5月

優點：

能夠可靠地測定肽鏈的30個左右氨基酸殘基序列，最多可以分析50-60個氨基酸殘基。在最好的條件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少，缺點：由于Edman降解是以化學試劑對N-端氨基的修飾為基礎的，因此當N-端被其他化學基團所封閉時，就需要先去除這些基團，然后才能進行測序。此外，蛋白質中含有半胱氨酸殘基時，有時兩個半胱氨酸殘基會發生二硫鍵交聯。這種情況下，需要先用過酸將二硫鍵氧化為–SO3H，然后才能用Edman降解測定序列。第61頁,共121頁，星期六，2024年，5月2.質譜法質譜技術－－基于串聯質譜技術的氨基酸測序方法是根據質譜技術測定多肽分子質量的極高準確性這一特點而設計的。①先測定某一肽段（如：A-B-C-D-E-F-G--）以及從C-末端或N-末端去除一個殘基的同一肽段（如：B-C-D-E-F-G-）各自的分子質量，二者之差值即為末端殘基（A）的分子質量。②然后與20種標準氨基酸的分子量進行比較就可以確定末端氨基酸的本質了。測定時：第62頁,共121頁，星期六，2024年，5月

實際操作時：從質譜上得到的是一系列的多肽片段，每對大小相近的片段之間僅僅相差一個氨基酸殘基。根據這一分子量差值的大小，較大肽段的末端殘基即可準確判斷。換句話說，從獲得的一系列依次相差一個殘基的肽段的分子質量中我們很快就可以確定最初樣品多肽的末端序列（從N一末端或C一末端開始）。第63頁,共121頁，星期六，2024年，5月二、蛋白質空間結構分析（一）X射線衍射晶體分析法（二）核磁共振法（三）圓二色譜法（四）傅里葉變換紅外光譜法（五）生物信息學預測蛋白質空間結構第64頁,共121頁，星期六，2024年，5月（一）X射線衍射晶體分析法第65頁,共121頁，星期六，2024年，5月X射線本質

X射線是一種短波長(0.005～10nm)、高能量(2.5×105

～1.2×102eV)的電磁波。它是原子內層電子在高速運動電子流沖擊下，產生躍遷而發射的電磁輻射。第66頁,共121頁，星期六，2024年，5月X-射線晶體結構分析基本原理

X射線衍射分析所依賴的基本原理是X射線衍射現象

X射線衍射現象利用X射線的波長和晶體中原子的大小及原子間距同數量級的特性來分析晶體結構。當X射線入射到樣品晶體分子上時，分子上的每個原子使X射線發生散射，這些散射波之間相互疊加形成衍射圖形。衍射圖形能給出樣品內部結構的許多資料，如原子間的距離、鍵角，分子的立體結構、絕對構型、原子和分子的堆積、有序或無序的排列等。

第67頁,共121頁，星期六，2024年，5月（二）核磁共振法1946年美國斯坦福大學的F.Bloch和哈佛大學的E.M.Purcell兩個研究小組首次獨立觀察到核磁共振現象，為此他們兩人獲1952年諾貝爾物理獎。1983年，瑞士科學家KurtWüthrich教授實驗室首次運用核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagon）多肽的溶液構象.發明了利用核磁共振(NMR)技術測定溶液中生物大分子三維結構的方法獲得了2002年度諾貝爾化學獎

第68頁,共121頁，星期六，2024年，5月

NMR基本原理核磁共振(NuclearMagneticResonance)，就是處于某個靜磁場中的自旋核系統受到相應頻率的射頻磁場作用時,共振吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過程。核磁共振波譜是測量原子核對射頻輻射(約4

600MHz)的吸收，這種吸收只有在高磁場中才能產生。

核磁共振波譜儀第69頁,共121頁，星期六，2024年，5月核磁共振法中幾個常用的參數化學位移耦合常數NOE（核歐沃豪斯效應）信號強度譜峰面積弛豫時間第70頁,共121頁，星期六，2024年，5月（1）化學位移

δ值越大，表示屏蔽作用越小，吸收峰出現在低場；δ值越小，表示屏蔽作用越大，吸收峰出現在高場。第71頁,共121頁，星期六，2024年，5月（2）耦合常數核與核之間以價電子為媒介相互耦合引起譜線分裂的現象稱為自旋裂分。由于自旋裂分形成的多重峰中相鄰兩峰之間的距離被稱為自旋－自旋耦合常數,用J表示。耦合常數用來表征兩核之間耦合作用的大小。J耦合常數大小主要與連接兩個核的化學鍵數目有關，與影響標量耦合核之間電子云分布的因素有關。第72頁,共121頁，星期六，2024年，5月

（3）NOE信號強度

當分子內有兩個空間距離小于0.5nm的原子核時，如果用雙共振法照射其中一個核，使干擾場的強度增加到剛使被干擾的譜線達到飽和，則另一個靠近的原子核的共振信號就會增加，這種現象稱核歐沃豪斯效應（NOE）。第73頁,共121頁，星期六，2024年，5月（4）譜峰面積譜峰面積和分子中同一化學環境的原子核數目的多少成正比，因此峰面積的積分值可用來做定量分析的基礎。第74頁,共121頁，星期六，2024年，5月（5）弛豫時間原子核從激化的狀態回復到平衡排列狀態的過程叫弛豫過程。它所需的時間叫弛豫時間。自旋晶格弛豫：處于高能態的氫核，把能量轉給周圍的分子，回到低能態。

自旋-自旋弛豫：兩個進動頻率相同，進動取向不同的磁性核，在一定距離內時，它們相互交換能量，改變進動方向。

第75頁,共121頁，星期六，2024年，5月

二維核磁共振(2DNMR）NMR可獲得分子內各核的化學環境、核間的耦合關系、空間構象等信息，但是當分子較大的時候，由于裂分譜線間的重疊，因此在測定了同一種核的一維譜之后，需要了解兩種或三種不同核之間的聯系關系，如C-H，N-H等就需要用到2DNMR，它是2個頻率變量的函數，吸收峰對2個頻率變量作圖。1H-1HCOSY、

1H-15NHSQC第76頁,共121頁，星期六，2024年，5月核磁共振技術的應用早期核磁共振主要用于對核結構和性質的研究，如測量核磁矩、電四極距、及核自旋等。后來廣泛應用于分子組成和結構分析，生物組織與活體組織分析，病理分析、醫療診斷、產品無損監測等方面第77頁,共121頁，星期六，2024年，5月（三）圓二色譜法圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質結構的一種簡單、快速而又較準確的方法。圓二色譜是利用不對稱分子對左、右圓偏振光吸光率的不同來分析蛋白質的結構。1969年，Greenfield用圓二色光譜數據估計了蛋白質的二級結構。此后，關于利用圓二色譜研究蛋白質空間結構的報道逐漸增多。第78頁,共121頁，星期六，2024年，5月平面偏振光：指振動方向在同一平面內的電磁波。圓偏振光：當兩束振幅相等、互相垂直的偏振光位相相差1/4波長(90°)時，其合成矢量繞光傳播方向旋轉前進，朝著光源方向觀察時，電場矢量E末端軌跡為圓形，所以稱之為圓偏振光。電場矢量方向順時針方向旋轉的稱為右圓偏振光，逆時針方向旋轉的則稱左圓偏振光。橢圓偏振光：振幅不等的左、右圓偏振光合成第79頁,共121頁，星期六，2024年，5月圓二色性和圓二色譜圓二色性：當左、右圓偏振光進入物質時，光學活性物質分子對它們的吸收不一樣，它們的差值就是圓二色性光學活性物質分子對左、右圓偏振光的吸收不一樣，這種吸收差造成矢量振幅差，從介質出來的光成為橢圓偏振光，用橢圓度或吸收差表示圓二色譜：指橢圓度(或比橢圓度等)與波長的關系，它在本質上與旋光色散譜是一樣的。第80頁,共121頁，星期六，2024年，5月圓二色譜的應用在分子生物學中，圓二色儀主要應用于測定生物大分子的空間結構。生物大分子很多是不對稱的，即光學活性分子，通過圓二色譜測定和計算能夠了解生物大分子在溶液狀態下的二級結構。第81頁,共121頁，星期六，2024年，5月蛋白質或多肽是由氨基酸通過肽鍵連接而成的具有特定結構的生物大分子，主要的光學活性生色基團是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵，另外，有的蛋白質輔基對蛋白質的圓二色性有影響。肽鍵的不對稱性使得它總有光活性第82頁,共121頁，星期六，2024年，5月蛋白質的圓二色性主要由活性生色基團及折疊結構兩方面圓二色性的總和。根據電子躍遷能級能量的大小，蛋白質的CD光譜分為三個波長范圍:1）250nm以下的遠紫外光譜區，圓二色性主要由肽鍵的n→π*電子躍遷引起；遠紫外CD主要應用于蛋白質二級結構的解析

2）250～300nm的近紫外光譜區，主要由側鏈芳香基團的π→π*電子躍遷引起；近紫外CD主要揭示蛋白質的三級結構信息

3）300～700nm的紫外-可見光光譜區，主要由蛋白質輔基等外在生色基團引起。紫外-可見光CD主要用于輔基的偶合分析。

第83頁,共121頁，星期六，2024年，5月肽鍵是高度有規律排列的，其排列的方向性決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況。具有不同二級結構的蛋白質或多肽所產生CD譜帶的位置、吸收的強弱都不相同。因此，根據所測得蛋白質或多肽的遠紫外CD譜，能反映出蛋白質或多肽鏈二級結構的信息，從而揭示蛋白質或多肽的二級結構。第84頁,共121頁，星期六，2024年，5月

α-螺旋結構在靠近192nm有一正的譜帶，在222和208nm處表現出兩個負的特征肩峰譜帶；β-折疊的CD光譜在216nm有一負譜帶，在185～200nm有一正譜帶；β-轉角在206nm附近有一正CD譜帶，而左手螺旋P2結構在相應的位置有負的CD譜帶，如上圖和表所示。

-band(nm)+band(nm)α-螺旋222，208192β-折疊216195β-轉角220-230(弱)，180-190（強）205左手螺旋P2結構190210-230（弱）無規則卷曲200212第85頁,共121頁，星期六，2024年，5月第86頁,共121頁，星期六，2024年，5月

CD數據擬合計算蛋白質的二級結構的方法基本原理是假設蛋白質在波長λ處的CD信號θ(λ)是蛋白質中或多肽各種二級結構組分及由芳香基團引起的噪音的線性加，θ(λ)=Σfiθ(λ)i+noise。θ(λ)i是第i個二級結構成分的CD信號值，fi為第i個二級結構成分的含量分數，Σfi規定值為1；通過已知蛋白（或稱參考蛋白）二級結構的圓二色數據庫，曲線擬合未知蛋白或多肽的圓二色數據，估算未知蛋白或多肽的二級結構。第87頁,共121頁，星期六，2024年，5月

蛋白質或多肽的二級結構擬合計算方法中，主要采用多聚氨基酸為參考多肽。Greenfield等采用多聚L-lys作參考多肽，建立α-螺旋、β-折疊及無規卷曲等二級結構參考CD光譜曲線，采用單一波長法（208nm）計算出α-螺旋含量后，然后假設不同的β-折疊含量（Xβ）值，并假設CD值是α-螺旋含量(XH)、β-折疊含量(Xβ)無規卷曲(XR)三者貢獻值的加和，即：

XH+Xβ+XR=1

第88頁,共121頁，星期六，2024年，5月

通過計算得到不同波長的θ(λ)，得出計算曲線。假設一些不同的Xβ值，分別求出它們相應的計算曲線，找出與實驗曲線最接近的曲線，相應于該最接近曲線的Xβ及XR即認為是該蛋白質的相應結構含量。第89頁,共121頁，星期六，2024年，5月Examplefit:myoglobin(肌紅蛋白)Inthiscase:qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith xa=80%, xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coil第90頁,共121頁，星期六，2024年，5月（四）傅里葉變換紅外光譜法傅里葉變換紅外光譜法(Fouriertransforminfraredspectrometer,FTIS)主要是對其紅外光譜中酰胺I譜帶進行分析。酰胺I譜帶為α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲等不同結構振動峰的加和帶，彼此重疊，在1260~1700cm-1范圍內通常為一個不易分辨的寬譜帶。目前常應用去卷積、微分等數學方法，使加合帶中處于不同波數的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲等各個吸收峰得以分辨。最后經譜帶擬合，獲得各個吸收峰的信息。第91頁,共121頁，星期六，2024年，5月（五）生物信息學預測蛋白質空間結構1.同源模建法是預測蛋白質三維結構的主要方法，通過對蛋白質數據庫分析可以得到結論：任何兩種蛋白質，如果兩者的序列同源部分超過30%，則它們具有相似的三維結構，及他們的基本折疊相同，只是在非螺旋和非折疊區域的一些細節部分有所不同。蛋白質的結構比蛋白質的序列更保守，如果兩個蛋白質的氨基酸序列有50%相同，那么約有90%的α碳原子的位置偏差不超過3%。第92頁,共121頁，星期六，2024年，5月主要步驟：①識別模擬的模板；②目標序列和模板序列的排列；③構建模型；④構建非保守的loop區；⑤安裝側鏈；⑥模型修飾；⑦結構合理性評估第93頁,共121頁，星期六，2024年，5月2.折疊識別法也稱穿線法（threading）。通過對已知的蛋白質結構的研究發現，大量序列同源性較差的蛋白質存在相同的折疊結構。折疊識別法就是利用已知蛋白質的折疊子為模板，尋找給定氨基酸序列可能采取的折疊類型，進而進行結構預測。第94頁,共121頁，星期六，2024年，5月主要步驟：①建立模板數據庫；②構造打分函數；③比對；④預測第95頁,共121頁，星期六，2024年，5月3.從頭預測法

蛋白質結構從頭預測是不依賴模板僅從氨基酸序列信息得到天然結構。它的關鍵是正確定義能量函數、精確選用計算機搜索算法來尋找能量最低值。第96頁,共121頁，星期六，2024年，5月第五節蛋白質功能分析方法第97頁,共121頁，星期六，2024年，5月一、酵母雙雜交技術利用雜交基因通過激活報告基因的表達，探測蛋白質-蛋白質的相互作用。

第98頁,共121頁，星期六，2024年，5月第99頁,共121頁，星期六，2024年，5月

酵母雙雜交系統利用雜交基因通過激活報告基因的表達探測蛋白－蛋白的相互作用。主要有二類載體:a含DNA-bindingdomain的載體;b含Transcription-activatingdomain的載體。1）兩種蛋白之間是否有相互作用2）尋找一種蛋白可能的相互作用蛋白應用

第100頁,共121頁，星期六，2024年，5月二、噬菌體展示技術第101頁,共121頁，星期六，2024年，5月第102頁,共121頁，星期六，2024年，5月三、表面等離子共振技術第103頁,共121頁，星期六，2024年，5月四、蛋白質芯片技術第104頁,共121頁，星期六，2024年，5月生物芯片基因芯片蛋白質芯片微流控芯片蛋白質芯片,又稱蛋白質陣列或蛋白質微陣列，是指以蛋白質分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標記了熒光的蛋白質或其他它分子與之作用，洗去未結合的成分，經熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關系。

第105頁,共121頁，星期六，2024年，5月第106頁,共121頁，星期六，2024年，5月（一）蛋白質芯片的分類1.根據應用分類:

①蛋白檢測芯片

將具有高度親和特異性的探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用于識別復雜生物樣品中的目標蛋白/多肽。根據檢測方法,不同蛋白質檢測芯片又可進一步分為正相蛋白質檢測芯片和反相蛋白質檢測芯片。②蛋白功能芯片天然蛋白點加在基片上，了解體系中哪種蛋白能與已知的某種蛋白結合，用于天然蛋白活性及分子親和性研究。第107頁,共121頁，星期六，2024年，5月2.根據載體分類：普通玻璃載體芯片、微孔型芯片、多孔凝膠覆蓋芯片3.由CiphergenBiosystems提出的化學型蛋白質芯片和生物型蛋白質芯片。第108頁,共121頁，星期六，2024年，5月蛋白質芯片的應用臨床檢驗及環境毒物檢測所需的免疫檢測和酶活性分析高通量抗體篩選蛋白質組學研究生物大分子間的相互作用蛋白質和小分子間的相互作用藥物靶標及其作用機理的研究疾病診斷食品中有毒有害物質的分析、在毒理學及衛生檢驗中的應用第109頁,共121頁，星期六，2024年，5月五、免疫印跡技術免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質印跡（Westernblotting），是檢測蛋白質混合物中某種特定蛋白質的定性方法，也可以用于確定同一種蛋白質在不同細胞或同一種細胞不同條件下相對含量的半定量方法。免疫印跡也是利用抗原抗體特異反應的原理。免疫印跡技術（Westernblotting)分三個階段進行。